HPLC法測(cè)定腎茶中3種甲氧基黃酮類活性成分*

李光，路娟，李學(xué)蘭，張寧，劉斌，陳曦

·藥物制劑與藥品質(zhì)量控制·

HPLC法測(cè)定腎茶中3種甲氧基黃酮類活性成分*

李光1，2，路娟3，李學(xué)蘭1，2，張寧4，劉斌4，陳曦3

(1.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所，景洪 666100；2.云南省西雙版納傣族自治州傣藥南藥重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，景洪 666100；3.中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所，北京 100193；4.黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)佳木斯學(xué)院，佳木斯 154007)

目的 建立測(cè)定腎茶提取物中橙黃酮、半齒澤蘭素、半齒澤蘭素-5-甲醚含量的方法。方法 采用高效液相色譜(HPLC)法，Symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)色譜柱，流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸鹽緩沖液，梯度洗脫；流速：1 mL·min-1，柱溫：35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果 橙黃酮在0.50～5.00 μg、半齒澤蘭素在0.50～5.00 μg、半齒澤蘭素-5-甲醚在0.05～0.50 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系；平均加樣回收率分別為101.26%，100.28%和99.66%。RSD分別為1.73%，0.82%和1.68%。結(jié)論 該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于腎茶的質(zhì)量評(píng)價(jià)。

腎茶；色譜法，高效液相；橙黃酮；半齒澤蘭素；半齒澤蘭素-5-甲醚

腎茶(又名貓須草，傣藥名為雅糯渺)來(lái)源于Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu ex H.W.Li(又稱Orthosiphonstamineus)的全草，是傣醫(yī)常用的排解人體內(nèi)積蓄毒素的藥物，具有清熱解毒、利水消腫、利尿化石等功能，是傳統(tǒng)傣醫(yī)用于預(yù)防和治療腎、膀胱、尿道等泌尿系統(tǒng)感染疾病的首選藥材[1]?，F(xiàn)代研究表明，腎茶提取物具有利尿排石[2]、抗氧化[3]、降血壓[4]、保肝[5]等活性，課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，腎茶提取物具有明顯的降血糖[6]、提高半乳糖所致衰老小鼠學(xué)習(xí)能力[7]等作用，具有較大的應(yīng)用開發(fā)價(jià)值。

腎茶中主要的活性成分是甲氧基黃酮[8-9]，由橙黃酮、半齒澤蘭素、半齒澤蘭素-5-甲醚等組成[10]。甲氧基黃酮類具有明顯的抗氧化[11-12]、抗腫瘤[13]、抗炎[14]、免疫調(diào)節(jié)[15]及保護(hù)心血管[16]作用，被譽(yù)為“天然抗氧化劑”。目前腎茶質(zhì)量控制的方法多為測(cè)定腎茶中酚酸類成分[17-18]，或者測(cè)定甲氧基黃酮類成分[19]，這些方法盡管分離度較好，但出峰時(shí)間短，5 min中內(nèi)全部出峰，對(duì)樣品處理要求較高，對(duì)于傳統(tǒng)藥物中復(fù)雜提取物測(cè)定有效成分適用性不高。筆者擬建立一種較為快速測(cè)定腎茶中3種主要甲氧基黃酮方法以完善腎茶質(zhì)量控制，在此基礎(chǔ)上，比較不同產(chǎn)地腎茶中甲氧基黃酮類的含量，為后期產(chǎn)品開發(fā)奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 超高效液相色譜儀(PDA檢測(cè)器，Waters ACQUITY UPLC H-CLASS)，AB265-S型分析天平(感量0.01 mg，瑞士梅特勒托利多公司)；優(yōu)普超純水儀。

1.2 試藥 橙黃酮、半齒澤蘭素對(duì)照品(含量分別為95.0%，98.3%，批號(hào)分別為12101311，10111422)購(gòu)自百靈威公司，半齒澤蘭素-5-甲醚對(duì)照品(含量為98.5%，批號(hào)：0305100)購(gòu)自Indofine Chemical Company；乙腈為色譜純(Fisher公司)，水為超純水，其他試劑為分析純。腎茶樣品采自云南、福建、廣東、廣西、海南等全國(guó)各主產(chǎn)區(qū)，采集時(shí)間為2009年9—10月，經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所云南分所李學(xué)蘭研究員鑒定為唇形科腎茶屬Clerodendranthusspicatus(Thunb.)C.Y.Wu植物的地上部分。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Symmetry C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，流動(dòng)相為乙腈-0.05%磷酸鹽緩沖液，洗脫梯度為0～30 min 乙腈濃度為5%→100%，30～40 min 乙腈濃度為100%；流速：1 mL·min-1，柱溫：35 ℃，檢測(cè)波長(zhǎng)：365 nm，進(jìn)樣量為10 μL，樣品經(jīng)孔徑0.45 μm微孔濾膜濾過(guò)，各種甲氧基黃酮類成分色譜峰與其他色譜峰基線分離，方法學(xué)考察結(jié)果顯示此條件適用于腎茶中甲氧基黃酮類的含量測(cè)定。

2.2 對(duì)照品溶液的制備 分別精密稱取橙黃酮、半齒澤蘭素、半齒澤蘭素-5-甲醚對(duì)照品各5 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇超聲溶解并定容，過(guò)孔徑0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為對(duì)照品溶液，備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱取腎茶粉末4.0 g，加入甲醇25 mL，超聲提取30 min，濾過(guò)，濾液過(guò)孔徑0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液作為供試品溶液，4 ℃冷藏備用。

2.4 線性關(guān)系考察 在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別進(jìn)樣對(duì)照品溶液1，2，4，6，8，10 μL，以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)(X)，峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到橙黃酮、半齒澤蘭素、半齒澤蘭素-5-甲醚對(duì)照品的回歸方程分別為Y=323 704X+29 378，r=0.999 5；Y=338 223X+17 097，r=0.999 2；Y=381 229X+709.5，r=0.999 1，顯示橙黃酮在0.50～5.00 μg、半齒澤蘭素在0.50～5.00 μg、半齒澤蘭素-5-甲醚在0.05～0.50 μg范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系。見圖1。

A.對(duì)照品；B.腎茶樣品；1.半齒澤蘭素-5-甲醚；2.橙黃酮；3.半齒澤蘭素

圖 1 兩種溶液的HPLC圖譜

A.reference substance；B.Orthosiphonstamineussample；1.3′-hydroxy-5，6，7，4′-tetramethoxyflavone；2.sinensetin；3.eupatorin

Fig.1 HPLC chromatograms of two kinds of solutions

2.5 精密度實(shí)驗(yàn) 精密量取“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液10 μL，于“2.1”項(xiàng)色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，記錄色譜圖，分別計(jì)算樣品中3種甲氧基黃酮峰面積的RSD。結(jié)果表明RSD在0.566%～1.634%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 按照“2.3”項(xiàng)供試品溶液制備方法，平行制備供試品溶液5份。于“2.1”項(xiàng)色譜條件下進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品中3種甲氧基黃酮含量的RSD。結(jié)果表明RSD在1.219%～1.852%，說(shuō)明實(shí)驗(yàn)重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 按照“2.3”項(xiàng)制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)色譜條件下分別于0，2，4，6，8，10 h進(jìn)樣，計(jì)算樣品中3種甲氧基黃酮峰面積RSD。結(jié)果表明RSD在1.195%～1.910%，說(shuō)明供試品10 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.8 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 取已知含量的腎茶樣品4.0 g，精密稱定，分別精密加入橙黃酮、半齒澤蘭素、半齒澤蘭素-5-甲醚對(duì)照品(按純品計(jì)算)47.50，78.64，9.85 mg，與樣品混合，按“2.3”項(xiàng)方法制備供試品溶液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算橙黃酮、半齒澤蘭素、半齒澤蘭素-5-甲醚回收率。結(jié)果表明平均加樣回收率分別為101.26%，100.28%和99.66%。RSD在0.82%～1.73%，RSD<2%，說(shuō)明3種甲氧基黃酮類的回收率符合要求。見表1。

2.9 樣品測(cè)定 分別取不同產(chǎn)地腎茶按“2.3” 項(xiàng)方法制備供試品溶液并進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

通過(guò)測(cè)定13份腎茶樣品，3種主要甲氧基黃酮總含量6.23%～9.29%，平均含量為7.82%，白花腎茶的含量為7.45%，紫花腎茶含量為8.40%，紫花腎茶含量普遍較高，并以景洪藥植所的含量最高，為9.29%。

3 討論

腎茶為西雙版納傣族自治州的傣族人常用藥物，平時(shí)代茶飲，用于治療腎炎、腎結(jié)石等疾病，東南亞地區(qū)居民也習(xí)慣應(yīng)用該藥材，相繼發(fā)現(xiàn)該藥材還具有降血脂及抑菌作用，該藥物保健功能逐漸受到廣泛關(guān)注[20]，深入研究其質(zhì)量控制方法顯得尤為重要。

表1 腎茶樣品中3種甲氧基黃酮類成分加樣回收率Tab.1 Recovery test of three kinds of methoxy flavonoids ingredients in shencha sample

表2 不同產(chǎn)地腎茶中3種甲氧基黃酮類成分含量比較

Tab.2 Comparision of content determination among three kinds of methoxy flavonoids ingredients in Orthosiphon stamineus samples from different habitats %

本實(shí)驗(yàn)建立了同時(shí)測(cè)定3種主要甲氧基黃酮類成分的方法，能夠?qū)崿F(xiàn)對(duì)腎茶提取物中甲氧基黃酮類成分的同時(shí)測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，紫花腎茶中甲氧基黃酮總含量明顯高于白花腎茶品種，這與之前指紋圖譜[21]測(cè)定結(jié)果吻合，而且景洪市腎茶含量最高，這可能與該地區(qū)充足的日照條件有關(guān)，高日照條件下可刺激植物產(chǎn)生大量的黃酮類次生代謝產(chǎn)物[11]。

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Determination of Three Active Flavones in Orthosiphon stamineus by HPLC

LI Guang1，2，LU Juan3，LI Xuelan1，2，ZHANG Ning4，LIU Bin4，CHEN Xi1，3

(1.YunnanBranch，InstituteofMedicinalPlant，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，Jinghong666100 ，China;2.KeyLaboratoryofDaiandSouthernMedicineofXishuangbannaDaiAutonomousPrefecture，YunnanProvince，Jinghong666100 ，China;3.InstituteofMedicinalPlant，ChineseAcademyofMedicalSciences，PekingUnionMedicalCollege，Beijing100193，China;4.JiamusiCollege，HeilongjiangUniversityofTraditionalChineseMedicine，Jiamusi154007，China)

Objective To develop a method for content determination of sinensetin，eupatorin，and 3′-hydroxy-5，6，7，4′-tetramethoxyflavone inOrthosiphonstamineus. Methods The determination was carried out on a Symmetry C18column (4.6 mm×250 mm，5 μm) by HPLC.The mobile consisted of acetonitrile and water containing 0.05% H3PO4in gradient elution.The flow rate was 1 mL·min-1，the column temperature was 35 ℃，the detected wavelength was set at 365 nm, and the injection volume was 10 μL. Results The peak areas and the sample quantity of the three components presented good linear relationship in the range of 0.50-5.00 μg for sinensetin，0.50-5.00 μg for eupatorin，and 0.05-0.50 μg for 3′-hydroxy-5，6，7，4′-tetramethoxyflavone.The average recoveries were 101.26%，100.28% and 99.66%，respectively. RSD were 1.73%, 0.82% and 1.68%, respectively. Conclusion The method is proved to be simple，accurate and can be used for the quality evaluation ofOrthosiphonstamineus.

Orthosiphonstamineus; Chromatography，high performance liquid; Sinensetin; Eupatorin; 3′-hydroxy-5，6，7，4′-tetramethoxyflavone

2014-04- 03

2014-11-14

*北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院協(xié)和青年基金資助項(xiàng)目(3332013081，33320140076)；中央級(jí)公益性科研院所基本科研業(yè)務(wù)基金資助專項(xiàng)(YZYN-14-02、YZYN-13-02)；黑龍江省自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目(H201328)

李光(1985-)，男，河北安國(guó)人，助理研究員，碩士，從事民族藥藥理及開發(fā)工作。電話：0691-2136981，E-mail：lhbg311@hotmail.com。

陳曦(1973-)，男，黑龍江齊齊哈爾人，副研究員，博士，從事中藥藥理及開發(fā)工作。電話：010-62799771，E-mail：91chenxi12@163.com。

R286；R927.2

B

1004-0781(2015)09-1203-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.023