替米沙坦對(duì)腎性高血壓大鼠心肌重構(gòu)的影響

李鑫，馮園園，孫璇璇，李冰

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院1.藥劑科；2.神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430022)

替米沙坦對(duì)腎性高血壓大鼠心肌重構(gòu)的影響

李鑫1，馮園園2，孫璇璇1，李冰1

(華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院1.藥劑科；2.神經(jīng)內(nèi)科，武漢 430022)

目的 探討替米沙坦對(duì)腎性高血壓大鼠心肌重構(gòu)的影響。方法 通過左腎動(dòng)脈縮窄法建立大鼠腎性高血壓心肌肥厚模型，45只雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?SD)大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型對(duì)照組和替米沙坦組，每組15只。替米沙坦組灌胃替米沙坦10 mg·kg-1·d-1，假手術(shù)組、模型對(duì)照組灌胃等量純化水。灌胃8周后，心臟超聲診斷儀觀察心臟結(jié)構(gòu)和功能，測定血壓，計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)，并檢測血清中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(CaN)含量以及心肌β-肌球蛋白重鏈(β-MHC)mRNA的表達(dá)。結(jié)果 模型對(duì)照組和替米沙坦組左心室射血分?jǐn)?shù)分別為(69.23±1.09)%和(73.77±3.00)%(P<0.05)；縮短分?jǐn)?shù)分別為(30.21±2.02)%和(35.29±0.90)%(P<0.05)；左心室質(zhì)量指數(shù)分別為(2.83±0.14)和(2.32±0.11)mg·g-1(P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，替米沙坦組外周循環(huán)血液中CaN以及心肌組織中β-MHC mRNA的表達(dá)均下降(均P<0.05)。結(jié)論 替米沙坦可有效逆轉(zhuǎn)由腎性高血壓引起的心肌肥厚，并可能通過抑制起始信號(hào)CaN的活化，作用于下游信號(hào)通路，下調(diào)心肌蛋白相關(guān)基因β-MHC的表達(dá)。

替米沙坦；高血壓，腎性；心肌重構(gòu)；鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶；β-肌球蛋白重鏈

腎性高血壓患者腎臟缺血，導(dǎo)致腎素分泌增加，腎素-血管緊張肽-醛甾酮系統(tǒng)(renin-angiotensin-aldosterone system，RAAS)過度活化，激活Ras信號(hào)通路，可出現(xiàn)心肌重構(gòu)現(xiàn)象，導(dǎo)致心肌肥厚。替米沙坦是一種血管緊張肽抑制劑類藥物，可抑制Ras、P38、JNK、ERK等信號(hào)通路激活，阻斷心肌蛋白合成[1-3]。替米沙坦可預(yù)防和改善壓力性心室負(fù)荷引起的心肌肥厚，具有降壓和維持心功能的作用[4-5]，關(guān)于其作用機(jī)制有很多研究[6-8]，但是關(guān)于替米沙坦對(duì)心肌肥厚過程中起始信號(hào)的作用鮮有報(bào)道，這些分子機(jī)制的研究都比較單一而且缺乏系統(tǒng)性，對(duì)替米沙坦是通過怎樣的途徑來抑制該信號(hào)通路尚不清楚，因此筆者建立大鼠腎性高血壓模型，探討替米沙坦對(duì)大鼠心肌肥厚過程中的起始信號(hào)血清中鈣調(diào)神經(jīng)磷酸酶(calcineurin，CaN)以及其標(biāo)志蛋白β-肌球蛋白重鏈(β-myosin heavy chain，β-MHC)表達(dá)水平的影響。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 清潔級(jí)健康雄性斯?jié)娎鄹瘛ざ嗬?Sprague Dawley，SD)大鼠45只，體質(zhì)量(250±20)g[購于山東魯抗醫(yī)藥股份有限公司實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證號(hào)：0010232，使用許可證號(hào)：SYXK(魯)2013-0002]，分籠以常規(guī)飼料、常溫條件下飼養(yǎng)，相對(duì)濕度40%～70%，保持環(huán)境清潔。手術(shù)前禁食12 h，不禁水。

1.2 試劑與儀器 替米沙坦片(天津懷仁制藥有限公司，批準(zhǔn)文號(hào)：國藥準(zhǔn)字H20041938，規(guī)格：每片40 mg)，CaN 酶聯(lián)免疫吸附測定(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)試劑盒(上海凱博生化試劑有限公司，規(guī)格：96T/48T，批號(hào)：KB2753)，Trizol試劑盒(美國 Invitrogen，批號(hào)：15596-026)，RT-PCR試劑盒、PCR引物、DNA Marker(日本 TaKaRa，批號(hào)：3427A)，瓊脂糖粉(上海海博生化試劑有限公司)。Vevo707超聲診斷儀(VisualSonics 公司)，MPA2000M測壓系統(tǒng)(奧爾科特公司)。

1.3 動(dòng)物分組與模型建立 將45只大鼠用隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為3組：假手術(shù)組、模型對(duì)照組和替米沙坦組，每組15只。

10%水合氯醛(3 mL·kg-1)腹腔注射麻醉大鼠，剪開腹腔，鈍性分離左腎，游離出左腎動(dòng)脈，替米沙坦組、模型對(duì)照組大鼠套入內(nèi)徑為0.2 mm的銀夾進(jìn)行縮窄手術(shù)，假手術(shù)組只游離左腎動(dòng)脈，不縮窄。手術(shù)后2周，替米沙坦組、模型對(duì)照組收縮壓>150 mmHg(1 mmHg=0.133 kPa)為造模成功。造模成功后，替米沙坦組灌胃給予替米沙坦10 mg·kg-1·d-1，假手術(shù)組、模型對(duì)照組灌胃等量純化水。每天1次，連續(xù)8周。

1.4 心臟結(jié)構(gòu)與功能測定 在灌胃8周后通過超聲診斷儀和高頻探頭檢測心臟結(jié)構(gòu)和功能，其指標(biāo)包括左心室收縮期前壁厚度(left ventricular anterior wall thickness end-systolic，LVAWs)、左心室舒張期前壁厚度(left ventricular anterior wall thickness end-diastolic，LVAWd)、左心室收縮期后壁厚度(left ventricular posterior wall systolic thickness，LVPWs)、左心室舒張期后壁厚度(left ventricular posterior wall diastolic thickness LVPWd)、左心室收縮期內(nèi)徑(left ventricular end systolic diameter，LVIDs)、左心室舒張末期內(nèi)徑(left ventricular end diastolic diameter，LVIDd)、左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)、縮短分?jǐn)?shù)(left ventricular fractional shortening，LVFS)。

1.5 血壓與左心室質(zhì)量指數(shù)測定 灌胃8周后大鼠稱質(zhì)量后麻醉，固定，開腹，分離腹主動(dòng)脈，經(jīng)腹主動(dòng)脈插管，通過生物信號(hào)儀系統(tǒng)記錄主動(dòng)脈收縮壓(systolic blood pressure，SBP)和主動(dòng)脈舒張壓(diastolic blood pressure，DBP)。取下心臟，分離左心室及間隔，稱質(zhì)量，計(jì)算左心室質(zhì)量指數(shù)(left ventricular mass index，LVMI)：LVMI(mg·g-1)=左心室質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.6 CaN檢測 灌胃8周后，大鼠麻醉后經(jīng)腹主動(dòng)脈取血(5～6 mL)，1 500 r·min-1(r=13.5 cm)離心10 min，取血清，根據(jù)CaN ELISA試劑盒說明制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算CaN含量。

1.7 心肌組織中β-MHC mRNA的表達(dá) Trizol法提取心肌組織總RNA，按照RT-PCR試劑盒說明在M-MVL 酶作用下進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，以cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。β-MHC引物序列如下：上游：5′-CTG GCA CCG TGG ACT ACA AC-3′，下游：5′-CGC ACA AAG TGA GGA TAG GGT-3′，長度為268 bp。以β- actin為內(nèi)參引物，上游序列： 5′-CCC ATC TAT GAG GGT TAC GC-3′，下游序列： 5′-TTT AAT GTC ACG CAC GAT TTC-3′，擴(kuò)增產(chǎn)物大小為150 bp。擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙啶染色，Bio-Rad Co.生物醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)分析條帶密度。

2 結(jié)果

2.1 超聲心動(dòng)圖比較 灌胃8周后，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組左室壁厚度(LVAWs、LVAWd、LVPWs、LVPWd)均明顯增加，兩組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為1.231，1.452，2.124，1.973，P<0.05)；替米沙坦組左室壁厚度下降，LVEF和LVFS上升，與模型對(duì)照組比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t值分別為1.346，1.682，2.089，1.909，3.324，5.008，P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，假手術(shù)組與替米沙坦組的LVIDs、LVIDd較小，但差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

2.2 血壓及LVMI測定結(jié)果 灌胃8周后，與假手術(shù)組比較，模型對(duì)照組血壓明顯升高(t=5.379，P<0.05)，替米沙坦組血壓下降明顯，且與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=4.904，P<0.05)。與模型對(duì)照組比較，替米沙坦組LVMI明顯下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=2.076，P<0.05)，而與假手術(shù)組比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表2。

2.3 血清中CaN檢測結(jié)果 在灌胃8周后，假手術(shù)組、模型對(duì)照組和替米沙坦組血清CaN分別為(3.02±0.30)，(7.92±0.40)，(3.08±0.05) μg·L-1。與模型對(duì)照組比較，替米沙坦組外周循環(huán)血液中CaN明顯下降(t=7.123，P<0.05)，而替米沙坦組和假手術(shù)組之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.4 心肌組織中β-MHC mRNA的表達(dá) 模型對(duì)照組β-MHC mRNA的表達(dá)條帶密度(0.89±0.23)，較假手術(shù)組(0.34±0.09)升高，替米沙坦組(0.37±1.03)表達(dá)量明顯降低，與模型對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(t=3.121，P<0.05)。

3 討論

替米沙坦通過阻斷AngⅡ與AT1受體結(jié)合，逆轉(zhuǎn)左心室重構(gòu)，改善心功能[9-10]。替米沙坦逆轉(zhuǎn)心肌肥厚是一個(gè)復(fù)雜的信號(hào)傳遞過程。研究證明CaN在心肌肥厚過程中起著起始信號(hào)的作用，其表達(dá)水平早于心肌重構(gòu)，它可以啟動(dòng)一系列反應(yīng)使心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載，從而表達(dá)一些胚胎性心肌蛋白[11-12]。其中左心室壓力負(fù)荷增加，受到機(jī)械張力或內(nèi)分泌因子刺激后，可導(dǎo)致β-MHC基因的再表達(dá)[13-14]，因此本研究對(duì)心肌肥厚過程中具有代表性的信號(hào)和基因表達(dá)水平進(jìn)行檢測，探討其可能的作用機(jī)制。

心肌肥厚是由于心肌細(xì)胞中蛋白合成增加而導(dǎo)致心肌細(xì)胞增大增重、間質(zhì)細(xì)胞增殖。心肌肥厚使心肌耗氧量增加、順應(yīng)性降低，嚴(yán)重時(shí)導(dǎo)致心力衰竭[15-17]。本研究采用左腎動(dòng)脈縮窄法成功建立腎性高血壓大鼠心肌肥厚模型，模型對(duì)照組與假手術(shù)組比較，左心室壁厚度、LVMI增大，LVEF、LVFS下降，血壓升高，而給予替米沙坦治療8周后，左心室壁厚度、LVMI減小，LVEF、LVFS增加，且血壓降低，說明了替米沙坦可以改善心臟功能，降低血壓，有效逆轉(zhuǎn)心肌肥厚，其原因可能是通過降低血壓減輕心臟室壁所受到的壓力。本研究顯示，模型對(duì)照組CaN的表達(dá)量明顯高于假手術(shù)組，而替米沙坦組CaN的表達(dá)量明顯降低，從而抑制心肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+超載現(xiàn)象，而Ca2+可介導(dǎo)心肌細(xì)胞增大以及肌纖維增生。同時(shí)β-MHC mRNA的水平也明顯下降，由于肌球蛋白是心肌主要蛋白，參與肌絲構(gòu)成，而β-MHC被視為心肌肥厚的分子標(biāo)志[18]，β-MHC mRNA的水平增高，肌球蛋白ATP酶活性降低，不能為心肌收縮提供足夠的能量，心肌收縮力降低，從而導(dǎo)致心肌肥厚。以上的研究說明替米沙坦可能通過阻斷AngⅡ與AT1受體的結(jié)合而使外周循環(huán)中CaN的表達(dá)量降低，作用于下游信號(hào)通路，下調(diào)β-MHC的表達(dá)，從而抑制心肌細(xì)胞的增殖肥大。

表1 3組大鼠超聲心動(dòng)圖指標(biāo)比較

與模型對(duì)照組比較，*1P<0.05Compared with model control group，*1P<0.05

表2 3組大鼠血壓和LVMI比較

與模型對(duì)照組比較，*1P<0.05Compared with model control group，*1P<0.05

綜上所述，替米沙坦可有效逆轉(zhuǎn)由腎性高血壓引起的心肌肥厚，并可能通過抑制起始信號(hào)CaN的活化，下調(diào)心肌蛋白相關(guān)基因β-MHC的表達(dá)。

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Effect of Telmisartan on Myocardial Remodeling in Rats with Renovascular Hypertention

LI Xin1，F(xiàn)ENG Yuanyuan2，SUN Xuanxuan1，LI Bing1

(1.DepartmentofPharmacy;2.DepartmentofNeurology，UnionHospital，TongjiMedicalCollege，HuazhongUniversityofScienceandTechnology，Wuhan430022，China)

Objective To investigate the the molecular mechanism of telmisartan for myocardial remodeling in rats with renovascular hypertention. Methods The renovascular hypertensive myocardial hypertrophy model of rats were established by narrowing the left renal artery.The total of 45 mature male SD rats were divided into sham-operated group(n=15)，model control (n=15) and telmisartan group (n=15) randomly.The rats in telmisartan group were treated with telmisartan (10 mg·kg-1·d-1) while those in the sham-operated and model control were reated with the same amounts of distilled water by intragastrical administration .At 8th week of administration，the myocardial structure and function were detected by ultrasonography.The blood pressure was measured by arterial catheterization and calculating the left ventricular mass index (LVMI) .The level of serum calcium and nerve phosphatase (CaN) and the expression of β-myosin heavy chain (β-MHC) mRNA were detected. Results The thickness of left ventricular，ejection fraction[(69.23±1.09)%vs(73.77±3.00)%]，fractional shortening[(30.21±2.02)%vs(35.29±0.90)%]，LVMI[(2.83±0.14) mg·g-1vs(2.32±0.11) mg·g-1] were decreased，and the differences were statistically significant (P<0.05).The level of serum calcium and nerve phosphatase (CaN) and the expression of β-myosin heavy chain (β-MHC) mRNA were decreased in telmisartan treated rats，and the differences were statistically significant (P<0.05) when compared with the model control group. Conclusion Telmisartan can improve the myocardial hypertrophy of renovascular hypertensive rats，and it may downregulate the expression of β-MHC by inactivating of the start signal CaN and its downstream signal pathway.

Telmisartan; Hypertension，renovascular; Myocardial remodeling; Calcium and nerve phosphatase; β-myosin heavy chain

2014-09-08

2014-11-18

李鑫(1983-)，男，湖北荊門人，藥師，碩士，從事醫(yī)院藥學(xué)工作。電話：027-85351733，E-mail：46648856lixin@163.com。

馮園園(1985-)，女，湖北宜昌人。電話：027-85726670，E-mail：934728115@qq.com。

R972.4；R965

A

1004-0781(2015)09-1161-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.09.010