補(bǔ)腎壯骨丸抗骨質(zhì)疏松的藥效學(xué)作用及機(jī)制探討

邢爽 康學(xué)

北京積水潭醫(yī)院中藥房，北京100035

補(bǔ)腎壯骨丸抗骨質(zhì)疏松的藥效學(xué)作用及機(jī)制探討

邢爽 康學(xué)

北京積水潭醫(yī)院中藥房，北京100035

目的探討北京積水潭醫(yī)院院內(nèi)制劑補(bǔ)腎壯骨丸抗骨質(zhì)疏松的藥效學(xué)作用及其機(jī)制。方法6個月齡雌性SD大鼠60只，隨機(jī)分為正常對照組、模型對照組、補(bǔ)腎壯骨丸低（1.2 g/kg）、中（2.4 g/kg）、高（4.8 g/kg）劑量組以及陽性藥雷洛昔芬組，每組10只。雙側(cè)卵巢摘除術(shù)建立大鼠骨質(zhì)疏松模型，去勢手術(shù)1周后，補(bǔ)腎壯骨丸低、中、高劑量組及陽性藥組分別灌胃給予不同劑量補(bǔ)腎壯骨丸混懸液及雷洛昔芬混懸液治療12周，正常及模型對照組灌服等體積的生理鹽水。分別檢測血清堿性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）、甲狀旁腺激素（PTH）、促甲狀腺激素（CT）以及垂體-性腺軸相關(guān)激素雌二醇（E2）、睪酮（T）、黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）含量；測定骨密度、骨生物力學(xué)性能。結(jié)果去勢后，模型對照組血清ALP、TRAP、PTH活性顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），含量分別為（16.347±2.957）U/100 mL、（27.691±7.042）U/L、（45.829±17.007）pg/mL，CT水平顯著下降，含量為（20.469±7.343）pg/mL，全股骨和股骨頭骨密度為（0.1859±0.0137）、（0.1871±0.0193）g/cm2，股骨最大載荷為（63.448±17.540）N，最大撓度為（0.5848±0.1595）mm，均較正常對照組顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）；性激素E2和T含量顯著降低（P＜0.01），分別為（5.935±1.621）pg/mL、（3.382±1.405）ng/mL，促性腺激素LH和FSH水平明顯上調(diào)（P＜0.05），含量分別為（12.549±2.376）、（15.841±1.896）mU/mL；與模型對照組比較，補(bǔ)腎壯骨丸中、高劑量組ALP含量為（13.619±2.881）、（12.720±3.044）U/100 mL，TRAP含量為（20.904±6.454）、（19.933±5.988）U/L，PTH含量為（26.753±13.013）、（25.630±15.618）pg/mL，三者活性均顯著下調(diào)（P＜0.05或P＜0.01）；高劑量組CT含量顯著升高，為（28.350±7.827）pg/mL，中、高劑量組全股骨密度及高劑量組股骨頭密度顯著升高，分別為（0.2081±0.0113）、（0.2135± 0.0139）、（0.2304±0.0290）g/cm2，高劑量組股骨最大載荷及撓度分別為（81.314±16.413）N、（0.7358±0.1488）mm，較模型組顯著升高（P＜0.05）；高劑量組E2、T顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），含量為（8.799±2.204）pg/mL、（5.086±1.668）ng/mL；中、高LH含量分別為（10.740±1.652）、（10.575±0.886）mU/mL，F(xiàn)SH含量分別為（13.244±2.089）、（13.348±2.170）mU/mL，二者水平均顯著下調(diào)（均P＜0.05）。結(jié)論補(bǔ)腎壯骨丸可有效糾正骨代謝異常，增加骨密度，增強(qiáng)生物力學(xué)性能，其發(fā)揮抗骨質(zhì)疏松作用的部分機(jī)制與其調(diào)節(jié)垂體-性腺軸相關(guān)激素水平有關(guān)。

骨質(zhì)疏松；去勢；補(bǔ)腎壯骨丸；藥效及機(jī)制研究

骨質(zhì)疏松癥（osteoporosis，OP）是以骨質(zhì)量降低，骨組織纖維結(jié)構(gòu)退化，繼而引發(fā)骨骼脆性及骨折危險性增加為特征的系統(tǒng)性骨病，該病已躍居世界常見病發(fā)病率的第7位［1］，由OP引起的嚴(yán)重的醫(yī)療和社會負(fù)擔(dān)，已成為全球公共衛(wèi)生問題。由于骨屬于雌激素依賴性組織，因而絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）在原發(fā)性O(shè)P中占有很大比例。目前西藥治療現(xiàn)狀并不理想，而中醫(yī)藥著重辨證論治，在防治該病方面顯現(xiàn)出較大的優(yōu)勢。無論OP還是PMOP均屬于中醫(yī)“骨痿”范疇，中醫(yī)認(rèn)為其發(fā)生首先當(dāng)責(zé)之于腎精虧虛［2］，故補(bǔ)腎填精壯骨是治療該病的根本大法。補(bǔ)腎壯骨丸是北京積水潭醫(yī)院（以下簡稱“我院”）院內(nèi)制劑，具有補(bǔ)腎填精、強(qiáng)筋壯骨之功，正切合PMOP之腎虛精虧的中醫(yī)發(fā)病病機(jī)。本實(shí)驗通過去勢建立經(jīng)典的大鼠骨質(zhì)疏松模型，探討補(bǔ)腎壯骨丸抗OP的藥效學(xué)作用及其機(jī)制，為該制劑的進(jìn)一步臨床應(yīng)用提供可靠的實(shí)驗依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Biofuge 15R低溫生物離心機(jī)（德國Heraeus SEPATECH公司）；UV-1700型分光光度計（日本島津公司）；CP224C型萬分之一電子分析天平（奧豪斯儀器有限公司）；R-911型全自動放免儀（中國科技大學(xué)實(shí)業(yè)總公司）；尼康ECLIPSE 80i型生物顯微鏡附圖像分析軟件（銳馳恒業(yè)儀器科技有限公司）；Lexxos-2000型雙能X射線骨密度儀（法國MEDILINK公司）；WD-1型電子萬能試驗機(jī)（長春非金屬試驗機(jī)廠）；萊卡RM2235型切片機(jī)（上海萊卡儀器有限公司）；Multiskan MK3型全自動酶標(biāo)儀（美國THERMO公司）。

1.2 動物

清潔級6個月齡健康雌性SD大鼠60只，由北京維通利華實(shí)驗動物技術(shù)股份有限公司提供，合格證號：SCXK（京）2013-0001。

1.3 藥品與試劑

藥品：補(bǔ)腎壯骨丸（北京積水潭醫(yī)院院內(nèi)制劑，京藥制字Z20053696，批號：140412，規(guī)格：每100粒重20 g）；雷洛昔芬片（商品名：易維特，禮來制藥有限公司，批號：L02576，每片重0.2585 g，相當(dāng)于以C28H27NO4S· HCl計60 mg）；戊巴比妥鈉（天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所，批號：20120527）。

試劑：堿性磷酸酶（ALP）、抗酒石酸酸性磷酸酶（TRAP）試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號分別為：20130925、20131021）；甲狀旁腺激素（PTH）、促甲狀腺激素（CT）酶聯(lián)免疫試劑盒（美國BG公司，批號E02P0572、E02C0404）；睪酮（T）、雌二醇（E2）、促黃體生成素（LH）、卵泡刺激素（FSH）放免測試盒（北京華英生物技術(shù)研究所，批號分別為：20131125T、20131205E、20131130L、20131129L）。

2 方法

2.1 分組

60只大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為6組，每組10只。包括正常對照組、模型對照組、補(bǔ)腎壯骨丸低（1.2 g/kg）、中（2.4 g/kg）、高（4.8 g/kg）劑量組、雷洛昔芬組。自由飲水、攝食。

2.2 造模

施行手術(shù)造模法，術(shù)前8 h禁食，在無菌條件下，各組大鼠均用1%戊巴比妥鈉（40～50 mg/kg）腹腔內(nèi)注射麻醉，腹腔正中切口。除正常對照組外，各組大鼠均行雙側(cè)卵巢摘除術(shù)；正常對照組用同樣手術(shù)入路暴露卵巢，切除少量脂肪，不摘除卵巢。術(shù)后每只大鼠給予青霉素鈉鹽5 U/d，連續(xù)用3 d。

2.3 給藥

去勢手術(shù)1周后，各組動物灌胃給予相應(yīng)的藥物或生理鹽水，每日1次，連續(xù)給藥12周。①補(bǔ)腎壯骨丸低、中、高劑量組：分別給予補(bǔ)腎壯骨丸混懸液1.2、2.4、4.8 g/kg體重灌胃（中劑量組用量相當(dāng)于臨床等效劑量）；②雷洛昔芬組：雷洛昔芬片6.25 mg/kg體重灌胃；③正常對照組、模型對照組：灌服與用藥組等體積的生理鹽水。

2.4 取材及檢測

禁食16 h后，腹腔麻醉，腹主動脈取血，離心取血清，按照試劑盒說明書，比色法檢測血清ALP、TRAP含量，酶免法檢測血清PTH、CT含量，放免法檢測血清E2、T、LH、FSH水平。分離大鼠的左右兩側(cè)股骨，剝除其附著的肌肉及結(jié)締組織，左側(cè)用生理鹽水浸泡的濕紗布包裹置于-20℃保存，用于骨密度以及生物力學(xué)檢測；右側(cè)以10%甲醛溶液固定，行病理組織形態(tài)計量學(xué)檢測。

2.5 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 17.0 for Windows軟件包完成。符合正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，組間比較采用方差齊性檢驗及單因素方差分析，根據(jù)方差齊性檢驗結(jié)果選擇LSD（方差齊）或Tamhane＇s T2（方差不齊）進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；非正態(tài)分布的數(shù)據(jù)采用非參數(shù)檢驗方法。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠血清ALP、TRAP含量的比較

與正常對照組比較，模型對照組血清ALP、TRAP含量均顯著升高（均P＜0.01）。與模型對照組比較，補(bǔ)腎壯骨丸中、高劑量組以及陽性藥雷洛昔芬組二者水平均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01）。見表1。

3.2 各組大鼠血清PTH、CT含量的比較

與正常對照組比較，模型對照組血清PTH含量顯著升高（P＜0.01），CT含量顯著下降（P＜0.05）。補(bǔ)腎壯骨丸各劑量組及雷洛昔芬組PTH水平顯著降低（均P＜0.01）；僅補(bǔ)腎壯骨丸高劑量組及雷洛昔芬組

表1 各組大鼠血清ALP、TRAP含量的比較（x±s）

可顯著升高血清CT含量（均P＜0.05）。見表2。

表2 各組大鼠血清甲狀旁腺激素、促甲狀腺激素含量的比較（pg/mL，x±s，n=8）

3.3 各組大鼠骨密度的比較

各組大鼠骨密度掃描結(jié)果顯示：模型對照組全股骨及股骨頭處骨密度均較正常對照組顯著降低（均P＜0.01）。經(jīng)治療后，補(bǔ)腎壯骨丸高劑量組及雷洛昔芬組兩處骨密度均明顯升高（P＜0.05或P＜0.01），中劑量組僅能顯著增加全股骨骨密度（P＜0.01）。見表3。

表3 各組大鼠骨密度的比較（g/cm2，x±s，n=8）

3.4 各組大鼠骨生物力學(xué)性能的比較

生物力學(xué)測試結(jié)果顯示：與正常對照組比較，模型對照組股骨最大載荷量及最大撓度均明顯下降（P＜0.05或P＜0.01）。補(bǔ)腎壯骨丸高劑量組及雷洛昔芬組能顯著提高股骨最大載荷及最大撓度（均P＜0.05）。見表4。

3.5 各組大鼠垂體-性腺軸相關(guān)激素水平的比較

性腺軸相關(guān)激素水平檢測結(jié)果顯示：造模后，大鼠血清E2、T含量均顯著下降（均P＜0.01），而促性腺激素LH和FSH水平顯著上調(diào)（均P＜0.05）。與模型對照組比較，補(bǔ)腎壯骨丸中、高劑量組及雷洛昔芬組血清E2含量顯著升高（P＜0.05或P＜0.01），僅高劑量能顯著提高血清T含量；補(bǔ)腎壯骨丸中、高劑量組及雷洛昔芬組血清LH、FSH水平較模型對照組顯著下調(diào)（均P＜0.05）。見表5。

表4 各組大鼠骨生物力學(xué)性能的比較（x±s）

4 討論

OP是老齡化社會衛(wèi)生保健的一個突出問題，得到了世界各國醫(yī)學(xué)界的普遍重視。其中，最為常見且比例較大的PMOP是由于絕經(jīng)后雌激素水平驟減，導(dǎo)致骨吸收大于骨形成，出現(xiàn)以低骨量和骨組織結(jié)構(gòu)退行性病變的全身代謝性骨?。?］。據(jù)調(diào)查，OP患病率女性是男性的2.73倍，尤其絕經(jīng)后激素水平急劇下降，OP發(fā)病率顯著升高，且年齡每增加10歲，OP患病風(fēng)險增加1.4～1.8倍［4］。因此，有效防治這一高發(fā)性骨病，篩選開發(fā)出安全高效的抗OP新藥物是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)亟待解決的重要問題。

表5 各組大鼠垂體-性腺軸相關(guān)激素水平的比較（x±s）

西醫(yī)用藥主要是針對發(fā)病的病理環(huán)節(jié)，采用補(bǔ)充雌激素、骨吸收抑制劑、骨形成促進(jìn)劑等，這種單點(diǎn)局限治療對于OP這一復(fù)雜病變難奏長效，加之治療費(fèi)用高、副作用較大及其潛在的致癌性［5-6］，使其應(yīng)用受到限制，故治療現(xiàn)狀尚不理想。中醫(yī)藥治療著重調(diào)動內(nèi)因、辨證論治，最終達(dá)到糾正機(jī)體激素失衡和負(fù)鈣平衡的功效。中醫(yī)學(xué)將該病歸屬于“骨痿”、“骨痹”范疇，認(rèn)為五臟虛損和氣血功能紊亂與PMOP發(fā)病密切相關(guān)，腎虛、脾虛、血瘀等為基本病機(jī)，其中腎虛精虧是核心病機(jī)［7］，正如《素問·痿論》云：“腎氣熱，則腰脊不舉，骨枯而髓減，發(fā)為骨痿”，尤其絕經(jīng)伴隨年齡的增長到“女子七七天癸竭”，腎中精虧髓虛，骨髓生源不足，不能濡養(yǎng)骨骼，則發(fā)為腰膝酸軟、行走不便的“骨痿”。現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為，腎精相當(dāng)于性激素及促性腺激素，與垂體-性腺軸系統(tǒng)作用有驚人的相似之處［8］。由此可見，“腎虛精虧、天癸竭”中醫(yī)病機(jī)與現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為雌激素缺乏是PMOP的首要病因這一理論是相吻合的。因此，補(bǔ)腎填精壯骨之法是治療PMOP的根本大法。

北京積水潭醫(yī)院院內(nèi)制劑補(bǔ)腎壯骨丸主要由補(bǔ)骨脂、鹿角霜、龜甲、牛膝、三七、土鱉蟲等組成，具有補(bǔ)腎填精，強(qiáng)筋壯骨，益氣活血的功效，用于腎虛腰背酸痛，足膝軟弱，疲倦乏力，畏寒肢冷，自汗，盜汗，五心煩熱等癥及骨質(zhì)疏松等。本研究通過骨代謝生化以及直觀評價OP的指標(biāo)來評價補(bǔ)腎壯骨丸抗OP的藥效學(xué)作用，并以性激素缺乏是PMOP的首要病因這一理論以切入點(diǎn)，通過研究垂體-性腺軸相關(guān)激素水平的變化，探討藥物防治OP的作用機(jī)制，以期更好地為該制劑的臨床應(yīng)用提供依據(jù)。

骨代謝生化指標(biāo)可動態(tài)觀察骨轉(zhuǎn)換代謝過程，對評價骨質(zhì)量、監(jiān)測藥物療效有著重要意義。ALP是成骨細(xì)胞分化的早期標(biāo)志物，血ALP可作為評價骨形成能力和骨轉(zhuǎn)換率的特異性生化指標(biāo)，其活性在破骨或成骨占優(yōu)勢時均升高［9］。TRAP由破骨細(xì)胞分泌釋放，血清中TRAP的水平可以反映體內(nèi)OC活性和骨吸收狀態(tài)［10］。本研究結(jié)果顯示：大鼠去勢后，血清ALP和TRAP水平均顯著升高，提示骨代謝處于骨吸收大于骨形成的負(fù)平衡狀態(tài)，補(bǔ)腎壯骨丸可明顯下調(diào)二者水平，提示該制劑能夠有效逆轉(zhuǎn)高轉(zhuǎn)換型骨代謝狀態(tài)，從而使骨吸收和骨形成之間的偶聯(lián)趨于平衡。PTH和CT是調(diào)節(jié)機(jī)體鈣磷代謝和骨組織新陳代謝的重要激素。血PTH對骨的作用是通過刺激破骨細(xì)胞活性來促進(jìn)骨吸收［11］。本研究中經(jīng)藥物干預(yù)后大鼠血PTH含量明顯降低，CT水平顯著升高，說明補(bǔ)腎壯骨丸能通過抑制機(jī)體PTH水平來抑制骨吸收，通過影響鈣調(diào)節(jié)激素PTH和CT的水平來改善骨代謝進(jìn)而防止OP。

聯(lián)合直觀反映OP的藥效學(xué)指標(biāo)能夠更全面、合理地評價骨轉(zhuǎn)換狀態(tài)以及藥物干預(yù)治療效果。骨密度已被看作是臨床診斷OP的“金標(biāo)準(zhǔn)”；骨生物力學(xué)性能是決定骨強(qiáng)度和對脆性骨折風(fēng)險進(jìn)行評定的可靠方法［12］；此外，OP的主要病理表現(xiàn)是骨組織顯微結(jié)構(gòu)的異常，因此，骨組織病理形態(tài)可作為直觀反映骨量評價骨轉(zhuǎn)換與骨結(jié)構(gòu)不可或缺的關(guān)鍵性指標(biāo)［13］。本研究結(jié)果顯示：造模后，OP大鼠骨密度顯著下降，股骨最大載荷和撓度均明顯降低，且顯微結(jié)構(gòu)出現(xiàn)典型的骨質(zhì)疏松樣改變；補(bǔ)腎壯骨丸干預(yù)治療后，上述指標(biāo)均明顯改善，提示該制劑可通過增加骨密度，增強(qiáng)結(jié)構(gòu)力學(xué)性能，逆轉(zhuǎn)骨組織病理樣改變而發(fā)揮抗OP作用。

由于雌激素水平驟減，造成破骨細(xì)胞活性明顯增強(qiáng)，骨轉(zhuǎn)換加快已是公認(rèn)的PMOP發(fā)生的首要原因。中醫(yī)所言的“腎虛精虧”與該理論相吻合，故因此為切入點(diǎn)來探討藥物作用的可能機(jī)制。雄激素可刺激成骨細(xì)胞和骨細(xì)胞的增殖、分化，其減少與骨丟失相關(guān)；雌激素在骨吸收方面起主導(dǎo)作用，其含量下降可導(dǎo)致骨轉(zhuǎn)換活躍和骨密度降低［14］。此外，垂體-性腺軸各個水平的激素之間都存在著紐帶聯(lián)系，上游激素FSH和LH可作用于性腺，調(diào)節(jié)性激素的生成、釋放，同樣會被性激素反饋性抑制［15］。本研究顯示：行去勢術(shù)后，OP大鼠雌雄激素水平驟減，促性腺激素分泌反饋性異常升高，提示性激素水平低下及相關(guān)激素分泌紊亂是導(dǎo)致骨代謝異常的重要原因之一。經(jīng)補(bǔ)腎壯骨丸治療后能顯著提高性激素水平，糾正促性腺激素的異常分泌，提示垂體-性腺軸相關(guān)激素水平的整體調(diào)節(jié)作用可能是該制劑防治OP的作用機(jī)制之一。

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XING Shuang KANG Xue
Dispensary of Traditional Chinese Medicine,Jishuitan Hospital,Beijing 100035,China

ObjectiveTo explore the pesticide effect and mechanism of Bushenzhuanggu Pills on osteoporosis rats induced by ovariectomy.MethodsSixty 6-month old female SD rats were randomly divided into six different groups according to body mass:normal control group,model group,Bushenzhuanggu Pill low(1.2 g/kg),medium(2.4 g/kg)and high dose(4.8 g/kg)groups,while Raloxifene as the positive control drug,10 rats in each group.All rats received ovariectomy to establish osteoporosis model except those in the normal control group.Rats in treatment groups were treated with intragastric administration of Bushenzhuanggu Pill suspl with different doses or positive drug respectively for twelve weeks.Later the content of alkaline phosphatase(ALP),tartrate-resistant acid phosphatase(TRAP),parathyroid hormone(PTH),osteocalcin(CT),bone mineral density(BMD),biomechanical efficiency,pathomorphology were observed.Also the levels of estradiol(E2),testosterone(T),luteinizing hormone(LH)and follicle stimulating hormone (FSH)were detected.ResultsThe content of serum ALP,TRAP and PTH were significantly higher(P＜0.05 or P＜0.01),the content was(16.347±2.957)U/100 mL,(27.691±7.042)U/L,(45.829±17.007)pg/mL respectively,while CT level was lower than normal control group by(20.469±7.343)pg/mL.Also reduction in BMD and biomechanical efficiency were observed(P＜0.05 or P＜0.01),the femur and femoral head bone density were(0.1859±0.0137)g/cm2and (0.1871±0.0193)g/cm2,then the maximum load of femoral was(63.448±17.540)N,the maximum deflection was(0.5848±0.1595)mm.In addition,the content of serum E2and T was significantly lower(P＜0.01),contents of(5.935± 1.621)pg/mL,(3.382±1.405)ng/mL,while the level of LH and FSH was significantly higher in ovariectomy rats(P＜0.05), contents of(12.549±2.376),(15.841±1.896)mU/mL.Compared with model group,ALP content in the middle and high dose group of Bushenzhuanggu Pill were(13.619±2.881)and(12.720±3.044)U/100 mL,TRAP content was(20.904± 6.454)and(19.933±5.988)U/L,the PTH content were(26.753±13.013)and(25.630±15.618)pg/mL,the three activities were significantly down regulated(P＜0.05 or P＜0.01).Content of CT in high dose group increased,as(28.350±7.827) pg/mL.The whole femur density in middle and high dose group and the density of the femoral head in high dose group significantly increased;bone density were(0.2081±0.0113),(0.2135±0.0139)and(0.2304±0.0290)g/cm2respectively. The maximum load of femoral and radial in high dose group were(81.314±16.413)N and(0.7358±0.1488)mm,these indicators were compared to the modelgroup increased significantly(P＜0.05).Also treated group could significantly increase the content of sex hormone,while down-regulate the level of gonadotrophic hormone.The content of E2and T in high dose group significantly increased(P＜0.05 or P＜0.01),content were(8.799±2.204)pg/mL and(5.086±1.668)ng/mL. The content of LH in middle and high dose group were(10.740±1.652)and(10.575±0.886)mU/mL respectively(P＜0.05),while the content of FSH were(13.244±2.089)and(13.348±2.170)mU/mL respectively(P＜0.05),the two levels were significantly lowered.ConclusionBushenzhuanggu Pill can effectively correct abnormality of bone metabolism, increase bone density,enhance biomechanical properties of bone and reverse pathological changes in bone tissue. The mechanism of its anti-osteoporosis is related to the effect of regulating related hormones levels of thepituitarygonadal axis.

Osteoporosis;Ovariectomy;Bushenzhuanggu Pill;Potency and mechanism research

R285.5

A

1673-7210(2015）01(c）-0024-05

2014-11-02本文編輯：衛(wèi)軻）