異甘草素保護(hù)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)功能的實(shí)驗(yàn)研究*

杜 靚 金巧萍

（浙江省金華市中心醫(yī)院，浙江 金華 321000）

·研究報(bào)告·

異甘草素保護(hù)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)功能的實(shí)驗(yàn)研究*

杜 靚 金巧萍

（浙江省金華市中心醫(yī)院，浙江 金華 321000）

目的觀(guān)察異甘草素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)功能的影響。方法先對(duì)大鼠建立腦損傷模型，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成假手術(shù)組、腦損傷組、異甘草素組，假手術(shù)組、腦損傷組予等量0.9%氯化鈉注射液灌胃，異甘草素組予20 mg/kg藥物灌胃治療，1周后處死，均終點(diǎn)法檢測(cè)過(guò)氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）含量，觀(guān)察在以上指標(biāo)變化情況。結(jié)果異甘草素組SOD、MDA、Feeney評(píng)分、TNF-α、IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10分別為（123.77±9.35）U/mg、（3.27±1.15）U/mg、（2.12±0.43）分、（38.74±2.35）pg/mg、（106.24±9.13）pg/mg、（83.46±7.24）pg/mg、（367.69±36.13）pg/mg、（417.35± 25.35）pg/mg，和其他兩組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在組織形態(tài)學(xué)上，表現(xiàn)為腦皮層損傷灶細(xì)胞數(shù)明顯增多，傷口肉芽組織填平，軟腦膜已經(jīng)形成，且和正常腦組織入腦膜相續(xù)，半透明水腫帶交窄，水腫帶局限在損傷灶底部，與其他組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。結(jié)論異甘草素能保護(hù)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)功能，可能和降低氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)腦組織細(xì)胞因子有關(guān)。

異甘草素 創(chuàng)傷性腦損傷 大鼠 神經(jīng)功能

創(chuàng)傷性腦損傷是由于外力作用下引起腦組織原發(fā)性/繼發(fā)性損傷，從而造成腦組織發(fā)生一系列病理生理代謝紊亂和功能失調(diào)。在臨床上，如何阻斷和減輕繼發(fā)性損害是一個(gè)難點(diǎn)?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為甘草在腦保護(hù)上有廣泛藥理活性［1］。本研究就通過(guò)觀(guān)察異甘草素保護(hù)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)功能情況，以期選擇最佳治療方法，提高臨床診治水平?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物和試劑 隨機(jī)選取36只大鼠為研究對(duì)象，分為3組，每組12只，均為雄性，平均體質(zhì)量為（150± 15）g，均購(gòu)自復(fù)旦大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，合格證編號(hào)為20140412B。異甘草素（純度為98%）由上海生物科技有限公司提供；過(guò)氧化物歧化酶 （SOD）、丙二醛（MDA），酶聯(lián)免疫吸附法白細(xì)胞介素-6（IL-6）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）檢測(cè)試劑盒均由日本三洋公司提供。低速離心機(jī)、超低溫冰箱等均由上海實(shí)業(yè)有限公司提供。

1.2 動(dòng)物分組和模型制備 大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分成假手術(shù)組、腦外傷組、異甘草素組，每組均為12只。腦外傷組及異甘草素組先進(jìn)行模型制備，造模參考文獻(xiàn)［2］的方法進(jìn)行，自制打擊器、由撞桿、下落打擊棒和金屬套等組成，質(zhì)量為30 g，麻醉小鼠后，固定頭部后矢狀正中線(xiàn)切開(kāi)頭皮，打擊大鼠頭部造成左大腦半球局部腦挫傷損傷后，充分止血后用碘伏消毒清洗傷口并縫合頭皮。假手術(shù)組則僅開(kāi)窗不進(jìn)行打擊，以大鼠短暫四肢抽搐，呼吸暫停為造模成功。

1.3 干預(yù)方法 異甘草組小鼠于術(shù)后2 h腹腔注射異甘草素30 mg/kg，每日1次，腦外傷組同時(shí)腹腔注射等量蒸餾水，每日1次，共治療6 d。

1.4 檢測(cè)方法 治療后每只經(jīng)10%水合氯醛2 mL腹腔注射。麻醉后迅速斷頭取腦，用冰冷生理鹽水沖洗腦組織表面血跡，濾去殘余水分，取大鼠腦組織約0.2 mL，同時(shí)用電子天平測(cè)量質(zhì)量后加入10倍體積PBS緩沖液損傷大腦皮層勻漿，離心后取上層清液說(shuō)明書(shū)步驟進(jìn)行腦組織勻漿SOD、MDA、TNF-α檢測(cè)，檢測(cè)腦組織細(xì)胞因子白介素-1α（IL-1α）、白介素-1β（IL-1β）、白介素-6（IL-6）、白介素-10（IL-10）水平。并將大鼠置于平衡木行走試驗(yàn)，測(cè)定運(yùn)動(dòng)整合和協(xié)調(diào)能力，按照Feeney計(jì)分標(biāo)準(zhǔn)計(jì)分。

1.5 病理切片觀(guān)察損傷灶組織形態(tài) 腦組織切片石蠟包埋制片，HE染色顯微鏡下放大50倍觀(guān)察腦組織和損傷病灶組織形態(tài)學(xué)病理變化，病例切片方法參考文獻(xiàn)［3］。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件。計(jì)量資料以（±s）表示，計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠神經(jīng)功能指標(biāo)比較 見(jiàn)表1。對(duì)各組神經(jīng)功能指標(biāo)進(jìn)行比較，假手術(shù)組和腦外傷組、假手術(shù)組和異甘草素組、假手術(shù)組和異甘草素組在SOD、MDA、Feeney評(píng)分、TNF-α比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能指標(biāo)比較（±s）

表1 各組大鼠神經(jīng)功能指標(biāo)比較（±s）

與假手術(shù)組比較，*P＜0.05；與腦外傷組比較，△P＜0.05。下同。

組別 n S O D（U / m g） M D A（n m o l / m g）F e e n e y評(píng)分（分）T N F -α（p g / m g）假手術(shù)組 1 2腦外傷組 1 2 1 1 8 . 5 7 ± 7 . 2 4 2 . 0 3 ± 0 . 5 8 0 . 3 4 ± 0 . 1 3 2 0 . 3 6 ± 2 . 1 4 1 0 1 . 3 4 ± 7 . 2 3*4 . 1 8 ± 1 . 2 7*4 . 1 1 ± 0 . 5 6*4 5 . 4 6 ± 4 . 1 3*異甘草素組 1 2 1 2 3 . 7 7 ± 9 . 3 5*△3 . 2 7 ± 1 . 1 5*△2 . 1 2 ± 0 . 4 3*△3 8 . 7 4 ± 2 . 3 5*△

2.2 各組大鼠腦皮層組織形態(tài)學(xué)比較 見(jiàn)圖1～圖3。假手術(shù)組腦皮層細(xì)胞均勻，細(xì)胞密集，軟腦膜連續(xù)且完整；腦外傷組腦皮層打擊形成腦軟化灶，創(chuàng)面凹陷，細(xì)胞數(shù)目稀疏，半透明水腫帶超出損傷灶延伸至海馬；異甘草素組腦皮層損傷灶細(xì)胞數(shù)明顯增多，傷口肉芽組織填平，軟腦膜已經(jīng)形成，且和正常腦組織入腦膜相續(xù)，半透明水腫帶交窄，水腫帶局限在損傷灶底部。

圖1 假手術(shù)組

圖2 腦外傷組

圖3 異甘草素組

2.3 各組大鼠細(xì)胞因子指標(biāo)比較 見(jiàn)表2。對(duì)各組細(xì)胞因子進(jìn)行比較，假手術(shù)組和腦外傷組、假手術(shù)組和異甘草素素組、假手術(shù)組和異甘草素素組在IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 各組大鼠細(xì)胞因子指標(biāo)比較（pg/mg，±s）

表2 各組大鼠細(xì)胞因子指標(biāo)比較（pg/mg，±s）

組別 n I L -1 α I L -1 β I L -6 I L -1 0假手術(shù)組 1 2腦外傷組 1 2 7 3 . 1 3 ± 4 . 5 6 1 0 1 . 3 5 ± 1 1 . 2 7 1 8 7 . 3 5 ± 2 1 . 0 4 3 4 9 . 2 4 ± 2 0 . 1 4 4 7 . 3 4 ± 5 . 3 5*1 4 7 . 7 8 ± 1 3 . 2 1*4 6 7 . 3 6 ± 4 5 . 1 5*3 0 4 . 5 6 ± 2 1 . 3 4*異甘草素組 1 2 1 0 6 . 2 4 ± 9 . 1 3*△8 3 . 4 6 ± 7 . 2 4*△3 6 7 . 6 9 ± 3 6 . 1 3*△4 1 7 . 3 5 ± 2 5 . 3 5*△

3 討 論

腦損傷后氧化應(yīng)激會(huì)加重繼發(fā)性腦損傷，創(chuàng)傷性腦損傷后氧化和抗氧化作用失衡，氧自由基會(huì)大量失去，這就會(huì)造成組織破壞和細(xì)胞破壞，而氧化應(yīng)激會(huì)促使細(xì)胞直接壞死，誘導(dǎo)凋亡程序啟動(dòng)，促使細(xì)胞凋亡。研究［2］稱(chēng)，創(chuàng)傷性腦損傷后會(huì)產(chǎn)生脂質(zhì)過(guò)氧化，蛋白質(zhì)氧化等，損傷DNA，造成神經(jīng)細(xì)胞損傷，而SOD、MDA則是反映腦組織氧化應(yīng)激反應(yīng)水平良好指標(biāo)。創(chuàng)傷性腦損傷后，血管壁破壞，血液進(jìn)入組織間隙，引起血管性腦水腫，損傷區(qū)血供減少、細(xì)胞缺血引起細(xì)胞鈉鉀泵轉(zhuǎn)運(yùn)障礙，形成細(xì)胞水腫［3］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，創(chuàng)傷性腦外傷是腦內(nèi)傷范疇，其病理機(jī)制是氣滯血瘀、痰凝和水停，在急性期需手術(shù)治療，恢復(fù)期則以中醫(yī)藥治療為主。創(chuàng)傷性腦外傷后內(nèi)部脈絡(luò)會(huì)發(fā)生破裂，血溢脈外后積累于局部形成瘀血造成髓海失養(yǎng)，引起五臟六腑失調(diào)，陰陽(yáng)失去平衡。在本次研究中，異甘草素是甘草一種有效成分，具有理氣活血、疏通經(jīng)脈等作用，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認(rèn)為其有護(hù)心、護(hù)肝、保腦等作用。研究［4］稱(chēng)，該藥物能減輕創(chuàng)傷性腦損傷大鼠心肌炎心肌酶譜等指標(biāo)。報(bào)道則稱(chēng)，異甘草素有明顯保護(hù)神經(jīng)作用，能抗炎、抗氧化、抗細(xì)胞凋亡和抗膽堿酯酶、環(huán)磷酸腺苷磷酸二脂酶等?，F(xiàn)代藥理學(xué)認(rèn)為，此藥有較好的抗氧化活性和減少活性氧作用，能降低CASPAS-3表達(dá)，提高組織BACL-2表達(dá)，減少鈣離子聚集，保護(hù)腦皮層細(xì)胞，對(duì)神經(jīng)退變有很好作用，且能調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝，信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，蛋白質(zhì)折疊和運(yùn)輸，能降低可卡因誘導(dǎo)神經(jīng)元毒性作用保護(hù)腦組織［5］。結(jié)果顯示，異甘草素能增加創(chuàng)傷性腦外傷SOD活性，減少M(fèi)DA生成，降低腦組織含水量，且在抑制炎癥因子上也有明顯效果，能促進(jìn)創(chuàng)面愈合，促進(jìn)神經(jīng)元生長(zhǎng)和改善神經(jīng)行為學(xué)作用。和報(bào)道［6］的稱(chēng)其組方中的甘草能抑制COX-2等基因表達(dá)并抑制MAPK通路激活，對(duì)大腦中動(dòng)脈大鼠具有神經(jīng)保護(hù)作用，能提高SOD、CAT活性，抑制MDA等活性，減少大鼠腦組織缺血再灌注損傷等，和本次研究中結(jié)果是一致的，這再次證實(shí)了異甘草素在創(chuàng)傷性腦外傷上的效果是顯著有效的，特別是保護(hù)神經(jīng)功能上。

研究［7-8］還稱(chēng)，異甘草素還具有抗脂質(zhì)過(guò)氧化、松弛血管，能抑制血小板聚集、抗病毒和抗腫瘤，雌激素樣活性和抗細(xì)胞凋亡等多種藥理作用，而結(jié)果看出，在炎癥因子IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α上有明顯變化，這是因?yàn)樵撍幬锬艽龠M(jìn)血管通透性，促進(jìn)氧自由基釋放，且研究［9-10］稱(chēng)該藥物能明顯抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活性，能通過(guò)神經(jīng)元存活，改善神經(jīng)功能評(píng)分。這也再次說(shuō)明了IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-10、TNF-α是進(jìn)一步激活巨噬細(xì)胞活性，會(huì)產(chǎn)生炎性代謝物質(zhì)，維持和加重炎性反應(yīng)，造成腦組織再次損傷。故在臨床上對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷要從以上病理機(jī)制著手進(jìn)行處理。

［1］ 楊永明，荔志云，季瑋，等.異甘草素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠血清細(xì)胞因子的影響［J］.神經(jīng)損傷與功能重建，2014，7（2）：108-110.

［2］ 方永奇，匡忠生，謝宇輝，等.石菖蒲對(duì)缺血再灌注腦損傷大鼠神經(jīng)細(xì)胞凋亡的影響［J］.現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志，2002，11（17）：1647-1649.

［3］ 楊永明，荔志云.異甘草素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.實(shí)用臨床醫(yī)藥雜志，2014，18（21）：1-4.

［4］ 姜拓之，楊永明，荔志云，等.異甘草素對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)保護(hù)作用的實(shí)驗(yàn)研究［J］.創(chuàng)傷外科雜志，2015，1（2）：113-116.

［5］ 劉亮亮，陳姬，張波，等.異甘草素與光甘草定抗腫瘤轉(zhuǎn)移作用比較［J］.中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2013，19（18）：245-250.

［6］ Okonkwo DO，Yue JK，Puccio AM，et al.GFAP-BDP as an acute diagnostic marker in traumatic brain injury：Resultsfrom the prospective transforming research and clinical knowledge in traumatic brain injury study［J］.Journal of neurotrauma，2013，30（17）：1490-1497.

［7］ 詹春，楊靜，詹莉，等.異甘草素對(duì)腦缺血再灌注小鼠認(rèn)知功能障礙及能量代謝的影響［J］.中國(guó)藥理學(xué)通報(bào)，2012，21（2）：213-216.

［8］ Hendén PL，S?ndergaard S，Rydenhag B，et al.Can baroreflex sensitivity and heart rate variability predict late neurological outcome in patients with traumatic brain injury［J］.Journal of neurosurgical anesthesiology，2014，26（1）：50-59.

［9］ 李婭娜，李玲，江山，等.豐富環(huán)境及康復(fù)訓(xùn)練對(duì)創(chuàng)傷性腦損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響［J］.中國(guó)康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志，2013，28（5）：393-397.

［10］劉陽(yáng)，劉衛(wèi)平，王孝安，等.神經(jīng)生長(zhǎng)因子與表皮生長(zhǎng)因子干預(yù)創(chuàng)傷性腦損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細(xì)胞的增殖［J］.中國(guó)組織工程研究，2012，16（1）：65-69.

Isoliquiritigenin Protect Basic Neurological Research Traumatic Brain Injury in Rats

DU jing，JIN Qiaoping.Central Hospital of Jinhua City in Zhejiang Province，Zhejiang，Jinhua 321000，China

Objective:To investigate isoliquiritigenin of traumatic brain injury in rats with nerve function.Methods:First，the establishment of brain injury in rats were randomly divided into sham group，brain injury group，Isoliquiritigenin group，sham operation group，brain injury group were fed with normal saline，Isoliquiritigenin groupⅠ20 mg/kg of drugs gavage treatment.One week after the death，rats were detected by ultra-manifold end peroxidase（SOD），malondialdehyde （MDA），enzyme-linked immunosorbent assay of interleukin（IL-6），tumor necrosis factor（TNF-α）content to observe the changes in these indicators.Results:Isoliquiritigenin group SOD，MDA，IL-6，TNF-α，respectively （123.77±9.35）U/mgprot，（3.27±1.15）U/mgpro，（367.69±36.13）pg/mg，（38.74±2.35）pg/mg，and the other two groups was statistically significant difference（P＜0.05）；in the tissue morphology，the number of tumor cells in the brain showed significantly increased cortical injury，wound granulation tissue filled，pia mater had been formed，and and normal brain tissue into the meninges phase continued，cross narrow translucent edema，edema lesions confined to the bottom of the injury.And other differences were statistically significant（P＜0.05）.Conclusion:Isoliquiritigenin can protect nerve injury in rats with traumatic brain function，which may be related to reducing oxidative stress and regulating brain cytokines.

Isoliquiritigenin；Traumatic brain injury；Rat；neurological

285.5

A

1004-745X（2015）08-1362-03

10.3969/j.issn.1004-745X.2015.08.018

2015-04-17）

浙江省金華市科技研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2013-3-002）