頭孢地尼膠囊在健康人體的生物等效性研究

陳芬，朱超然，翟學(xué)佳，馮霞，鄧桂萍，郭卿，蔣立芬，呂永寧

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢 430022；2.石家莊市華新藥業(yè)有限責(zé)任公司，石家莊 050091；3.河北省人民醫(yī)院體檢中心，石家莊 050051)

頭孢地尼膠囊在健康人體的生物等效性研究

陳芬1，朱超然1，翟學(xué)佳1，馮霞1，鄧桂萍1，郭卿2，蔣立芬3，呂永寧1

(1.華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院附屬協(xié)和醫(yī)院藥劑科，武漢 430022；2.石家莊市華新藥業(yè)有限責(zé)任公司，石家莊 050091；3.河北省人民醫(yī)院體檢中心，石家莊 050051)

目的 評價健康人餐后服用兩種頭孢地尼膠囊的生物等效性。方法 24例男性健康志愿者餐后隨機(jī)交叉單劑量口服頭孢地尼膠囊受試制劑或參比制劑，頭孢地尼體內(nèi)血藥濃度采用液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)(LC-MS/MS)法測定，藥動學(xué)參數(shù)及等效性采用藥動學(xué)軟件DAS計算和評價。結(jié)果 受試制劑和參比制劑的主要藥動學(xué)參數(shù)如下：AUCt分別為(4.35±1.09)和(4.12±1.22) μg·h·mL-1，AUC0-∞分別為(4.53±1.12)和(4.53±1.73)μg·h·mL-1，t1/2分別為(1.74±0.29)和(2.13±1.65) h，tmax分別為(4.44±0.86)和(4.54 土1.16) h，Cmax分別為(900±250)和(876±269) ng·mL-1。結(jié)論 頭孢地尼膠囊受試制劑與參比制劑具有生物等效性。

頭孢地尼膠囊；液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)聯(lián)用；藥動學(xué)；生物等效性

頭孢地尼是第3代頭孢菌素類抗菌藥物，1988年由日本藤澤藥品工業(yè)公司合成，1991年在日本上市，1997年被美國食品藥品管理局(FDA)批準(zhǔn)臨床使用[1]。頭孢地尼對革蘭陰性菌和革蘭陽性菌均具有廣泛的抗菌譜，其抗菌機(jī)制主要是抑制細(xì)菌細(xì)胞壁合成，并且對各種細(xì)菌產(chǎn)生的β-內(nèi)酰胺酶穩(wěn)定，因而對可產(chǎn)生β-內(nèi)酰胺酶的細(xì)菌也具有優(yōu)異的抗菌活性[2]。頭孢地尼對革蘭陽性菌中的葡萄菌屬、鏈球菌屬等的抗菌活性比以往的口服頭孢菌素更強(qiáng)[3]。筆者在本試驗采用液相色譜-質(zhì)譜串聯(lián)聯(lián)用(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry，LC-MS/MS)法測定血漿頭孢地尼濃度，研究受試制劑和參比制劑頭孢地尼膠囊在健康志愿者體內(nèi)的餐后藥動學(xué)和生物等效性，以期為臨床用藥提供參考。

1 試藥與儀器

1.1 試藥 受試制劑：頭孢地尼膠囊，批號：310130107，規(guī)格：每粒0.1 g，石家莊市華新藥業(yè)有限責(zé)任公司；參比制劑：頭孢地尼膠囊(商品名：全澤復(fù)，批號：023730，規(guī)格：每粒0.1 g，日本藤澤藥品工業(yè)公司)；頭孢地尼對照品(批號：30502-201002，中國食品藥品檢定研究院，含量：95.6%)。頭孢克洛對照品(內(nèi)標(biāo))(批號：130481-200503，中國食品藥品檢驗研究院，含量：93.2%)。

1.2 儀器 高效液相色譜儀器：安捷倫1200液相色譜儀，含G1322A在線脫氣機(jī)、G1311A高壓四元泵、G1329A自動進(jìn)樣器、G1316A柱溫箱。質(zhì)譜儀器：API 4000 LC-MS/MS System，配備電噴霧離子化源(ESI)，美國ABI公司。色譜工作站：Analyst 1.5。Shimadzu電子分析天平(AUW220D，日本島津公司，感量：0.1/0.01 mg)、LEGEND MICRO 21R臺式高速離心機(jī)(武漢赤誠生物技術(shù)有限公司)、 XW-80A微型旋渦混和儀(上海瀘西分析儀器廠)。

2 方法與結(jié)果

2.1 研究對象 24例受試者均為男性，年齡(22.13±1.48)歲，身高 (173.58±5.42) cm，體質(zhì)量(65.04±6.52)kg，體重指數(shù)為(21.56±1.51) kg·(m2)-1，試驗前血常規(guī)、尿常規(guī)、肝功能、腎功能、乙型肝炎、丙型肝炎、人類免疫缺陷病毒抗體檢測、心電圖檢查等均正常，無心、肝、腎、代謝異常等病史，無慢性胃腸道疾病，無藥物過敏史及藥物依賴史，無精神病史，不嗜煙酒，試驗前2周內(nèi)及試驗期間均未服用任何藥物。本試驗方案通過華中科技大學(xué)同濟(jì)醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會審查。試驗前受試者在了解本項研究的目的、意義、步驟、利益和可能發(fā)生的損害后簽署知情同意書。

2.2 給藥方案與血樣采集 本試驗采用雙周期自身交叉對照試驗設(shè)計。24例受試者隨機(jī)分為兩組，每組每次試驗餐后單次口服受試制劑或參比制劑，兩次試驗間的清洗期為7 d。受試者于前1天入住，晚上統(tǒng)一清淡飲食，禁食10 h、不禁水過夜。次日早晨吃標(biāo)準(zhǔn)早餐。早餐包括饅頭約100 g、稀飯約150 mL及用菜籽油約20 mL烹飪的豬肉75 g(肥瘦比為2：1)，煎蛋1枚和蔬菜100 g。吃完早餐半小時后，飲水200 mL服受試制劑或參比制劑1粒。服藥后2 h方再飲水，4 h內(nèi)不得躺下，以免影響胃腸蠕動，4和10 h統(tǒng)一進(jìn)餐，并按試驗方案在服藥前后不同時間采取血樣，密切觀察。受試者在試驗當(dāng)日不得離開監(jiān)護(hù)室內(nèi)，禁止劇烈運(yùn)動、吸煙、飲酒等。

采血時間點為服藥前(0 h)和服藥后1，2，3，3.5，4，4.5，5，5.5，6，7，8，10，12 h。每次經(jīng)肘靜脈取血4 mL置于含乙二胺四醋酸(EDTA)的抗凝管中，血樣30 min內(nèi)900×g離心10 min，分離血漿，置-80 ℃冰箱備用。

2.3 方法學(xué)考察與評價

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Waters Atlantis?d C18色譜柱 (2.1 mm×150 mm，5 μm)；預(yù)柱：C18保護(hù)柱(4 mm×3.0 mm，美國Phenomenex公司)；流動相：甲醇-0.3%甲酸水溶液=(38：62)；流速：0.3 mL·min-1；進(jìn)樣量：10 μL；柱溫：40 ℃；進(jìn)樣器溫度：4 ℃。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子檢測方式：選擇性離子檢測(MRM)；離子極性：正離子；離子化方式：氣動輔助電噴霧離子化(ESI)；檢測對象：頭孢地尼，[M+H]+離子對m/z396.1→227.1，頭孢克洛，[M+H]+離子對m/z368.0→174.2；DP電壓：頭孢地尼為60.00 V，頭孢克洛為69.00 V；CE電壓：頭孢地尼為19.00 V，頭孢克洛為18.00 V；EP電壓：頭孢地尼為10.00 V，頭孢克洛為10.00 V；CXP電壓：頭孢地尼為12.00 V，頭孢克洛為4.00 V；IS：5 500 V；CUR：172.375 kPa；CAD：41.370 kPa；溫度：550 ℃；GAS1：344.750 kPa；GAS2：344.750 kPa。

2.3.3 血漿樣品處理 精密吸取血漿200 μL至1.5 mLEP管中，加入10 mmol·L-1乙酸銨水溶液20 μL，加入內(nèi)標(biāo)溶液(5 280 ng·mL-1)20 μL，渦旋20 s，再加入甲醇500 μL，渦旋1 min，14 800 r·min-1離心15 min(有效離心半徑8.5 cm)，取上清液200 μL于另一1.5 mL EP管中，用等量10 mmol·L-1乙酸銨水溶液稀釋，渦旋20 s后，14 800 r·min-1離心5 min，取上清液200 μL于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣10 μL進(jìn)行分析，并記錄色譜圖。

2.3.4 特異性 本試驗在上述色譜條件下，頭孢地尼及內(nèi)標(biāo)的保留時間分別為2.6和2.8 min。頭孢地尼和內(nèi)標(biāo)峰形良好，與空白血漿樣品的色譜圖進(jìn)行比較，出峰位置無雜峰干擾測定(圖1～3)，說明本方法具有較高的特異性，能準(zhǔn)確測定血漿頭孢地尼濃度。

2.3.5 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 精密吸取空白血漿200 μL，加各系列的標(biāo)準(zhǔn)溶液20 μL，配制成濃度分別為10.14，50.7，126.75，253.5，430.95，887.25，1 267.5 ng·mL-1的頭孢地尼血漿樣品，按“血漿樣品處理”項下，自“加入內(nèi)標(biāo)工作液20 μL”起同法操作，記錄色譜圖；以待測物濃度(C)為橫坐標(biāo)，待測物與內(nèi)標(biāo)物的峰面積比值(f)為縱坐標(biāo)，用加權(quán)(W=1/x2)最小二乘法進(jìn)行回歸運(yùn)算，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=0.004 84X+0.029 6(r=0.999 2)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程，本分析方法下頭孢地尼的線性范圍應(yīng)為10.14～1 267.5 ng·mL-1。

2.3.6 殘留效應(yīng) 在測定定量上限(ULOQ)樣本之后測定1個空白血漿樣本和1個定量下限(LLOQ)樣本。上述測定流程重復(fù)3次。殘留效應(yīng)因子為上述空白血漿樣本中分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積除以定量下限樣本中分析物和內(nèi)標(biāo)的峰面積(3個樣本平均峰面積)。頭孢地尼和內(nèi)標(biāo)的殘留效應(yīng)因子分別為10.7%和0%。結(jié)果表明，內(nèi)標(biāo)無殘留效應(yīng)，頭孢地尼殘留效應(yīng)在可接受范圍內(nèi)。

2.3.7 基質(zhì)效應(yīng) 精密吸取空白血漿樣品200 μL，共計12份，置于1.5 mL EP管中，加入10 mmol·L-1乙酸銨溶液20 μL，加甲醇500 μL，渦旋1 min，于14 800r·min-1離心15 min，分別吸取各管全部上清液作為基質(zhì)，加入內(nèi)標(biāo)溶液20 μL，每6份分別加入低濃度(30 ng·mL-1)和高濃度(1 000 ng·mL-1)的2個濃度的QC溶液渦旋20 s，然后取200 μL于另一1.5 mL EP管中，加入等量的 10 mmol·L-1乙酸銨水溶液稀釋，渦旋20 s后，于14 800 r·min-1離心5 min，取上清液200 μL于進(jìn)樣瓶中，進(jìn)樣10 μL，獲得相應(yīng)峰面積。同時另取200 μL的10 mmol·L-1乙酸銨溶液代替空白血漿，按上述處理，獲得相應(yīng)的峰面積，每一濃度進(jìn)行3樣本分析。以每一濃度兩種處理方法的峰面積比值計算基質(zhì)效應(yīng)。計算得到血漿中內(nèi)源性物質(zhì)對低、高2個濃度血漿樣本中頭孢地尼的基質(zhì)效應(yīng)因子分別為(67.20±5.82)%和(53.37±7.90)%，內(nèi)標(biāo)頭孢克洛的基質(zhì)效應(yīng)因子為(69.95±11.25)%。經(jīng)內(nèi)標(biāo)歸一化后低、高2個濃度基質(zhì)效應(yīng)因子CV為6.88%和5.27%，均在15%之內(nèi)。

A.頭孢地尼；B.頭孢克洛

圖2 受試者空白血漿加入頭孢地尼溶液(A)和內(nèi)標(biāo)工作液(B)色譜圖

Fig.2 Chromatogram of blank plasma spiked with cefdinir (A ) and internal standard (B)

A.頭孢地尼；B.頭孢克洛

圖3 受試者第1周期口服頭孢地尼膠囊0.1 g后3.5 h血漿樣品色譜圖

Fig.3 Chromatogram of plasma sample of the volunteer 3.5 h after oral administration of 0.1 g cefdinir at the first cycle

2.3.8 準(zhǔn)確度與精密度 按“血漿樣本處理”項操作，處理定量下限(10 ng·mL-1)、低(30 ng·mL-1)、中(300 ng·mL-1)、高(1 000 ng·mL-1)4個濃度的QC樣本，每濃度平行6個，測定分析批3個，QC樣本的濃度以同一分析批的標(biāo)準(zhǔn)曲線計算，根據(jù)測定結(jié)果計算方法的準(zhǔn)確度與精密度。定量下限測定的濃度與理論濃度不超過±20%。低、中、高濃度QC樣本測定濃度與理論濃度的RE均不超過±15%，各濃度QC樣本的平均測定濃度與理論濃度的RE均不超過±15%，且批內(nèi)、批間RSD均不大于15%。

2.3.9 提取回收率 從血漿基質(zhì)中回收得到的分析物的色譜峰面積與分析物純標(biāo)準(zhǔn)品的峰面積之比為樣品的提取回收率。本實驗考察頭孢地尼低、中、高濃度的QC樣本和內(nèi)標(biāo)的提取回收率。低、中、高濃度血漿樣本中頭孢地尼的提取回收率分別為(93.79±2.57)%，(77.38±4.91)%和(81.46±4.82)%；血漿樣本中內(nèi)標(biāo)頭孢克洛的提取回收率為(78.10±1.00)%。

2.3.10 穩(wěn)定性試驗 分別考察血漿樣本室溫放置2 h穩(wěn)定性(RSD≤3.27%)，血漿樣本處理后進(jìn)樣器放置22 h穩(wěn)定性(RSD≤4.35%)，血漿樣本反復(fù)凍融3次穩(wěn)定性(RSD≤1.9%)，血漿樣本凍存30 d穩(wěn)定性(RSD≤8.50%)。結(jié)果表明含頭孢地尼的血漿樣品穩(wěn)定性良好。

2.4 血藥濃度-時間曲線 24例健康男性受試者餐后單次口服受試制劑和參比制劑后，血漿頭孢地尼濃度-時間曲線見圖4。

2.5 藥動學(xué)參數(shù) 經(jīng)DAS3.2.1版軟件計算求得24例健康受試者餐后單次口服頭孢地尼受試制劑和參比制劑后，血漿頭孢地尼的藥動學(xué)參數(shù)見表1。受試制劑與參比制劑各藥動學(xué)參數(shù)采用t檢驗進(jìn)行比較，結(jié)果差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。

圖4 24例健康受試者口服參比制劑和受試制劑后血漿頭孢地尼平均濃度-時間曲線

Fig 4 Average plasma concentration-time curve after oral administration of reference and test preparation in 24 healthy volunteers

表1 24例健康受試者單次口服頭孢地尼受試制劑和參比制劑的藥動學(xué)參數(shù)

藥物AUC0-tAUC0-∞(μg·h·mL-1)參比制劑4.12±1.224.53±1.73受試制劑4.35±1.094.53±1.12藥物Cmax/(ng·mL-1)tmaxt1/2h參比制劑876±2694.54±1.162.13±1.65受試制劑900±2504.44±0.861.74±0.29

2.6 生物等效性分析 將對數(shù)轉(zhuǎn)化后的受試制劑和參比制劑的平均藥動學(xué)參數(shù)Cmax、AUC0-t、AUC0-∞進(jìn)行方差分析，采用雙向單側(cè)t檢驗及[1-2ɑ]%置信區(qū)間法進(jìn)行生物等效性評價，其中tmax采用非參數(shù)法(Wilcoxon秩和檢驗)檢驗。結(jié)果表明，Cmax、AUC0-t、AUC0-∞均拒絕生物不等效假設(shè)；受試制劑經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后的Cmax的90%置信區(qū)間為95.4%～111.5%，在參比

制劑的70%～145%內(nèi)，受試制劑經(jīng)對數(shù)轉(zhuǎn)換后的AUC0-t和AUC0-∞的90%置信區(qū)間為100.6%～113.3%和94.6%～112.2%，均在參比制劑的80%～125%內(nèi)，且受試制劑與參比制劑的tmax經(jīng)非參數(shù)法檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。表明餐后口服受試制劑和參比制劑具有生物等效性。

3 討論

本試驗參考國內(nèi)外文獻(xiàn)[1，4-7]，建立LC-MS/MS的檢測方法，頭孢地尼和頭孢克洛(內(nèi)標(biāo))保留時間均<3 min，樣品分析時間短，靈敏度高，定量下限達(dá)到10 ng·mL-1，且專屬性強(qiáng)。本試驗采用甲醇沉淀蛋白法處理血漿樣品，方法簡單、快速、成本低。試驗過程中發(fā)現(xiàn)，如果用甲醇沉淀后上清液直接進(jìn)樣靈敏度低，定量下限達(dá)不到10 ng·mL-1，而乙酸銨溶液能提高頭孢地尼的檢測靈敏度，甲醇沉淀蛋白后的上清液用10 mmol·L-1乙酸銨溶液稀釋1倍后進(jìn)樣檢測，靈敏度大大提高。這可能是因為頭孢地尼極性較大，用乙酸銨溶液稀釋更加利于頭孢地尼的離子化，從而提高頭孢地尼的檢測靈敏度。

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Study on Bioequivalence of Cefdinir Capsules in Chinese Healthy Volunteers

CHEN Fen1, ZHU Chaoran1, ZHAI Xuejia1, FENG Xia1, DENG Guiping1, GUO Qing2, JIANG Lifen3, LYU Yongning1

(1.DepartmentofPharmacy,UnionHospital,TongjiMedicalCollege,HuazhongUniversityofScienceandTechnology,Wuhan430030,China；2.ShijiazhuangHuaxinPharmaceuticalCo.,Ltd,Shijiazhuang050091,China；3.MedicalExaminationCenterofHebeiGeneralHospital,Shijiazhuang050051,China)

Objective To evaluate postprandial pharmacokinetics and bioequivalence of two preparations of cefdinir capsules in Chinese healthy volunteers. Methods In a two-way cross-over study, 24 healthy male volunteers were divided into two groups randomly and a single dose of cefdinir capsules of test and reference preparation were administered orally, respectively.The concentration in plasma was determined by LC-MS/MS.Pharmacokinetic parameters and bioequivalence were calculated and evaluated by DAS. Results The main pharmacokinetic parameters of test and reference were as follows: AUCt(4.35±1.09) μg·h·mL-1and (4.12±1.22) μg·h·mL-1, AUC0-∞(4.53±1.12) and (4.53±1.73) μg·h·mL-1,t1/2(1.74±0.29) h and (2.13±1.65) h,tmax(4.44±0.86) h and (4.54 土1.16) h,Cmax(900±250) ng·mL-1and (876±269) ng·mL-1. Conclusion The test and reference preparation of cefdinir capsules are bioequivalent.

Cefdinir capsules；Liquid chromatography-tandem mass spectrometry；Pharmacokinetics；Bioequivalence

2014-06-12

2014-08-31

陳芬(1990-)，女，湖北武漢人，碩士，研究方向：藥動學(xué)及藥物相互作用。電話：027-85726073，E-mail：1053228154@qq.com。

呂永寧(1967-)，男，副主任藥師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：藥動學(xué)及藥物相互作用。電話：027-85726073，E-mail：lvyongning67@hotmail.com。

R978.11；R969.1

A

1004-0781(2015)10-1288-04

10.3870/j.issn.1004-0781.2015.10.006