吡格列酮抑制心房肌細胞腫脹激活性氯電流通道重構(gòu)的實驗研究

宋芝萍 顧 俊 胡 偉 劉 旭

吡格列酮抑制心房肌細胞腫脹激活性氯電流通道重構(gòu)的實驗研究

宋芝萍 顧 俊 胡 偉 劉 旭

目的：探討過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)激動劑吡格列酮對血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)誘導(dǎo)的心房肌細胞腫脹激活性氯電流(ICl, swell)通道重構(gòu)的干預(yù)作用及相關(guān)機制。 方法：以體外培養(yǎng)的心房肌細胞系HL-1為研究對象，分為對照組、Ang Ⅱ組、Ang Ⅱ+吡格列酮組、Ang Ⅱ+夾竹桃麻素組。采用分光光度法測定細胞內(nèi)活性氧(ROS)水平和還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)活性，全細胞膜片鉗檢測ICl密度。 結(jié)果：與對照組相比，Ang Ⅱ組ICl密度增高，伴有ROS產(chǎn)生明顯增多及NOX活性升高；吡格列酮或夾竹桃麻素預(yù)處理可明顯抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的上述效應(yīng) (P均<0.05)。 結(jié)論：吡格列酮可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的ICl重構(gòu)，其機制可能與抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)有關(guān)。

心房重構(gòu)；血管緊張素Ⅱ；過氧化物酶體增殖物激活受體γ；氧化應(yīng)激

心房電重構(gòu)是心房顫動(房顫)發(fā)生、發(fā)展的重要因素，其中心房肌細胞離子通道重構(gòu)起重要作用[1-3]。腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)(RAAS)在心房電重構(gòu)中發(fā)揮重要作用，血管緊張素Ⅱ(Ang Ⅱ)可導(dǎo)致L型鈣離子通道電流(ICa-L)、瞬時外向鉀離子通道電流(Ito)、起搏電流(If)密度及相應(yīng)通道蛋白表達異常[3-5]。近年研究發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ引起的腫脹激活性氯電流(ICl, swell)明顯活化，是心房電重構(gòu)的重要組成部分[6]。ICl活化后導(dǎo)致動作電位時程及有效不應(yīng)期縮短、折返波長縮短，使折返易于形成和維持，造成房顫的發(fā)生及發(fā)展[4]。

過氧化物酶體增殖物激活受體γ(PPARγ)激動劑在房顫和心房重構(gòu)防治方面的潛在應(yīng)用價值被廣泛關(guān)注。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動劑吡格列酮可拮抗Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心房肌細胞ICa-L重構(gòu)[7]。本研究擬進一步研究吡格列酮對Ang Ⅱ誘導(dǎo)的ICl通道重構(gòu)的作用及相關(guān)機制。

1 材料和方法

1.1 細胞培養(yǎng)

小鼠心房肌細胞系HL-1由美國William C. Claycomb教授饋贈，用含10%胎牛血清的Claycomb培養(yǎng)液培養(yǎng)。分組前HL-1細胞經(jīng)無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，使細胞狀態(tài)同步化，隨后分為4組。(1)對照組：不加特殊處理；(2)Ang Ⅱ組：用Ang Ⅱ 1 μmol/L (Sigma公司)刺激24 h；(3)Ang Ⅱ+吡格列酮組：預(yù)先用吡格列酮10 μmol/L(Sigma公司)干預(yù)1 h，再加入Ang Ⅱ 1 μmol/L刺激24 h；(4)Ang Ⅱ+夾竹桃麻素組：預(yù)先用還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶(NOX)抑制劑夾竹桃麻素100 μmol/L(Sigma公司)干預(yù)1 h，再加入Ang Ⅱ 1 μmol/L刺激24 h 。

1.2 細胞內(nèi)活性氧(ROS)檢測

各組細胞分別經(jīng)過不同干預(yù)后，用D-Hank緩沖液清洗1次，然后加入10 μmol/L 的H2DCF-DA(Molecular Probes公司)，37℃避光孵育30 min，然后用D-Hank緩沖液清洗3次，用RF-4000熒光分光光度儀檢測熒光強度(激發(fā)波長485 nm，發(fā)散波長535 nm)。

1.3 NOX活性檢測

收集各組細胞，加入細胞裂解液，4℃離心收集上清，用BCA法進行蛋白定量，嚴格按照NOX檢測試劑盒(上海杰美基因醫(yī)藥科技有限公司)說明書操作，于550 nm波長處連續(xù)記錄A值，計算出的結(jié)果用蛋白濃度標化。

1.4 全細胞膜片鉗實驗

用胰酶消化各組細胞，吸取少許細胞懸液置于倒置顯微鏡操作平臺上的記錄槽中，待細胞沉淀后連續(xù)灌流電極外液1～1.5 ml/min。玻璃記錄槽中溶液量維持在0.6 ml。用拉制儀制作玻璃電極并對電極尖端進行拋光；當電極內(nèi)充滿電極內(nèi)液時電阻約為3～5 MΩ。適當負壓吸引，使電極與單個細胞形成緊密封接，直到封接電阻≥1 GΩ，繼續(xù)負壓吸引使電極尖端穿破細胞膜，補償電容電流和電極串聯(lián)電阻，形成全細胞膜片鉗的模式。使用電壓鉗模式記錄通道電流，鉗制電壓-40 mV，以消除鈉電流的影響。每次從鉗制電壓躍至刺激電壓，持續(xù)300 ms，再恢復(fù)至鉗制電壓，刺激電壓從-60 mV到+60 mV，步階為10 mV。

通道信號經(jīng)EPC-10膜片鉗放大器(HEKA公司)放大，產(chǎn)生的電流信號經(jīng)EPC-10轉(zhuǎn)換，經(jīng)pulse+pulsefit軟件(version 8.53, HEKA公司)收集、分析，再采用Igor Pro分析軟件(version 3.31)將圖形進行擬合。所有實驗在室溫(25℃)下進行。為減少細胞大小給結(jié)果造成誤差，電流大小用電流密度(pA/pF)表示。

1.5 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析，用均數(shù)±標準差表示。組間比較用單因素方差分析(ANOVA),P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有高度顯著性差異。所有實驗均至少重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 ROS產(chǎn)生情況

與對照組相比，Ang Ⅱ組ROS產(chǎn)生明顯增多；經(jīng)吡格列酮或夾竹桃麻素預(yù)處理1 h后，可明顯抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的ROS產(chǎn)生 (P均<0.05，見表1)；Ang Ⅱ+吡格列酮組與Ang Ⅱ+夾竹桃麻素組間ROS表達無顯著差異。

表1 各組ROS、 NOX活性及ICl密度的比較

2.2 NOX活性

與對照組相比，Ang Ⅱ組NOX活性明顯增高；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+吡格列酮組及Ang Ⅱ+夾竹桃麻素組的NOX活性明顯降低(P均<0.05，見表1) ；Ang Ⅱ+吡格列酮組與Ang Ⅱ+夾竹桃麻素組間NOX活性無顯著差異。

2.3 ICl密度

與對照組相比，Ang Ⅱ組ICl密度明顯增加；與Ang Ⅱ組相比，Ang Ⅱ+吡格列酮組或Ang Ⅱ+夾竹桃麻素組ICl密度明顯減弱 (P均<0.05，見表1、圖1) ；Ang Ⅱ+吡格列酮組與Ang Ⅱ+夾竹桃麻素組間ICl密度無顯著差異。

圖1 心房肌細胞ICl I-V 曲線變化

3 討論

心房重構(gòu)是房顫發(fā)生、維持的基礎(chǔ)，包括電重構(gòu)和結(jié)構(gòu)重構(gòu)[1-3]。心房電重構(gòu)表現(xiàn)為心房有效不應(yīng)期縮短，同時P波時程增加、心房不應(yīng)期離散度增加。研究表明，心房不應(yīng)期縮短主要與ICa-L和ICl等離子通道重構(gòu)有關(guān)[1-4]。心房不應(yīng)期縮短有利于心房內(nèi)多折返波的生成，促進房顫發(fā)生和維持。

RAAS是機體重要的神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)，主要參與機體體液平衡和電解質(zhì)調(diào)節(jié)。大量研究證實，房顫時存在不同程度的RAAS激活。Ang Ⅱ可引起ICl、ICa-L、Ito、If密度及相應(yīng)通道蛋白表達異常，并可影響心肌縫隙連接蛋白的表達和分布[3-5,8]。在快速心房起搏的犬模型中，血管緊張素受體阻斷劑(ARB)可以抑制心房有效不應(yīng)期的縮短，說明在快速心房起搏期間，阻斷Ang Ⅱ的作用能夠預(yù)防心房電重構(gòu)的發(fā)生[9]。

研究發(fā)現(xiàn)，Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心房肌細胞內(nèi)ICl重構(gòu)的同時，伴有ROS產(chǎn)生和NOX活性增加； NOX抑制劑夾竹桃麻素則能顯著抑制上述改變。Ang Ⅱ誘導(dǎo)的心房肌細胞內(nèi)ICl重構(gòu)依賴于NOX途徑[6]。

PPARγ激動劑在房顫防治方面具有潛在應(yīng)用價值。對充血性心力衰竭兔模型的研究發(fā)現(xiàn)，PPARγ激動劑可縮短房顫持續(xù)時間，減輕心房纖維化程度，同時可降低轉(zhuǎn)化生長因子-β1、腫瘤壞死因子-α的表達，還可抑制壓力負荷升高導(dǎo)致的心房纖維化[12-13]。PPARγ激動劑吡格列酮可降低高血壓大鼠體內(nèi)的氧化應(yīng)激水平，也可抑制Ang Ⅱ誘導(dǎo)的小鼠平滑肌細胞氧化應(yīng)激[14-15]。臨床研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病患者服用PPARγ激動劑能減少新發(fā)房顫[10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，吡格列酮可改善陣發(fā)性房顫合并2型糖尿病患者導(dǎo)管消融術(shù)臨床預(yù)后，減少房顫復(fù)發(fā)[11]。

本研究中，Ang Ⅱ可引起ICl密度明顯增加，伴有NOX活化和ROS生成增加。應(yīng)用NOX抑制劑夾竹桃麻素后，Ang Ⅱ的效應(yīng)被明顯逆轉(zhuǎn)，吡格列酮可產(chǎn)生與夾竹桃麻素相近的效果，即降低ICl密度、抑制NOX活化和ROS生成。這可能是PPARγ激動劑改善心房電重構(gòu)的機制之一。

氧化應(yīng)激在Ang Ⅱ?qū)е碌男姆考〖毎鸌Cl重構(gòu)中具有重要作用。Ang Ⅱ可能通過活化NOX增加心房肌細胞ROS生成，從而激活I(lǐng)Cl通道。PPARγ激動劑吡格列酮可能通過抗氧化效應(yīng)拮抗Ang Ⅱ引起的心房肌細胞ICl重構(gòu)。

[1] Iwasaki YK, Nishida K, Kato T, et al. Atrial fibrillation pathophysiology: implications for management[J]. Circulation, 2011,124(20):2264-2274.

[2] 傅青嶺,趙仙先.MicroRNA與心房顫動研究進展[J].國際心血管病雜志，2013,40(4)：193-195.

[3] Heijman J, Voigt N, Nattel S, et al. Cellular and molecular electrophysiology of atrial fibrillation initiation, maintenance, and progression[J]. Circ Res, 2014,114(9):1483-1499.

[4] Akar JG, Everett TH, Ho R, et al. Intracellular chloride accumulation and subcellular elemental distribution during atrial fibrillation[J]. Circulation, 2003,107(13):1810-1815.

[5] Tsai CT, Wang DL, Chen WP, et al. Angiotensin Ⅱ increases expression of alpha1C subunit of L-type calcium channel through a reactive oxygen species and cAMP response element-binding protein-dependent pathway in HL-1 myocytes[J]. Circ Res, 2007,100(10):1476-1485.

[6] Deng W, Baki L, Baumgarten CM. Endothelin signalling regulates volume-sensitive Cl2 current via NADPH oxidase and mitochondrial reactive oxygen species[J]. Cardiovasc Res, 2010,88(1), 93-100.

[7] Gu J, Liu X, Wang QX, et al. Beneficial effects of pioglitazone on atrial structural and electrical remodeling in vitro cellular models[J]. J Mol Cell Cardiol, 2013,65:1-8.

[8] Adam O, Lavall D, Theobald K, et al. Rac1-induced connective tissue growth factor regulates connexin 43 and N-cadherin expression in atrial fibrillation[J]. J Am Coll Cardiol, 2010,55(5):469-480.

[9] Nakashima H, Kumagai K. Reverse-remodeling effects of angiotensin Ⅱ type 1 receptor blocker in a canine atrial fibrillation model[J]. Circ J, 2007,71(12):1977-1982.

[10] Chao TF, Leu HB, Huang CC, et al. Thiazolidinediones can prevent new onset atrial fibrillation in patients with non-insulin dependent diabetes[J]. Int J Cardiol, 2012,156(2):199-202.

[11] Gu J, Liu X, Wang X, et al. Beneficial effect of pioglitazone on the outcome of catheter ablation in patients with paroxysmal atrial fibrillation and type 2 diabetes mellitus[J]. Europace, 2011;13(9):1256-1261.

[12] Shimano M, Tsuji Y, Inden Y, et al. Pioglitazone, a peroxisome proliferator-activated receptor-gamma activator, attenuates atrial fibrosis and atrial fibrillation promotion in rabbits with congestive heart failure[J]. Heart Rhythm, 2008,5(3):451-459.

[13] Kume O, Takahashi N, Wakisaka O, et al. Pioglitazone attenuates inflammatory atrial fibrosis and vulnerability to atrial fibrillation induced by pressure overload in rats[J]. Heart Rhythm, 2011,8(2):278-285.

[14] Hernanz R, Martín A, Pérez-Girón JV, et al. Pioglitazone treatment increases COX-2-derived prostacyclin production and reduces oxidative stress in hypertensive rats: role in vascular function[J]. Br J Pharmacol, 2012,166(4):1303-1319.

[15] Marchesi C, Rehman A, Rautureau Y,et al. Protective role of vascular smooth muscle cell PPARγ in angiotensin Ⅱ-induced vascular disease[J]. Cardiovasc Res, 2013,97(3):562-570.

(收稿：2014-07-10 修回：2014-12-05)

(本文編輯：梁英超)

Experimental studies on the inhibitory effects of pioglitazone on swelling-activated chloride current remodeling

SONGZhiping1,GUJun1,HUWei1,LIUXu2.

1.DepartmentofCardiology,ShanghaiMinhangDistrictCentralHospital,Shanghai200100,China; 2.DepartmentofCardiology,ShanghaiChestHospital,ShanghaiJiaotongUniversity,Shanghai200030,China

Objective:To investigate the effects of peroxisome proliferators-activated receptor γ(PPARγ)agonist pioglitazone on angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ)-induced remodeling of swelling-activated chloride current (ICl, swell) and the related mechanism. Methods:HL-1 cells, a mouse atrial myocyte line, were divided into 4 groups: control group, Ang Ⅱ group, Ang Ⅱ + pioglitazone group and Ang Ⅱ+ apocynin group. The level of reactive oxygen species (ROS) and activity of NADPH oxidase (NOX) were determined by spectrophotometry, and the ICldensity was evaluated by whole cell patch clamp. Results:Compared with control group, ICldensity in Ang Ⅱ group was significantly up-regulated accompanied by increased ROS level and NOX activity, and pretreatment with pioglitazone or apocynin inhibited aforementioned effects of Ang Ⅱ (P<0.05). Conclusion:Pioglitazone can mitigate Ang Ⅱ-induced IClremodeling probably by blocking oxidative stress.

Atrial remodeling; Angiotensin Ⅱ; Peroxisome proliferators-activated receptor γ; Oxidative stress

上海市醫(yī)學(xué)重點?？平ㄔO(shè)計劃項目(ZK2012A24)；中國醫(yī)師協(xié)會房顫專項基金項目(2013-2-12)；上海市科委醫(yī)學(xué)引導(dǎo)項目(14411972900)；上海市閔行區(qū)科委項目(2012MHZ072)

201100 上海市閔行區(qū)中心醫(yī)院心內(nèi)科(宋芝萍,顧 俊,胡 偉)；200030 上海交通大學(xué)附屬胸科醫(yī)院心內(nèi)科(劉 旭)

顧 俊，Email: forrestgu@126.com

10.3969/j.issn.1673-6583.2015.01.015