山羊副流感病毒3型JS2013分離株對(duì)豚鼠致病性的研究

王鐘毓，李文良，郝 飛，毛 立，楊蕾蕾，張紋紋，江杰元

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014）

山羊副流感病毒3型JS2013分離株對(duì)豚鼠致病性的研究

王鐘毓，李文良，郝 飛，毛 立，楊蕾蕾，張紋紋，江杰元?

（江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所，江蘇 南京 210014）

為了探究CPIV3 JS2013分離株的致病性，本試驗(yàn)采用豚鼠研究該病毒在動(dòng)物體內(nèi)的復(fù)制及機(jī)體組織病理?yè)p傷等情況。結(jié)果表明，攻毒后2 d攻毒組的豚鼠開(kāi)始出現(xiàn)臨床癥狀。RT-PCR檢測(cè)攻毒后第3～7天出現(xiàn)病毒血癥，攻毒后第3～14天均可以從肺組織中檢測(cè)到病毒。剖檢觀察攻毒組豚鼠，豚鼠肺出現(xiàn)實(shí)變、淤血、腫大，病理組織學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)攻毒組豚鼠肺組織出現(xiàn)肺泡間隔增寬、肺泡融合、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等變化。HI試驗(yàn)表明豚鼠感染后第5天開(kāi)始出現(xiàn)血凝抑制抗體，之后持續(xù)升高至21 d仍保持較高的水平。

CPIV3；致病性；豚鼠

副流感病毒3型（parainfluenza virus type 3，PIV3）是副黏病毒科（Paramyxoviridae）副黏病毒亞科（Paramyxovirinae）呼吸道病毒屬（Respirovirus）的單股負(fù)鏈RNA病毒，是人和動(dòng)物呼吸道重要病原。其成員包括人副流感病毒1型和3型（HPIV1、 HPIV3）、仙臺(tái)病毒、牛副流感病毒3型（BPIV3）。2014年本實(shí)驗(yàn)室從表現(xiàn)為嚴(yán)重呼吸道癥狀的山羊臨床病料中首次成功分離鑒定出一株山羊源副流感病毒3型，通過(guò)基因組測(cè)序，病原學(xué)特性研究證實(shí)其不同于其他副流感病毒3型，將其命名為山羊副流感病毒3型（Caprine parainfluenza virus type 3，CPIV3）。PIV3廣泛存在于自然界，可引起各年齡階段兒童或幼齡哺乳動(dòng)物發(fā)病，導(dǎo)致小兒或幼齡動(dòng)物輕重不等的呼吸道感染，如感冒、咳嗽、重癥喉氣管支氣管炎、毛細(xì)支氣管炎和肺炎。已有研究報(bào)道豚鼠作為動(dòng)物模型研究人副流感病毒3型和牛副流感病毒3型感染后呼吸道反應(yīng)性和氣道炎癥，因此本研究使用豚鼠研究CPIV3 JS2013株的致病性，探尋豚鼠作為CPIV3試驗(yàn)動(dòng)物感染模型的可能性，為今后進(jìn)一步研究CPIV3感染過(guò)程提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 病毒與試劑 CPIV3 JS2013分離株由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定，將CPIV3 JS2013毒株接種MDBK細(xì)胞進(jìn)行兩次蝕斑純化并連續(xù)傳代增殖培養(yǎng)。

MDBK傳代細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所；Transzol UP試劑、一步法RT-PCR試劑盒、Taq酶購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；瓊脂糖凝膠回收試劑盒購(gòu)自Axygen公司；DMEM培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自Gibco公司。

1.2 動(dòng)物分組及病毒感染程序 40只清潔級(jí)豚鼠用于本次的CPIV3 JS2013株人工感染試驗(yàn)。整個(gè)試驗(yàn)期間，所有豚鼠都被隔離培育在受控的籠子。豚鼠購(gòu)回后，先隔離飼養(yǎng)7 d左右，使其適應(yīng)新的環(huán)境，以排除應(yīng)激的因素。之后將試驗(yàn)豚鼠隨機(jī)分為兩組，一組含有16只試驗(yàn)豚鼠作為感染組（CC），另外一組含有16只試驗(yàn)豚鼠作為空白對(duì)照組（NC）。感染組試驗(yàn)豚鼠通過(guò)滴鼻接毒TCID50為10-6.55/100μL的CPIV3 JS2013株病毒液300 μL每只。陰性對(duì)照豚鼠通過(guò)滴鼻接種相同量的MDBK細(xì)胞培養(yǎng)液上清。之后每日觀察試驗(yàn)豚鼠的臨床癥狀，尤其是試驗(yàn)豚鼠的身體狀態(tài)和呼吸道疾病相關(guān)癥狀。在感染后第1、3、5、7、11、14、17、21天，通過(guò)安樂(lè)死每日處死2只感染組試驗(yàn)豚鼠和2只對(duì)照組試驗(yàn)豚鼠，摘取試驗(yàn)動(dòng)物的脾、肺和氣管組織，并對(duì)試驗(yàn)豚鼠進(jìn)行心臟采血分離血清，所有獲得的試驗(yàn)豚鼠的病料均置于-20℃保存?zhèn)溆?。將所有取得的組織分成3份，分別進(jìn)行病毒分離、RT-PCR檢測(cè)和病理組織學(xué)檢測(cè)。

1.3 RTT--PPCCRR檢測(cè)與病毒分離 采用Transzol UP試劑提取鼻拭子、血清樣品總RNA，RT-PCR擴(kuò)增CPIV3 M基因檢測(cè)病毒血癥和排毒情況，RT-PCR總體積20 μL，其中2×R-Mix Buffer 10 μL，上下游引物各0.5 μL（F 5’-AGTGATCTAGATGATGATCCA-3’，R 5’-GTTATTGATCCAATTGCTGT-3’），E-Mix 0.4 μL，RNA模版4 μL，無(wú)Rnase水補(bǔ)足至20 μL。擴(kuò)增程序：45℃ 反轉(zhuǎn)錄40 min；94℃ 5 min；94℃30 s，50℃ 30 s，72℃ 45 s，35個(gè)循環(huán)；72℃ 10 min。反應(yīng)結(jié)束后取PCR產(chǎn)物于1.2%的瓊脂糖凝膠中電泳檢測(cè)，并拍照記錄。

按照?qǐng)?bào)道的方法將陽(yáng)性樣品在MDBK細(xì)胞上進(jìn)行病毒分離。

1.4 病理學(xué)檢測(cè) 按病毒感染程序處死試驗(yàn)豚鼠后，將獲取的感染組及空白組實(shí)驗(yàn)豚鼠各組織樣品固定于4%中性福爾馬林緩沖溶液中，48 h后進(jìn)行石蠟包埋、切片等進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。

1.5 血凝抑制試驗(yàn) 將按病毒感染程序分離得到的試驗(yàn)豚鼠血清按標(biāo)準(zhǔn)程序進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)：在96孔微量血凝板的第一行每孔先加入25 μL生理鹽水，然后加入待檢試驗(yàn)豚鼠血清進(jìn)行1:2連續(xù)倍比稀釋?zhuān)缓竺靠准尤?5 μL 4單位抗原（根據(jù)第二章對(duì)JS2013株分離鑒定時(shí)所測(cè)的病毒血凝效價(jià)確定），在37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育30 min后，加入1%的豚鼠紅細(xì)胞懸液25 μL，在37℃恒溫培養(yǎng)箱孵育40 min后判定試驗(yàn)結(jié)果，HI抗體滴度為能完全抑制紅細(xì)胞凝集的血清的最高稀釋倍數(shù)（HI抗體滴度≤3log2判定為陰性，≥4log2判定為陽(yáng)性）。

2 結(jié)果與分析

2.1 臨床癥狀 感染組試驗(yàn)豚鼠在攻毒后第2天開(kāi)始有個(gè)別出現(xiàn)流鼻涕、打噴嚏和眼分泌物增多的癥狀，第4天開(kāi)始普遍出現(xiàn)較為嚴(yán)重的呼吸道癥狀，并出現(xiàn)腹式呼吸，癥狀一直持續(xù)到第14天，感染組豚鼠普遍出現(xiàn)精神倦怠、食欲減退和不喜走動(dòng)的癥狀?？瞻捉M試驗(yàn)豚鼠則無(wú)明顯臨床癥狀。感染組試驗(yàn)豚鼠在接毒后第2～6天、第11天每天分別死亡1只，而空白組試驗(yàn)豚鼠并沒(méi)有出現(xiàn)死亡，說(shuō)明CPIV3 JS2013株對(duì)豚鼠有較強(qiáng)的致病性。

2.2 病毒的RTT--PPCCRR檢測(cè)與病毒分離 將采集的臨床樣本處理后，抽提總RNA，RT-PCR擴(kuò)增CPIV3 M基因。結(jié)果顯示，攻毒后3 d可以檢出病毒血癥，持續(xù)到攻毒后第7天，攻毒后第3～14天，RT-PCR均可以從肺組織勻漿中檢測(cè)到排毒（見(jiàn)表1）?？瞻捉M檢測(cè)均為陰性。將檢測(cè)為陽(yáng)性的條帶回收后送測(cè)序公司測(cè)序，結(jié)果顯示擴(kuò)增毒株為CPIV3 JS2013株。陽(yáng)性樣品經(jīng)MDBK細(xì)胞分離能產(chǎn)生細(xì)胞病變，RT-PCR檢測(cè)為CPIV3 JS2013株。

表1 動(dòng)物排毒情況和病毒血癥Table1 Viral RNA of nasal swab and viremia

2.3 試驗(yàn)豚鼠解剖學(xué)病理變化 感染組試驗(yàn)豚鼠肺臟解剖學(xué)病理變化主要集中在接毒后第2～11天，肺組織表現(xiàn)為暗紅色淤血、不規(guī)則的實(shí)變等。在接毒后的第3～7天感染組試驗(yàn)豚鼠幾乎整個(gè)肺臟都呈現(xiàn)為實(shí)變和膨脹不全；接毒后的第7～14天可見(jiàn)肺臟膨脹逐減減輕；到第21天可見(jiàn)肺臟病變更不明顯，說(shuō)明感染組試驗(yàn)豚鼠在逐減恢復(fù)中（圖1）。同時(shí)感染組試驗(yàn)豚鼠接毒后第2～7天，解剖可見(jiàn)脾臟與空白組試驗(yàn)豚鼠相比腫大明顯（圖1）。

2.4 試驗(yàn)豚鼠組織病理學(xué)檢測(cè) 病理組織學(xué)檢測(cè)結(jié)果表明感染組試驗(yàn)豚鼠肺臟主要組織病理學(xué)變化表現(xiàn)為肺泡間隔增寬、纖維性滲出、巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)、實(shí)變和代償性肺氣腫。在人工感染后第3天，感染組試驗(yàn)豚鼠肺臟都表現(xiàn)出了肺泡間隔增寬變化；人工感染后第5天，感染組試驗(yàn)豚鼠肺臟表現(xiàn)為局部纖維素滲出及充血；人工感染后第7天，感染組試驗(yàn)豚鼠肺臟表現(xiàn)為代償性肺氣腫；人工感染后第11天，感染組試驗(yàn)豚鼠肺臟可見(jiàn)間質(zhì)性肺炎變化；空白組試驗(yàn)豚鼠肺臟未見(jiàn)病理變化（圖2）。

2.5 血凝抑制試驗(yàn) 取本試驗(yàn)中感染組和空白組試驗(yàn)豚鼠第0、3、5、7、13、21天的血清進(jìn)行血凝抑制試驗(yàn)。測(cè)得感染組試驗(yàn)豚鼠血凝抑制效價(jià)分別為1:20、1:23、1:24、1:26、1:25、1:24，而空白組試驗(yàn)豚鼠則一直為1:20。血凝抑制試驗(yàn)的結(jié)果說(shuō)明JS2013株對(duì)豚鼠有較強(qiáng)的致病性。

3 討論

研究表明，PIV3可引起人和相關(guān)動(dòng)物呼吸道疾病，HPIV1、HPIV3是導(dǎo)致人類(lèi)上下呼吸道感染的重要病原體；BPIV3是引起牛呼吸道疾病的主要病原，其引起的臨床癥狀差異較大，可以是表現(xiàn)嚴(yán)重的呼吸道感染，也可以為無(wú)癥狀的亞臨床感染。到目前為止，只有少數(shù)關(guān)于PIV3在羊群感染情況的報(bào)道，多為血清學(xué)抗體檢測(cè)，并未對(duì)其病原進(jìn)行鑒定。本實(shí)驗(yàn)室2014年首次報(bào)道從發(fā)病山羊中分離到完全不同于BPIV3的山羊副流感病毒3型（CPIV3）。為了明確其對(duì)易感動(dòng)物的致病性，本試驗(yàn)利用CPIV3分離株JS2013采取滴鼻接種的方式清潔級(jí)豚鼠，通過(guò)RT-PCR、血凝抑制試驗(yàn)、病理解剖學(xué)和病理組織學(xué)等一系列試驗(yàn)來(lái)研究該病原對(duì)豚鼠的致病性。

圖1 試驗(yàn)豚鼠肺臟、脾臟眼觀變化Fig.1 Macroscopic appearance of the lungs and spleen from guinea pigs.

圖2 感染組及空白組豚鼠肺臟HE染色圖Fig.2 The lung of guinea pigs after(H&E)staining.

試驗(yàn)結(jié)果表明，攻毒后2 d感染組的試驗(yàn)豚鼠開(kāi)始出現(xiàn)打噴嚏、流鼻涕、眼分泌物增多及腹式呼吸的臨床癥狀，并有較高的致死率。攻毒后3 d可以檢出病毒血癥，持續(xù)到攻毒后第7天，攻毒后第3～14天，RT-PCR均可以從肺組織勻漿中檢測(cè)到排毒。剖檢觀察感染組試驗(yàn)豚鼠，豚鼠肺出現(xiàn)實(shí)變和腫大的癥狀，病理組織學(xué)觀察鑒定發(fā)現(xiàn)感染組試驗(yàn)豚鼠肺組織出現(xiàn)肺泡間隔增寬、肺泡融合、炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等變化，但隨著感染時(shí)間的增長(zhǎng)，感染組試驗(yàn)豚鼠的肺部組織逐漸減輕。說(shuō)明若豚鼠感染前期不死亡的話，則有一定幾率可自愈。HI試驗(yàn)表明豚鼠感染此病毒后第3天開(kāi)始出現(xiàn)血凝抑制抗體，血凝抑制效價(jià)為1:23；21 d后血凝抑制抗體仍保持較高的水平，血凝抑制效價(jià)1:24；感染組試驗(yàn)豚鼠感染此病毒的第3～21天，血凝抑制效價(jià)集中在1:24～1:26。

綜上所述，本研究首次證明了CPIV3 JS2013株對(duì)豚鼠具有致病性，豚鼠感染后，可產(chǎn)生明顯的呼吸道癥狀，死亡率很高。并導(dǎo)致肺組織出現(xiàn)嚴(yán)重的病理變化，同時(shí)產(chǎn)生病毒血癥，刺激機(jī)體的特異性免疫反應(yīng)。本研究證明豚鼠可作為山羊副流感病毒3型理想的試驗(yàn)動(dòng)物感染模型，為今后進(jìn)一步研究CPIV3感染過(guò)程和致病性提供依據(jù)。

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Studies on the pathogenesis of Caprine parainfluenza virus type3 JS2013 strain on guinea pigs

Wang Zhongyu,Li Wenliang,Hao Fei,Mao Li,Yang Leilei, Zhang Wenwen,Jiang Jieyuan*
(Institute of Veterinary Medicine,Jiangsu Academy of Agricultural Sciences,Jiangsu Nanjing 210014)

For further exploring about the pathogenic of CPIV3 strain JS2013,the guinea pigs as PIV3 susceptible animals were infected with the virus isolate to study on the virus replication and pathological injury in the experimental animal tissues.The noted clinical symptoms were sneezing,eye secretion and dyspnea in the infected guinea pigs at 2 days post-infection(PI). The virus replicated in the blood of the infected animals and could be positively detected from 3 days PI and kept for 7 days PI.Macroscopic appearances of the lungs from infected guinea pigs were almost complete consolidation and swelling.The histopathologic examinations showed that alveoli septa thickening,disappearance of alveolar architecture and inflammatory cell infiltration were seen in the lungs of the diseased.The infected guinea pigs produced the special HI antibodies against CPIV3 in 5 days PI.

CPIV3;Pathogenesis;Guinea pigs

S858.23

1672-9692(2015)09-0001-05

2015-06-27

王鐘毓（1990-），女，碩士，研究方向?yàn)閯?dòng)物傳染病防治。

江杰元（1957-），男，博士，研究員，主要從事動(dòng)物疫病診斷研究。

江蘇省農(nóng)業(yè)科技自主創(chuàng)新資金項(xiàng)目（CX(14)2090）