紅粒小麥粗類黃酮的水浴醇提工藝優(yōu)化及體外抗氧化研究

郝教敏 李 云 楊珍平 楊 華 朱迎春 孫 敏 高志強(qiáng)

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，太谷 030801）

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院2，太谷 030801）

紅粒小麥粗類黃酮的水浴醇提工藝優(yōu)化及體外抗氧化研究

郝教敏1李 云1楊珍平2楊 華1朱迎春1孫 敏2高志強(qiáng)2

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院1，太谷 030801）

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院2，太谷 030801）

試驗(yàn)以紅粒小麥全麥粉為材料，采用單因素試驗(yàn)與三元二次正交試驗(yàn)，研究其粗類黃酮的水浴醇提工藝及體外清除DPPH·和·OH的能力。結(jié)果表明，乙醇濃度、料液比、浸提溫度及浸提時(shí)間對(duì)粗類黃酮得率的影響均符合開口向下的拋物線模型。確定乙醇體積分?jǐn)?shù)為95%，關(guān)鍵參數(shù)料液比（X1）、浸提溫度（X2）、浸提時(shí)間（X3）對(duì)粗類黃酮得率的影響符合三元二次回歸模型；主效應(yīng)：X1＞X2＞X3；交互效應(yīng)：X1X3＞X1X2＞X2X3；最優(yōu)工藝參數(shù)：料液比1∶19，66℃浸提107 min，類黃酮得率46.02 mg／g。紅粒小麥粗類黃酮對(duì)DPPH·的清除率明顯大于對(duì)·OH的清除率，且隨濃度提高，清除率顯著提高。研究為紅粒小麥深加工提供參考。

小麥 粗類黃酮 水浴醇提 抗氧化能力

1 材料與方法

1.1 材料與設(shè)備

1.1.1 原料

小麥（Triticum aestivum L.）：山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院育成的高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)小麥品種“山農(nóng)129”，籽粒紅色。

1.1.2 試劑

二苯代苦味酰肼自由基：美國Sigma公司。

1.1.3 儀器

FZ102型微型植物粉碎機(jī)：天津市泰斯特儀器有限公司；WFJ2100型可見分光光度計(jì)：尤尼柯上海儀器有限公司；DA7200型品質(zhì)分析儀：瑞典 Perten公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

［20］。

1.2.2 粗類黃酮的提取和測(cè)定

小麥籽粒風(fēng)干，粉碎，過篩，得全麥粉。取全麥粉2 g于150 mL燒瓶中，加入一定濃度一定劑量的乙醇溶液，封口，搖勻，置于恒溫水浴鍋水浴浸提一定時(shí)間，過濾。取濾液1 mL置于25 mL容量瓶中，按照1.2.1方法測(cè)定提取液的吸光值，并計(jì)算類黃酮得率［21］。

類黃酮得率／mg／g＝提取液中類黃酮的質(zhì)量／mg／樣品質(zhì)量／g

1.2.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)設(shè)乙醇體積分?jǐn)?shù)（%）、料液比（m∶V）、水浴浸提溫度（℃）及浸提時(shí)間（min）4個(gè)單因素試驗(yàn)（表1）。根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，確定3個(gè)主要影響因素，采用三元二次正交回歸設(shè)計(jì)優(yōu)化提取工藝。

表1 單因素試驗(yàn)因素與水平

1.2.4 粗類黃酮制取

根據(jù)正交優(yōu)化的最佳條件，冷凝回流浸提粗類黃酮。將浸提液過濾，再次提取，合并濾液，減壓濃縮至原體積的1／4左右，加入4倍體積的95%乙醇溶液，4℃過夜靜置，抽濾，自然干燥，即得粗類黃酮。

1.2.5 粗類黃酮清除DPPH·能力測(cè)定

參照Yamaguchi等［22］的報(bào)道略作改進(jìn)。將粗類黃酮配成20 mg／mL溶液，并作梯度稀釋。DPPH·物質(zhì)的量濃度為0.25mmol／L。在試管中分別加入0.5 mL待測(cè)液和0.5 mL DPPH·溶液，充分振搖后放于暗處反應(yīng)30 min，517 nm處測(cè)定吸光值。0.5 mL待測(cè)液加等體積的甲醇作樣品對(duì)照，0.5 mL DPPH·溶液加等體積的甲醇作空白，純甲醇調(diào)零。計(jì)算樣品對(duì)DPPH·的清除能力。

DPPH·清除率 ＝［1-（Ai-Aj）÷Ac］×100%

式中：Ai為樣液與DPPH·試劑混合液的吸光值；Aj為樣液與空白溶劑混合液的吸光值；Ac為DPPH·試劑與空白溶劑混合液的吸光值。

1.2.6 粗類黃酮清除·OH能力測(cè)定

式中：Ai為樣液與水楊酸溶液混合液的吸光值；Aj為樣液與空白溶劑混合液的吸光值；Ac為水楊酸溶液與空白溶劑混合液的吸光值。

1.3 數(shù)據(jù)分析

對(duì)所得數(shù)據(jù)用EXCEL數(shù)理統(tǒng)計(jì)分析軟件整理制表，并采用SAS9.1.3統(tǒng)計(jì)分析軟件進(jìn)行方差分析與Duncan’s多重比較，以及 RSREG回歸分析、GCONTOUR等值線響應(yīng)面繪圖分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

由圖1a～圖1d可知，4個(gè)單因素對(duì)紅粒小麥粗類黃酮得率的影響均符合開口向下的拋物線模型，且在其他3個(gè)因素確定的條件下，另外1個(gè)因素對(duì)類黃酮得率的影響差異均達(dá)到顯著水平（P＜0.05）。

比較發(fā)現(xiàn)，乙醇濃度（圖1a）對(duì)類黃酮得率的影響的變化幅度最大（3.2～30.4 mg／g），以95%乙醇溶液的得率最高（P＜0.05）。這可能是因?yàn)轭慄S酮為醇溶性物質(zhì)，浸提液中乙醇的比例越高，越利于類黃酮溶出，但無水乙醇會(huì)使一些醇溶性雜質(zhì)及親脂性成分也溶出，從而降低類黃酮得率。試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，由于小麥籽粒中淀粉含量較高，料液比（圖1b）越低，提取過程中越容易糊化，影響類黃酮溶出；以1∶20時(shí)的類黃酮得率最高?？赡艿脑蚴浅^1∶20時(shí)，不僅原料內(nèi)的類黃酮化合物已完全溶出，一些醇溶性雜質(zhì)及親脂性成分也可能溶出，影響類黃酮得率。同樣，浸提溫度＜70℃（圖1c）或浸提時(shí)間＜2 h（圖1d），都不利于類黃酮的充分溶出；但溫度太高或時(shí)間太長，則可能會(huì)破壞類黃酮的活性結(jié)構(gòu)或加速乙醇溶液蒸發(fā)引起糊化，進(jìn)而降低類黃酮得率。值得注意的是，當(dāng)浸提時(shí)間超過2.5 h后，類黃酮得率沒有顯著變化（P＞0.05），可能此時(shí)包括黃酮類化合物在內(nèi)的醇溶性或親脂性物質(zhì)已完全溶出。根據(jù)單因素試驗(yàn)，選擇乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、提取溫度及提取時(shí)間分別為：95%、1∶20、70℃、2 h，進(jìn)一步工藝優(yōu)化。

圖1 乙醇體積分?jǐn)?shù)、料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間對(duì)紅粒小麥類黃酮得率的影響

2.2 正交回歸試驗(yàn)結(jié)果分析

確定乙醇濃度為95%，采用三元二次正交設(shè)計(jì)，分析料液比（X1）、提取溫度（X2）、提取時(shí)間（X3）及其交互作用對(duì)紅粒小麥粗類黃酮得率的影響，并獲得最佳提取工藝。三元二次正交因素水平見表2，正交結(jié)果見表3。

表2 三因素二次正交因素水平編碼

表3 三因素二次正交設(shè)計(jì)及結(jié)果（n＝6）

表4 回歸模型的方差分析

采用SAS軟件RSREG過程對(duì)表3三因素編碼水平與類黃酮得率指標(biāo)進(jìn)行回歸分析，得Y＝B0+∑得類黃酮得率指標(biāo)（Y）對(duì)試驗(yàn)因素X1～X3編碼間的回歸方程：

由回歸模型（1）方差分析與F檢驗(yàn)（表4）可知，F(xiàn)擬合＝75.09（P＜0.000 1），達(dá)到高度顯著水平；回歸方程的決定系數(shù)R2＝0.991 2，說明模型方程差異顯著，且擬合較好。因此可以用該模型分析各工藝參數(shù)對(duì)粗類黃酮得率的影響。

2.2.1 主效應(yīng)分析

回歸模型（1）的偏回歸系數(shù)顯著性檢驗(yàn)（表5）表明，料液比、浸提溫度、浸提時(shí)間的二次項(xiàng)和一次項(xiàng)均為負(fù)效應(yīng)，且｜B11｜＞｜B22｜＞｜B33｜，｜B2｜＞｜B3｜＞｜B1｜；交互項(xiàng)為正效應(yīng)，且｜B13｜＞｜B12｜＞｜B23｜；所有系數(shù)均達(dá)到0.05以上的顯著水平。說明當(dāng)超過最佳料液比、最佳浸提溫度及最佳浸提時(shí)間后，類黃酮得率顯著下降，以料液比的下降幅度最大，浸提溫度次之，浸提時(shí)間的下降幅度最?。活慄S酮得率不僅受三因素的單因子效應(yīng)影響（見圖1），而且兩兩因子間具有顯著的互作效應(yīng)。通過對(duì)三因素主效應(yīng)作顯著性檢驗(yàn)（表6）表明，三因素對(duì)類黃酮得率的影響均達(dá)到0.001的極顯著水平，且料液比＞浸提溫度＞浸提時(shí)間。

表5 參數(shù)的顯著性檢驗(yàn)

表6 主效應(yīng)的方差分析

產(chǎn)生上述結(jié)果的可能原因是，小麥籽粒主要由皮層、糊粉層、淀粉質(zhì)胚乳和胚4部分組成，淀粉是小麥籽粒的主要物質(zhì)成分，其次是蛋白質(zhì)。本試驗(yàn)中的山農(nóng)129經(jīng)籽粒品質(zhì)測(cè)定，其出粉率約為70%，蛋白質(zhì)約占14%以上，水分約占12%左右。黃酮類化合物屬于次生代謝物質(zhì)，在小麥中質(zhì)量分?jǐn)?shù)不足1%［18］，且通常存在于植物細(xì)胞的胞基質(zhì)及液泡中，其向溶劑擴(kuò)散要克服細(xì)胞膜的阻力，因此其溶出及擴(kuò)散速度既與浸提溶劑用量、浸提溫度、浸提時(shí)間等工藝有密切關(guān)系［24］，也受到籽粒內(nèi)其他物質(zhì)的干擾。首先料液比決定類黃酮物質(zhì)能否充分溶出，是否會(huì)發(fā)生淀粉糊化現(xiàn)象；其次浸提溫度的高低決定溶出速率快慢與溶劑揮發(fā)程度，同時(shí)也影響淀粉糊化及蛋白質(zhì)變性等；而浸提時(shí)間長短則影響類黃酮及其他醇溶性物質(zhì)的溶出程度，進(jìn)而影響比色測(cè)定。

2.2.2 交互效應(yīng)分析

從模型（1）互作項(xiàng)的偏回歸系數(shù)可以看出，B31＞B21＞B32，且對(duì)類黃酮得率的影響均達(dá)0.05及其以上顯著水平（表4），說明類黃酮得率的變化不僅在于各因子的主效應(yīng)，而且還有兩兩互作效應(yīng)的協(xié)同或拮抗。采用降維法將模型方程（1）中的某一因子Xi固定在“0”編碼水平，獲得類黃酮得率與另外兩因子的偏回歸模型（2）～回歸模型（4）。

根據(jù)模型（2）～模型（4），利用 SAS軟件的GCONTOUR過程，繪制互作等值線圖（圖2a～圖2c）。由圖2a～圖2c可以看出，料液比的作用＞浸提時(shí)間＞浸提溫度。經(jīng)計(jì)算，當(dāng)X1、X3（圖2a）分別在 -0.080（即1∶19.5）、-0.244（即113min）編碼水平時(shí)，Y值最大 45.03 mg／g；隨 X1、X3分別從 -1.215提高到-0.080、-0.244時(shí)，Y值增大，二者協(xié)同；隨X1、X3分別從 -0.080、-0.244提高到1．215時(shí)，Y值減小，二者拮抗。類似地，隨 X1、X2（圖2b），或 X2、X3（圖2c）分別從 -1.215提高到 -0.076（即1∶19.5）、-0.272（即67℃），-0.303（即67℃）、-0.279（即112 min）時(shí)，二者協(xié)同，Y值增大（最大值分別為45.24、45.53 mg／g）；隨 X1、X2，或 X2、X3分別從 -0．076、-0．272，-0.303、-0.279提高到1.215時(shí)，二者拮抗，Y值減小。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是在相對(duì)較短的時(shí)間范圍內(nèi)或較低的溫度范圍內(nèi)，提高料液比，有利于類黃酮向溶劑充分的溶出及擴(kuò)散；繼續(xù)增加料液比，并延長浸提時(shí)間或提高浸提溫度，則一方面會(huì)導(dǎo)致浸提溶劑蒸發(fā)量加大、淀粉糊化，另一方面也可能引起其他醇溶性物質(zhì)的溶出，進(jìn)而影響類黃酮得率。同理，在較低的溫度范圍內(nèi)，延長浸提時(shí)間，有利于類黃酮充分溶出；提高溫度并延長浸提時(shí)間，則會(huì)因浸提溶劑的蒸發(fā)、淀粉的糊化、蛋白質(zhì)的變性以及類黃酮結(jié)構(gòu)的破壞等，而影響類黃酮得率。

圖2 料液比（X1）、浸提溫度（X2）和浸提時(shí)間（X3）之間兩兩互作的等值線圖

2.2.3 最佳工藝參數(shù)的確定及回歸模型的驗(yàn)證

由SAS軟件RSREG過程中3因素典型性分析結(jié)果可知，當(dāng)料液比（X1）、提取溫度（X2）、提取時(shí)間（X3）分別為1∶19（對(duì)應(yīng)編碼值 -0.165）、66℃（對(duì)應(yīng)編碼值-0.406）、107 min（對(duì)應(yīng)編碼值 -0.422）時(shí)，紅粒小麥粗類黃酮得率最大46.02 mg／g。經(jīng)實(shí)測(cè)驗(yàn)證該最佳工藝的得率為46.08 mg／g，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04。所以該模型較好地反映了各因素對(duì)紅粒小麥粗類黃酮得率的影響。

2.3 全麥粉粗類黃酮的體外清除自由基效果分析

紅粒小麥粗類黃酮對(duì)DPPH·和·OH的清除率見圖3。

圖3 紅粒小麥粗類黃酮對(duì)自由基的清除能力

由圖3可以看出，當(dāng)粗類黃酮質(zhì)量濃度較低（1.25 mg／mL）時(shí)，對(duì)DPPH·和·OH的清除能力均較弱（前者為0.97%，后者為3.87%）；隨質(zhì)量濃度增大到2.5 mg／mL，對(duì)DPPH·的清除率明顯提高到8.22%（P＜0.05），而對(duì)·OH的清除率（3.57%）沒有顯著變化（P＞0.05）；繼續(xù)增大濃度，對(duì)2種自由基的清除率均明顯增強(qiáng)（P＜0．05），且對(duì)DPPH·的清除率增加幅度更大；質(zhì)量濃度達(dá)到20 mg／mL時(shí)，對(duì)DPPH·的清除率達(dá)到66.21%，對(duì)·OH的清除率達(dá)到29.24%，前者是后者的2倍以上。將清除率與粗類黃酮濃度進(jìn)行多項(xiàng)式回歸，回歸方程分別為Y＝-0．173 1X2+7．147 5X-7．638（R2＝0．998 4，DPPH·），Y＝-0．046 0X2+2．398 9X-0．289 3（R2＝0．989 0，·OH），回歸方程擬合程度均達(dá)到98%以上。本試驗(yàn)結(jié)果表明，紅粒小麥粗類黃酮具有較強(qiáng)的清除自由基能力，清除能力與類黃酮濃度呈正相關(guān)，且對(duì)DPPH·的清除效果強(qiáng)于對(duì)·OH的清除效果。

3 討論

3.1 紅粒小麥粗類黃酮的水浴醇提工藝

植物類黃酮的提取依據(jù)是相似相溶原理［24］，其提取過程實(shí)質(zhì)上是類黃酮從植物體內(nèi)部向溶劑轉(zhuǎn)移的傳質(zhì)過程。麥黃酮是小麥籽粒中的主要黃酮類化合物之一，其基本結(jié)構(gòu)為 5，7，4′-三羥基 -3′，5′-二甲氧基黃酮［10］，屬于極性較大的O-糖苷類；考慮到乙醇的極性和相對(duì)安全性，本研究確定乙醇作為提取溶劑，并對(duì)醇提工藝進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明，料液比對(duì)粗類黃酮得率的影響（P＜0．000 1）＞浸提溫度（P＜0．00 1）＞浸提時(shí)間（P＜0．00 1）；料液比與浸提時(shí)間的交互作用（P＜0．001）＞料液比與浸提溫度（P＜0．00 1）＞浸提溫度與浸提時(shí)間（P＜0．05）。如前所述，本試驗(yàn)所用紅粒小麥籽粒淀粉和蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別高達(dá)70%、14%以上，因此，在提取過程中，這些含量較高的物質(zhì)極易造成一定的干擾，尤其是明顯發(fā)生的淀粉糊化問題。可見料液比是影響紅粒小麥全麥粉粗類黃酮得率的首要因素。經(jīng)優(yōu)化工藝得到的類黃酮得率為46.02 mg／g，實(shí)測(cè)驗(yàn)證得率為46.08 mg／g，標(biāo)準(zhǔn)偏差為 0.04。比趙善蒼［10］采用甲醇超聲并過0.22μm微孔濾膜所得到的白粒小麥全麥粉中的麥黃酮含量（47.1 mg／g）略低，但比許鋼［25］采用80%乙醇溶液超聲抽濾獲得的白粒玉米粗類黃酮含量（41.1 mg／g）要高。

3.2 紅粒小麥粗類黃酮的抗氧化能力

植物類黃酮是天然植物抗氧化活性的有效成分之一，已被在多種植物中證實(shí)［26-29］。不同植物、不同器官類黃酮結(jié)構(gòu)不一，因而其抗氧化能力亦不同［11，30］。檢 測(cè) 抗 氧 化 能 力 常 用 的 方 法 有 清 除DPPH·、·OH和O2-·［11，16］，清除率越大，抗氧化能力越強(qiáng)。在天然谷物中，蕎麥富含黃酮類化合物是眾所周知的，其較強(qiáng)的抗氧化能力也是公認(rèn)的［31］。本研究中紅粒小麥經(jīng)乙醇提取制備的粗類黃酮具有較強(qiáng)的抗氧化活性，隨濃度增加，其抗氧化能力明顯增強(qiáng)（P＜0.05）；且對(duì)DPPH·的清除能力明顯強(qiáng)于對(duì)·OH的清除能力；當(dāng)類黃酮質(zhì)量濃度為20 mg／mL時(shí)，對(duì)·OH的清除能力為29.24%，對(duì)DPPH·的清除能力可以達(dá)到66.21%，是·OH自由基清除率的2.26倍。這可能與粗類黃酮的具體結(jié)構(gòu)以及清除不同自由基的具體作用機(jī)理不同有關(guān)。比如，蕎麥中類黃酮化合物種類及含量豐富［30］，其中以蘆丁和槲皮素含量較高，其結(jié)構(gòu)上含有較多的多聚羥基（C—OH）（如A環(huán)上的C-5和C-7羥基，B環(huán)上的C-3′和C-4′羥基，C環(huán)上的 C-3羥基等），成為脂類過氧化的潛在抑制物，而麥黃酮結(jié)構(gòu)上僅具3個(gè)C—OH［32］。當(dāng)然也不排除本試驗(yàn)中制取的粗類黃酮純度較低的原因。若經(jīng)過超聲萃取輔助水浴浸提，再經(jīng)大孔樹脂分離、除雜、過柱純化，得到純度更高的類黃酮，則相關(guān)指標(biāo)的測(cè)定可能有較高的提升。

4 結(jié)論

研究優(yōu)化了紅粒小麥粗類黃酮水浴醇提工藝，最佳參數(shù)為：以95%乙醇為提取劑，料液比、提取溫度、提取時(shí)間的最適條件分別為1∶19、66℃、107 min，類黃酮得率為46.02 mg／g。經(jīng)實(shí)測(cè)驗(yàn)證該最佳工藝的類黃酮得率為46.08 mg／g，標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.04。紅粒小麥粗類黃酮有較強(qiáng)的清除自由基能力，且隨濃度提高，清除率顯著提高（P＜0.05）；在同一濃度下，對(duì)DPPH·的清除率明顯大于對(duì)·OH的清除率。研究為紅粒小麥深加工提供參考。

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The Optimal Ethanol Extraction Process in Water Bath and Antioxidant Ability in Vitro of Red-Grain Wheat Flavonoids

Hao Jiaomin1Li Yun1Yang Zhenping2Yang Hua1Zhu Yingchun1Sun Min2Gao Zhiqiang2
（College of Food Science and Engineering，Shanxi Agricultural University1，Taigu 030801）
（College of Agriculture，Shanxi Agricultural University2，Taigu 030801）

In the paper，thewholemeal of red-grain wheatwas used，and four single-factor experimentswith three factors quadratic orthogonal design was adopted to research the ethanol extraction process of flavonoids in the water bath.The scavenging abilities against DPPH·and hydroxyl radicals（·OH）in vitro of flavonoidswere determined.The results indicated that the effects of ethanol concentration，solid-liquid ratio，extracting temperature and extracting time on the yields of flavonoids were in line with the downward parabola models.On condition that the 95%ethanol solventwas ascertained，the effects of the three parameters including solid-liquid ratio（X1），extracting temperature（X2）and extracting time（X3）on the yields of flavonoidswere in linewith the three factors quadratic regression model.Themajor effectswere X1＞X2＞X3.Themutual effects among parameterswere X1X3＞X1X2＞X2X3．The optimum parameterswere solid-liquid ratio of 1∶19，extracting for 107 min at 66℃，and the yield of flavonoidswas 46.02 mg／g.The results also indicated that the red-grain wheat flavonoids expressed more powerful scavenging activities against DPPH· than hydroxyl radicals（·OH）.The scavenging rates increased significantly with the increased flavonoids concentration.The study could provide a reference for deep-processing of red-grain wheat.

wheat，flavonoids，ethanol extraction in water bath，antioxidant ability

S512.1

A

1003-0174（2015）07-0012-07

山西省科技攻關(guān)（20110311001-4），現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)專項(xiàng)（CARS-03-01-24）

2014-02-20

郝教敏，男，1974年出生，副教授，天然植物抗氧化物質(zhì)的提取及應(yīng)用

楊珍平，女，1973年出生，教授，植物資源學(xué)與植物生理生態(tài)