解淀粉芽孢桿菌抗菌物質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

楊勝遠(yuǎn)，韋 錦，鄭燮茹

解淀粉芽孢桿菌抗菌物質(zhì)發(fā)酵培養(yǎng)基的優(yōu)化

楊勝遠(yuǎn)，韋 錦，鄭燮茹

（韓山師范學(xué)院生物學(xué)系，廣東 潮州 521041）

采用雙向單因素試驗(yàn)法及正交試驗(yàn)法，以解淀粉芽孢桿菌K6為菌種，對(duì)發(fā)酵合成抗菌物質(zhì)的改良蘭迪培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。結(jié)果表明：KCl對(duì)解淀粉芽孢桿菌K6抗菌活性物質(zhì)的合成不利，F(xiàn)eSO4和CuSO4對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成影響不大，而KH2PO4、MgSO4和MnSO4對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成影響較顯著。經(jīng)優(yōu)化獲得適宜用于合成抗菌物質(zhì)的蘭迪培養(yǎng)基的配方為：L-谷氨酸鈉5.0 g/L、葡萄糖15.0 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.2 g/L、MnSO42.0 mg/L。優(yōu)化蘭迪培養(yǎng)基的組分較優(yōu)化前的改良蘭迪培養(yǎng)基顯著減少，并更有利于抗菌活性物質(zhì)的生物合成。

雙向單因素法；蘭迪培養(yǎng)基；抗菌物質(zhì)；解淀粉芽孢桿菌

隨著水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的集約化發(fā)展，病害問題也日趨凸顯，已成為限制養(yǎng)殖業(yè)發(fā)展的瓶頸。動(dòng)物病原菌也是食源性疾病的重要病原菌。目前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)主要通過抗生素對(duì)病原菌進(jìn)行防治?？股氐氖褂迷谝欢ǔ潭壬洗龠M(jìn)了養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展，然而由于藥物的長期使用，造成細(xì)菌耐藥菌株不斷出現(xiàn)，使得抗生素使用量越來越大，藥物效果越來越不明顯，但是藥害問題卻越來越顯著[1]。因此，挖掘新型天然抗菌活性物質(zhì)，應(yīng)用于水產(chǎn)動(dòng)物病害防控，從食品原料的源頭抓起，是食品安全的迫切需要。

芽孢桿菌屬（Bacillus）的細(xì)菌能夠產(chǎn)生脂肽類[2-5]、肽類[6]、細(xì)菌素[7-8]和抗菌蛋白[9-10]等多種抗菌物質(zhì)，具有抗細(xì)菌[11-13]、真菌[10,12-15]、病毒[16-17]和支原體[18]等廣譜抗菌活性，在水生生物、畜禽動(dòng)物和植物病原菌的防控方面均具有很好的效果[19-22]。然而，由于發(fā)酵產(chǎn)量低，嚴(yán)重制約了芽孢桿菌抗菌物質(zhì)的推廣應(yīng)用。

蘭迪（Landy）1948年在枯草芽孢桿菌抗菌物質(zhì)的研究中，首次采用了一種主要由谷氨酸、葡萄糖和多種鹽組成的合成培養(yǎng)基[14]，被稱為蘭迪培養(yǎng)基（Landymedium）。研究表明，蘭迪培養(yǎng)基是芽孢桿菌產(chǎn)抗菌活性物質(zhì)的良好培養(yǎng)基[15,19-20,23-24]。在蘭迪培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，方傳記等[25]采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法和均勻設(shè)計(jì)法對(duì)淀粉液化芽孢桿菌抗菌脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化，孫力軍等[24,26-27]也采用Plackett-Burman試驗(yàn)設(shè)計(jì)法和響應(yīng)曲面法對(duì)發(fā)酵生產(chǎn)抗菌脂肽的主要影響因子進(jìn)行了篩選和優(yōu)化，經(jīng)過改良后的蘭迪培養(yǎng)基更有利于抗菌物質(zhì)的合成，產(chǎn)量均獲得了較大提高。然而，改良的蘭迪培養(yǎng)基只是在各組分的量上進(jìn)行了優(yōu)化，在組分種類上并沒有改變，無法克服蘭迪培養(yǎng)基成分多、不同鹽之間容易發(fā)生反應(yīng)而形成沉淀、配制繁瑣、成本高的缺點(diǎn)，有待進(jìn)一步優(yōu)化。

單因素試驗(yàn)法是一種因子篩選的有效方法，但目前單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)普遍是在基礎(chǔ)條件上單向增加或減少某一因子，沒有考慮因子的變化改變了原有交互作用，在因子的取舍方面容易產(chǎn)生誤判。

本實(shí)驗(yàn)以具有較強(qiáng)抗菌物質(zhì)合成能力的解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）K6為菌種，在文獻(xiàn)[15,24]所述的改良蘭迪培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上，采用雙向單因素試驗(yàn)法及正交試驗(yàn)法對(duì)改良蘭迪培養(yǎng)基作進(jìn)一步優(yōu)化，以期簡化改良蘭迪培養(yǎng)基的組成，降低成本，簡化培養(yǎng)基配制方法。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1菌種

解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）K6為韓山師范學(xué)院食品微生物研究室保藏菌株，分離自菜園土壤[12]；大腸埃希氏菌（Escherichia coli）ATCC 8739和金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）ATCC 6538為廣東省微生物菌種保藏中心保藏菌株。

1.1.2培養(yǎng)基

牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基[28]：牛肉浸膏5.0 g/L、蛋白胨10.0 g/L、NaCl 5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L，pH 7.0±0.2。

牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基：在牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基配方中加入瓊脂10.0 g/L。

馬鈴薯液體培養(yǎng)基[28]：取已去皮切塊的馬鈴薯200 g，加水1 L，煮沸30 min，紗布過濾，加水補(bǔ)足1 L，調(diào)節(jié)pH 7.0±0.2。

改良蘭迪培養(yǎng)基[15,24]：L-谷氨酸鈉5.0 g/L、葡萄糖10.0 g/L、MgSO40.5 g/L、KCl 0.78 g/L、KH2PO41.0 g/L、FeSO40.05 mg/L、MnSO45.0 mg/L、CuSO40.16 mg/L，pH 7.0±0.2。

1.2儀器與設(shè)備

LRH-250恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科學(xué)儀器有限公司；HZQ-X100恒溫雙層振蕩培養(yǎng)箱 太倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠；Sigma 3-18K高速冷凍離心機(jī) 德國Sigma公司。

1.3方法

1.3.1指示菌種子液制備

從大腸埃希氏菌或金黃色葡萄球菌斜面挑取1環(huán)菌苔接入100 mL/250 mL三角瓶的牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基，于37℃、120 r/min搖床培養(yǎng)12 h，作為制備抗菌物質(zhì)活性檢測指示平板的種子液，細(xì)胞密度為108CFU/mL。

1.3.2解淀粉芽孢桿菌K6種子液制備

從解淀粉芽孢桿菌K6的斜面挑取1環(huán)菌苔接入100 mL/250 mL三角瓶的馬鈴薯液體培養(yǎng)基，于37℃、160 r/min搖床培養(yǎng)12 h作為種子液。

1.3.3解淀粉芽孢桿菌K6去細(xì)胞發(fā)酵液的制備

分別吸取2 mL解淀粉芽孢桿菌K6種子液接入100 mL/250 mL三角瓶的試驗(yàn)組和對(duì)照組蘭迪培養(yǎng)基，于30℃、160 r/min搖床培養(yǎng)36 h，作為發(fā)酵液。將發(fā)酵液于4℃、10 000 r/min離心20 min，取上清液用孔徑0.45 ?m的細(xì)菌濾器過濾制備去細(xì)胞發(fā)酵液。

1.3.4抗菌活性的檢測

采用杯碟法進(jìn)行檢測。在直徑9 cm的無菌培養(yǎng)皿中加入8 mL冷卻至約50℃的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，冷卻凝固作為底層平板。在底層平板上加0.2 mL指示菌種子液，采用無菌涂布棒涂布均勻，再加入5 mL冷卻至約50℃的牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基，快速混勻，靜置冷卻凝固，作為抗菌活性檢測指示平板。將無菌的牛津杯（外徑8 mm）間隔一定距離豎置于指示平板表面，然后在牛津杯中加入解淀粉芽孢桿菌K6去細(xì)胞發(fā)酵液100 ?L，平置于37℃培養(yǎng)12 h，用游標(biāo)卡尺測抑菌圈的直徑，以抑菌圈的直徑（mm）表示抗菌活性大小。

1.3.5雙向單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

正向單因素試驗(yàn)：以改良蘭迪培養(yǎng)基中葡萄糖和L-谷氨酸鈉作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別添加MgSO4、KCl、KH2PO4、FeSO4、MnSO4或CuSO4作為試驗(yàn)組培養(yǎng)基，添加量與原改良蘭迪培養(yǎng)基相同。每組試驗(yàn)做3個(gè)平行。

反向單因素試驗(yàn)：以改良蘭迪培養(yǎng)基為基礎(chǔ)，分別減去配方中的MgSO4、KCl、KH2PO4、FeSO4、MnSO4或CuSO4作為試驗(yàn)組培養(yǎng)基，添加量與原改良蘭迪培養(yǎng)基相同。每組試驗(yàn)做3個(gè)平行。

1.3.6正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以葡萄糖、L-谷氨酸鈉、KH2PO4、MgSO4和MnSO4為主要影響因素，以抑菌圈直徑為考察指標(biāo)進(jìn)行L25（56）試驗(yàn)設(shè)計(jì)，并設(shè)置1個(gè)空列。

1.3.7驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

選擇對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌抑菌活性均較高的組合作為適宜培養(yǎng)基。以優(yōu)化前的改良蘭迪培養(yǎng)基[15,24]作為對(duì)照。

1.4數(shù)據(jù)分析

以IBM SPSS Statistics 19.0軟件采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 KCl對(duì)解淀粉芽孢桿菌K6產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響

圖1 KCl對(duì)解淀粉芽孢桿菌K6產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.1 Effect of KCl on the production of antimicrobial substances byBacillus amyloliquefaciensK6

正向單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示，添加KCl的試驗(yàn)組對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈直徑為（13.33± 0.29）mm，低于對(duì)照組的抑菌圈直徑（14.42± 0.14）mm，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；添加KCl的試驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（13.88±0.48）mm，低于對(duì)照組的抑菌圈直徑（15.25±0.25）mm，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，KCl對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成不利。

反向單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖1）顯示，不添加K C l的試驗(yàn)組對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈直徑為（21.42±0.38）mm，高于對(duì)照組的抑菌圈直徑（20.75±0.25）mm，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；不添加KCl的試驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（24.46±0.43）mm，高于對(duì)照組的抑菌圈直徑（23.33±0.29）mm，但經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。從大腸埃希氏菌作為指示菌的反向單因素試驗(yàn)結(jié)果可見，KCl對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成不利。

綜合正向和反向單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇不添加KCl。

2.2 KH2PO4對(duì)解淀粉芽孢桿菌K6產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響

圖2 KH 2 KH2POPO4對(duì)解淀粉芽孢桿菌K6產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.2 Effect of KH2PO4on the production of antimicrobial substances byBacillus amyloliquefaciensK6

正向單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，添加KH2PO4的試驗(yàn)組對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈直徑為（16.75±0.66）mm，高于對(duì)照組的抑菌圈直徑（14.67±0.29）mm，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；添加KH2PO4的試驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（18.67±0.76）mm，高于對(duì)照組的抑菌圈直徑（15.17±0.86）mm，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，KH2PO4對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成有利。

反向單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖2）顯示，不添加KH2PO4的試驗(yàn)組對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈直徑為（13.50±0.50）mm，低于對(duì)照組的抑菌圈直徑（21.10±0.17）mm，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；不添加KH2PO4的試驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（15.67±0.29）mm，低于對(duì)照組的抑菌圈直徑（24.08±0.38）mm，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果也表明，KH2PO4對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成有利。

正向和反向單因素試驗(yàn)結(jié)果均表明需要添加KH2PO4。

2.3FeSO4對(duì)解淀粉芽孢桿菌K6產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響

圖3 FeSO4對(duì)解淀粉芽孢桿菌K6產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.3 Effect of FeSO4on the production of antimicrobial substances byBacillus amyloliquefaciensK6

正向單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，添加FeSO4的試驗(yàn)組對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈直徑為（14.50± 0.50）mm，與對(duì)照組的抑菌圈直徑（14.42±0.52）mm相近，t檢驗(yàn)分析表明差異不顯著（P＞0.05）；添加FeSO4的試驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（14.52±0.48）mm，與對(duì)照組的抑菌圈直徑（14.33±0.50）mm相近，t檢驗(yàn)分析也表明差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，F(xiàn)eSO4對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成影響不大。

反向單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖3）顯示，不添加FeSO4的試驗(yàn)組對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈直徑為（21.08±0.38）mm，與對(duì)照組的抑菌圈直徑（21.83±0.76）mm相差不大，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；不添加FeSO4的試驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（22.92±0.38）mm，低于對(duì)照組的抑菌圈直徑（24.17±0.52）mm，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。不同指示菌的試驗(yàn)結(jié)果存在差異。由上可見，正向單因素試驗(yàn)結(jié)果與以大腸埃希氏菌作為指示菌的反向單因素試驗(yàn)的結(jié)果一致，與以金黃色葡萄球菌作為指示菌的反向單因素試驗(yàn)的結(jié)果存在矛盾?？紤]反向單因素試驗(yàn)的因子較多，因子之間的交互作用復(fù)雜，可能單一去除FeSO4成分改變了原各因子的交互作用，最終導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不一致，有望通過改變其他因子從而改變因子的交互作用而獲得改善。因此，綜合正向和反向單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇不添加FeSO4。

2.4 CuSO4對(duì)解淀粉芽孢桿菌K6產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響

圖4 CuuSSOO4對(duì)解淀粉芽孢桿菌K6產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.4 Effect of CuSO4on the production of antimicrobial substances byBacillus amyloliquefaciensK6

正向單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，添加CuSO4的試驗(yàn)組對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈直徑為（13.88±0.87）mm，略低于對(duì)照組的抑菌圈直徑（14.50±0.50）mm，t檢驗(yàn)分析表明差異不顯著（P＞0.05）；添加CuSO4的試驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（14.35±1.01）mm，與對(duì)照組的抑菌圈直徑（14.42±0.80）mm相近，t檢驗(yàn)分析也表明差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，CuSO4對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成影響不大。

反向單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖4）顯示，不添加CuSO4的試驗(yàn)組對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈直徑為（20.42±0.78）mm，略低于對(duì)照組的抑菌圈直徑（21.21±0.47）mm，t檢驗(yàn)分析表明試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；不添加CuSO4的試驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（23.33±0.80）mm，略低于對(duì)照組的抑菌圈直徑（24.08±0.38）mm，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。不同指示菌的試驗(yàn)結(jié)果存在差異。

由上可見，正向單因素試驗(yàn)結(jié)果與以大腸埃希氏菌作為指示菌的反向單因素試驗(yàn)的結(jié)果一致，與以金黃色葡萄球菌作為指示菌的反向單因素試驗(yàn)的結(jié)果存在矛盾。考慮反向單因素試驗(yàn)的因子較多，因子之間的交互作用復(fù)雜，可能單一去除CuSO4成分改變了原各因子的交互作用，最終導(dǎo)致試驗(yàn)結(jié)果不一致，有望通過改變其他因子從而改變因子的交互作用而獲得改善。因此，綜合正向和反向單因素試驗(yàn)結(jié)果，選擇不添加CuSO4。

2.5 MgSO4對(duì)解淀粉芽孢桿菌K6產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響

圖5 MggSSOO4對(duì)解淀粉芽孢桿菌K6產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.5 Effect of MgSO4on the production of antimicrobial substances byBacillus amyloliquefaciensK6

正向單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，添加MgSO4的試驗(yàn)組對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈直徑為（14.33±0.29）mm，與對(duì)照組的抑菌圈直徑（14.50±0.75）mm相差不大，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）；添加MgSO4的試驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（15.67±0.58）mm，與對(duì)照組的抑菌圈直徑（15.92±0.52）mm相差不大，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異不顯著（P＞0.05）。結(jié)果表明，MgSO4對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成影響不大。

反向單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖5）顯示，不添加MgSO4的試驗(yàn)組對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈直徑為（17.08±0.44）mm，低于對(duì)照組的抑菌圈直徑（20.50±0.66）mm，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；不添加MgSO4的試驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（18.25±0.90）mm，低于對(duì)照組的抑菌圈直徑（23.50±0.50）mm，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，MgSO4對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成有利。

由上可見，雖然正向和反向單因素試驗(yàn)結(jié)果不一致，但是正向單因素試驗(yàn)結(jié)果表明MgSO4對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成并無不利的影響，而反向單因素試驗(yàn)結(jié)果表明MgSO4對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成是有利的，因此依據(jù)反向單因素試驗(yàn)結(jié)果選擇添加MgSO4。

2.6 MnSO4對(duì)解淀粉芽孢桿菌K6產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響

圖6 MnnSSOO4對(duì)解淀粉芽孢桿菌K6產(chǎn)抗菌物質(zhì)的影響Fig.6 Effect of MnSO4on the production of antimicrobial substances byBacillus amyloliquefaciensK6

正向單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖6）顯示，添加MnSO4的試驗(yàn)組對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈直徑為（15.91±0.52）mm，高于對(duì)照組的抑菌圈直徑（14.08±0.34）mm，t檢驗(yàn)分析表明試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；添加MnSO4的試驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（17.17±0.56）mm，高于對(duì)照組的抑菌圈直徑（16.33±0.29）mm，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果表明，MnSO4對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成有利。

反向單因素試驗(yàn)結(jié)果（圖6）顯示，不添加MnSO4的試驗(yàn)組對(duì)大腸埃希氏菌的抑菌圈直徑為（13.75±0.43）mm，低于對(duì)照組的抑菌圈直徑（21.08±0.48）mm，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）；不添加MnSO4的試驗(yàn)組對(duì)金黃色葡萄球菌的抑菌圈直徑為（14.63±0.38）mm，低于對(duì)照組的抑菌圈直徑（21.88±0.88）mm，經(jīng)t檢驗(yàn)分析，試驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05）。結(jié)果也表明，MnSO4對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成有利。

正向和反向單因素試驗(yàn)結(jié)果均表明需要添加MnSO4。

2.7正交試驗(yàn)優(yōu)化結(jié)果

表1 L 1 L2525（556）正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 1 Le 1 L2525(5(56) orthogonal array design and results

由表1可知，當(dāng)以大腸埃希氏菌為檢測指示菌時(shí)，蘭迪培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為B＞E＞C＞A＞D，最優(yōu)水平為A4B5C1D1E1，即L-谷氨酸鈉6.5 g/L、葡萄糖15.0 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.2 g/L、MnSO42.0 mg/L；當(dāng)以金黃色葡萄球菌為檢測指示菌時(shí)，蘭迪培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為B＞E＞C＞D＞A，最優(yōu)水平為A3B5C1D1E1，即L-谷氨酸鈉5.0 g/L、葡萄糖15.0 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.2 g/L、MnSO42.0 mg/L。比較以大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌為檢測指示菌所獲得的培養(yǎng)基最優(yōu)水平，只有A（L-谷氨酸鈉）因子在量上存在差異，極差分析表明，A與F（空列）的極差相差不大，說明該因素水平差異是由試驗(yàn)誤差或因子間的一些交互作用引起的，極差較小，為不重要因素。因此，L-谷氨酸鈉的量選擇5.0～6.5 g/L均可。

根據(jù)正交試驗(yàn)結(jié)果及分析，選擇蘭迪培養(yǎng)基的最優(yōu)組合為：L-谷氨酸鈉5.0～6.5 g/L、葡萄糖15.0 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.2 g/L、MnSO42.0 mg/L。

2.8 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

表2 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table 2 Results of verification experiments

分別以大腸埃希氏菌為指示菌的正交試驗(yàn)最優(yōu)水平（培養(yǎng)基1，A4B5C1D1E1）、金黃色葡萄球菌為指示菌的正交試驗(yàn)最優(yōu)水平（培養(yǎng)基2，A3B5C1D1E1）以及由A3與A4的平均值與B5C1D1E1的組合（培養(yǎng)基3）作為培養(yǎng)基進(jìn)行驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)。由表2可知，培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3發(fā)酵產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性均大于對(duì)照組改良蘭迪培養(yǎng)基。t檢驗(yàn)分析表明驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組差異顯著（P＜0.05），試驗(yàn)組培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3發(fā)酵產(chǎn)生的抗菌物質(zhì)對(duì)大腸埃希氏菌和金黃色葡萄球菌的抑菌活性相互間差異不顯著（P＞0.05）。因此，從原料成本考慮，選擇培養(yǎng)基2較為適宜，即優(yōu)化蘭迪培養(yǎng)基的配方為：L-谷氨酸鈉5.0 g/L、葡萄糖15.0 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.2 g/L、MnSO42.0 mg/L。

3 討 論

芽孢桿菌屬的細(xì)菌能產(chǎn)生多種抗菌物質(zhì)，抗菌活性及抗菌譜是多種抗菌物質(zhì)共同作用的結(jié)果。培養(yǎng)基不同可能導(dǎo)致發(fā)酵產(chǎn)生抗菌物質(zhì)的組成及比例存在差異，從而導(dǎo)致對(duì)特定微生物的抗菌活性或抗菌譜發(fā)生變化。同時(shí)采用大腸埃希氏菌（革蘭氏陰性）和金黃色葡萄球菌（革蘭氏陽性）作為檢測指示菌，可克服采用單一檢測指示菌可能造成優(yōu)化的培養(yǎng)基只有利于某抗菌組分合成的偏向問題。

Plackett-Burman設(shè)計(jì)法是一種兩水平試驗(yàn)設(shè)計(jì)方法，該法的主因素為正交設(shè)計(jì)，兩因素間的交互作用僅部分與主因素產(chǎn)生混淆[29]，可以利用較少的試驗(yàn)次數(shù)從多種考察因素中快速篩選出主要影響因子，廣泛用于因子主次效應(yīng)的預(yù)測[30]。然而，在考察某一因子的作用和必要性方面，單因素試驗(yàn)卻更為直接和有效。

傳統(tǒng)單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)是在基礎(chǔ)條件上單向增加或減少某一因子，對(duì)于成分較為復(fù)雜的培養(yǎng)基，單向增加或減少某一因子，可能由于因子間的交互作用的發(fā)生改變，致使與試驗(yàn)因子交互的另一因子的作用凸顯，造成試驗(yàn)系統(tǒng)誤差增大，最終導(dǎo)致對(duì)因子的選擇出現(xiàn)失誤。

本實(shí)驗(yàn)采用雙向單因素試驗(yàn)法進(jìn)行因子的篩選，雖然會(huì)增加試驗(yàn)組數(shù)，增大工作量，但是實(shí)驗(yàn)結(jié)果能夠起到相互驗(yàn)證的作用，更有利于對(duì)因子的作用作出正確判斷。研究表明，經(jīng)雙向單因素試驗(yàn)法和正交試驗(yàn)優(yōu)化，優(yōu)化后的蘭迪培養(yǎng)基的成分較原蘭迪培養(yǎng)基和改良蘭迪培養(yǎng)基顯著減少（表3），而產(chǎn)抗菌物質(zhì)的能力優(yōu)于優(yōu)化前的改良蘭迪培養(yǎng)基（表2），可降低培養(yǎng)基的成本和簡化培養(yǎng)基的配制工序。

表3 優(yōu)化前后蘭迪培養(yǎng)基的配方Table 3 Landy medium components before and after optimization

4 結(jié) 論

雙向單因素試驗(yàn)法是對(duì)多組分配方因子篩選的有效方法，能夠起到相互驗(yàn)證的作用，可降低由于因子間交互作用的改變而造成的系統(tǒng)誤差，有利于實(shí)現(xiàn)對(duì)因子的正確選擇。雙向單因素試驗(yàn)法篩選結(jié)果表明，KCl對(duì)解淀粉芽孢桿菌K6抗菌活性物質(zhì)的合成不利，F(xiàn)eSO4和CuSO4對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成影響不大，而KH2PO4、MgSO4和MnSO4對(duì)抗菌活性物質(zhì)的合成影響較顯著，為培養(yǎng)基的必需成分。

優(yōu)化蘭迪培養(yǎng)基的配方為：L-谷氨酸鈉5.0 g/L、葡萄糖15.0 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.2 g/L、MnSO42.0 mg/L。優(yōu)化蘭迪培養(yǎng)基的配方較優(yōu)化前的改良蘭迪培養(yǎng)基組分顯著減少，而且更有利于抗菌活性物質(zhì)的生物合成，是解淀粉芽孢桿菌K6合成抗菌物質(zhì)的適宜培養(yǎng)基。

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Optimization of Fermentation Medium for the Production of Antimicrobial Substances by Bacillus amyloliquefaciens

YANG Shengyuan, WEI Jin, ZHENG Xieru
(Department of Biological Sciences, Hanshan Normal University, Chaozhou 521041, China)

The modified Landy medium used for the production of antimicrobial substances byBacillus amyloliquefaciensK6 was optimized by using a combination of bidirectional single factor method and orthogonal array design. The results indicated that KCl was unfavourable for the biosynthesis of antimicrobial substances, which was little affected by FeSO4and CuSO4but significantly affected by KH2PO4, MgSO4and MnSO4. The optimum medium for the yield of antimicrobial substances consisted of 5.0 g/LL-monosodium glutamate, 15.0 g/L glucose, 0.5 g/L KH2PO4, 0.2 g/L MgSO4, and 2.0 mg/L MnSO4. Compared with the initial Landy medium, the optimized Landy medium contained much fewer constituents but was more suitable for the biosynthesis of antimicrobial substances.

bidirectional single factor method; Landy medium; antimicrobial substance;Bacillus amyloliquefaciens

Q815

1002-6630（2015）11-0150-07

10.7506/spkx1002-6630-201511029

2014-07-13

2011年度國家星火計(jì)劃項(xiàng)目（2011GA780022）；潮州市科技引導(dǎo)計(jì)劃項(xiàng)目（2011N01）；

廣東普通高?！盎洊|食品加工與安全控制工程技術(shù)開發(fā)中心”項(xiàng)目（GCZX-A1415）

楊勝遠(yuǎn)（1972—），男，教授，博士，研究方向?yàn)槭称肺⑸锛吧锛夹g(shù)。E-mail：yshengyuan2004@aliyun.com