米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸的工藝優(yōu)化

劉 亞，楊 英，孫 婷，汪海濤，張 旻，潘 麗軍，姜紹通，李興江*

米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸的工藝優(yōu)化

劉 亞，楊 英，孫 婷，汪海濤，張 旻，潘 麗軍，姜紹通，李興江*

（合肥工業(yè)大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009）

以米根霉（Rhizopus oryzae）突變株CICC40503-JST為菌種，葡萄糖為碳源，對其發(fā)酵工藝及葡萄糖代謝途徑進行初步研究，從而提高L-蘋果酸的產(chǎn)量。采用單因素試驗和響應曲面法（Box-Behnken設計）對培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，研究發(fā)酵罐實驗對產(chǎn)酸的影響。結果獲得最佳培養(yǎng)基配方為：葡萄糖100 g/L、(NH4)2SO44.0 g/L、MgSO40.3 g/L、FeSO4·7H2O 0.025 g/L、KH2PO40.5 g/L、ZnSO40.1 g/L、CaCO380 g/L。發(fā)酵條件較好組合為：發(fā)酵設備為Sartorius發(fā)酵罐、發(fā)酵溫度32℃、通氣量0.20 L/（min·L）、轉速500 r/min、孢子懸浮液單獨培養(yǎng)48 h、發(fā)酵進行48 h后添加培養(yǎng)基進行補料發(fā)酵，發(fā)酵周期為72 h、L-蘋果酸的產(chǎn)量為57.71 g/L。結論：米根霉能夠較好地利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸，其產(chǎn)量得到明顯提高。

米根霉；葡萄糖；L-蘋果酸；響應曲面法；酶活力

L-蘋果酸（L-malic acid，LMA）是細胞三羧酸循環(huán)（tricarboxylic acid cycle，TCA）的中間代謝產(chǎn)物[1]，主要用作食品添加劑，與其他食用酸相比，具有較強的酸性和口感保持性，是世界第三大通用食用酸，僅次于檸檬酸和乳酸，占有10%的市場份額[2-3]。1967年，美國食品和藥品管理局登記確認L-蘋果酸為安全、無毒、無害、可食用的有機酸[4-5]，目前它也廣泛應用在藥品，化妝品和治療肝功能障礙等藥物中。

L-蘋果酸的生產(chǎn)方法主要有化學合成法、轉化法、發(fā)酵法[6-7]?；瘜W合成法生產(chǎn)的蘋果酸是在催化劑存在下將苯氧化成富馬酸，然后加壓與水蒸氣共熱形成DL-蘋果酸，再將DL-蘋果酸拆分得到L-蘋果酸，對于工藝要求高，分離精度難度大，故在應用上受到限制[8]。轉化法主要是通過固定化酶和固定化細胞轉化[9]。酶與細胞的固定化是將具有化學催化活性的蛋白質(zhì)固定于一定的空間載體上，從而實現(xiàn)催化的反應，國內(nèi)外普遍采用的方法是固定延胡索酸酶生產(chǎn)工藝，將底物富馬酸配成富馬酸鈉或者富馬酸銨，在延胡索酸酶作用下進行水合生成相應的蘋果酸鹽，但富馬酸鹽平均轉化率低，產(chǎn)物濃度低，分離成本高[10-12]。在微生物發(fā)酵法方面，利用淀粉質(zhì)原料生產(chǎn)L-蘋果酸的微生物目前主要有：黃曲霉（Aspergillus fl avus）、米曲霉（Aspergillus oryzae）、寄生曲霉（Aspergillu parasiticus）等，Battat等[13]以16 L攪拌罐發(fā)酵，黃曲霉在攪拌速率350 r/min、Fe2+12 mg/L、氮271 mg/L等條件下從120 g/L葡萄糖中獲得113 g/LL-蘋果酸，總轉化率0.59 g/（L/h）。Takao等[14]報道了先用少根根霉（Rhizopus ahirrizus）或華根霉（Rhizopus chinensis）把糖質(zhì)原料轉化成富馬酸，再利用膜醭畢赤酵母（Pichia membranaefaciens）、普通變形桿菌（Proteusbacillus vulgaris）及宛氏擬青霉（Paeciomyces vatioti）之一，把富馬酸轉化成LMA。Taing等[15]優(yōu)化耐糖魯氏酵母（Zygosaccharomyces rouxii）的發(fā)酵條件，控制初始糖質(zhì)量濃度300 g/L、pH 5.0、發(fā)酵溫度25℃，在培養(yǎng)基中添加谷氨酸、蘋果酸和琥珀酸可提高L-蘋果酸產(chǎn)量，谷氨酸添加量為0.5%時，L-蘋果酸產(chǎn)量最高，達到74.9 g/L，糖酸轉化率為32.8%。

本實驗以米根霉（Rhizopus oryzae）突變株CICC40503-JST為菌種，葡萄糖為碳源，采用單因素和響應曲面法對發(fā)酵培養(yǎng)基和發(fā)酵條件進行優(yōu)化，獲得最適發(fā)酵培養(yǎng)基和最適發(fā)酵培養(yǎng)條件，以期為葡萄糖的生物轉化提供參考。

1 材料與方法

1.1菌種、培養(yǎng)基與試劑

米根霉突變株CICC40503-JST，合肥工業(yè)大學農(nóng)產(chǎn)品加工研究院前期選育及保藏菌株。

斜面及平板培養(yǎng)基采用PDA培養(yǎng)基；基礎發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L、酵母浸粉1 g/L、(NH4)2SO42 g/L、KH2PO40.2 g/L、MgSO40.1 g/L、ZnSO40.1 g/L、FeSO4·7H2O 0.02 g/L，CaCO380 g/L，自然pH值，121℃條件下滅菌20 min；孢子懸浮液培養(yǎng)基：葡萄糖100 g/L、(NH4)2SO45 g/L、KH2PO40.5 g/L、MgSO40.3 g/L、FeSO4·7H2O 0.025 g/L、ZnSO40.1 g/L，自然pH值，121℃條件下滅菌20 min。

葡萄糖、(NH4)2SO4、KH2PO4、MgSO4、ZnSO4、FeSO4·7H2O、氨水、CaCO3、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NADH）、草酰乙酸國藥集團化學試劑有限公司；酵母浸粉 北京奧博星生物技術有限公司；乙二胺四乙酸二鈉（ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate，EDTA-Na2）北京索萊寶科技有限公司；氫氧化鈉 無錫市展望化工試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

全自動高壓滅菌鍋 日本Tege SANYO公司；恒溫氣浴搖床 上海申勝生物技術有限公司；恒溫培養(yǎng)箱上海一恒科技有限公司；發(fā)酵罐 德國Sartorius公司；721型可見分光光度計 上海元析儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1菌株活化與培養(yǎng)

1.3.1.1菌種活化

將斜面保存的菌種轉接至PDA培養(yǎng)基上，置于32℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)3～5 d，4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.1.2搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)

以洗孢子的形式將平板培養(yǎng)基上的菌種接入250 mL搖瓶中，裝液量20%，接種量10%（孢子懸液濃度為1×107個/mL），32℃、200 r/min的條件下振蕩培養(yǎng)3 d。每組實驗做4個平行，發(fā)酵液用于測定L-蘋果酸產(chǎn)量，結果取平均值。

1.3.1.3孢子懸浮液培養(yǎng)

以洗孢子的形式將平板培養(yǎng)基上的菌種接入3 L搖瓶中，裝液量30%，接種量3%（孢子懸液濃度為1×107個/mL），32℃、150 r/min條件下振蕩培養(yǎng)。

1.3.1.4發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)

將孢子懸浮液接入發(fā)酵罐中，裝液量6 L，接種量1 L（孢子懸浮液占10%），發(fā)酵罐基本發(fā)酵條件為30℃、500 r/min、0.13 L/（min·L），每組實驗做4個平行，發(fā)酵液用于測定L-蘋果酸產(chǎn)量，結果取平均值。

1.3.2 產(chǎn)物含量測定

1.3.2.1L-蘋果酸含量的測定

采用EDTA定鈣法：取過濾后的發(fā)酵液1.0 mL，加蒸餾水100 mL，l mol/L NaOH溶液10.0 mL，鈣指示劑2 mg，用0.05 mol/L EDTA-Na2溶液滴定至溶液呈現(xiàn)純藍色為滴定終點，并記錄消耗的EDTA-Na2體積，按下式計算L-蘋果酸產(chǎn)量。

L-蘋果酸產(chǎn)量/（g/L）= 134.087 4×c×V

式中：V為滴定所消耗EDTA溶液體積/mL；c為EDTA濃度/（mol/L）；134.087 4為蘋果酸摩爾質(zhì)量/（g/mol）。

1.3.2.2生物量測定

發(fā)酵液過濾得殘渣，用0.01 mol/L的HCl溶液充分洗滌，除去過量CaCO3，再用蒸餾水洗滌，得殘留菌體，于80℃烘干至恒質(zhì)量稱量。

1.3.2.3檸檬酸合酶酶活力測定

利用檸檬酸合酶測定試劑盒（CAT # CS0720）。

1.3.2.4 蘋果酸酶酶活力測定

利用蘋果酸酶測定試劑盒（CAT# SPMALI03）。

1.3.2.5 蘋果酸脫氫酶酶活力測定

設定分光光度計溫度為25℃，波長340 nm。用移液管吸取0.1 mol/L pH 7.4磷酸鹽緩沖液2.6 mL，0.003 75 mol/L NADH的0.2 mL，0.006 mol/L草酰乙酸0.1 mL于比色皿中，然后將裝有液體的比色皿放置在分光光度計中3～4 min以達到設定溫度，測量吸光度，計算酶活力，酶活力單位定義為25 ℃條件下1 min內(nèi)轉化1μmol底物所需要的酶量為1 個酶活力單位（U）。

1.3.2.6丙酮酸羧化酶酶活力測定

[16]方法測定。

1.3.3工藝優(yōu)化試驗

1.3.3.1培養(yǎng)基配方單因素試驗

根據(jù)1.3.1.2節(jié)的發(fā)酵培養(yǎng)條件和1.1節(jié)中的基礎發(fā)酵培養(yǎng)基，進行單因素試驗，分別考察不同質(zhì)量濃度的酵母粉（0、0.5、1.0、1.5、2.0 g/ L）、(NH4)2SO4（1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L）、MgSO4（0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 g/L）、FeSO4·7H2O（0.02、0.025、0.03、0.035、0.04 g/L）、KH2PO4（0.4、0.5、0.6、0.7、0.8 g/L）、ZnSO4（0、0.05、0.1、0.15、0.2 g/L）對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響，以確定主要的影響因素及水平區(qū)間。每組試驗進行4次重復，結果取其平均值，采用方差法分析處理實驗數(shù)據(jù)。

1.3.3.2響應面試驗優(yōu)化培養(yǎng)基配方

在單因素試驗的基礎上，以L-蘋果酸產(chǎn)量為響應值，選取對L-蘋果酸產(chǎn)量影響顯著的因素[17-19]（包括(NH4)2SO4、ZnSO4、FeSO4·7H2O、MgSO4），根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗設計原理，采用響應面分析法對發(fā)酵培養(yǎng)基參數(shù)進行優(yōu)化，獲得最優(yōu)培養(yǎng)基。每組試驗重復4次，結果取其平均值。

1.3.3.3發(fā)酵工藝單因素試驗

根據(jù)1.3.3.2節(jié)得到的最優(yōu)配方配制發(fā)酵培養(yǎng)基，分別考察發(fā)酵設備、通氣量、攪拌槳轉速、孢子懸浮液培養(yǎng)時間、連續(xù)性發(fā)酵，中和劑對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響，試驗重復4次，結果取其平均值，采用方差法分析處理實驗數(shù)據(jù)。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 酵母粉質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響

圖1 酵母粉質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響Fig.1 Effect of yeast extract powder concentration on the production ofL-malic acid

由圖1可知，不添加酵母粉時，L-蘋果酸產(chǎn)量最大，為31.16 g/L，添加酵母粉時，L-蘋果酸產(chǎn)量逐漸下降。這可能是酵母粉的成分比較復雜，L-蘋果酸的產(chǎn)量隨著酵母粉質(zhì)量濃度的增加而減小，當酵母粉質(zhì)量濃度達到2 g/L時，L-蘋果酸產(chǎn)量最小，因為酵母浸粉中除含有豐富的蛋白質(zhì)、肽類、游離的氨基酸以外，還含有少量的糖類、脂肪和生長因子等，它能有效促進菌體生長，可能會導致菌體過于旺盛，而影響代謝產(chǎn)物的積累[20-21]。方差分析結果表明，酵母粉對L-蘋果酸產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01），因此可以選擇不添加酵母浸粉。

2.1.2 (NH4)2SO4質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響

圖2 ((NNHH4)2SSOO4質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響Fig.2 Effect of (NH4)2SO4concentration on the production ofL-malic acid

由圖2可知，L-蘋果酸產(chǎn)量隨著(NH4)2SO4質(zhì)量濃度的增加而增大，當(NH4)2SO4質(zhì)量濃度達到4 g/L時，L-蘋果酸產(chǎn)量最大，為31.34 g/L。當(NH4)2SO4質(zhì)量濃度高于4 g/L時，L-蘋果酸產(chǎn)量呈下降趨勢。這是因為發(fā)酵液中過高質(zhì)量濃度的NH4+會抑制菌體的生長，導致產(chǎn)酸水平下降。(NH4)2SO4的初始質(zhì)量濃度過低時，氮元素和硫元素供應不足，也不利于發(fā)酵的正常進行[22-24]。方差分析結果表明，(NH4)2SO4質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響極顯著（P＜0.01）。(NH4)2SO4的質(zhì)量濃度為4 g/L左右較為適宜。

2.1.3 MgSO4質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響

圖3 MggSSOO4質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響Fig.3 Effect of MgSO4concentration on the production ofL-malic acid

由圖3可知，L-蘋果酸產(chǎn)量隨著MgSO4質(zhì)量濃度的增加而增大，當MgSO4質(zhì)量濃度為0.3 g/L時L-蘋果酸產(chǎn)量達到最大，為31.84 g/L，當MgSO4質(zhì)量濃度高于0.3 g/L時，L-蘋果酸產(chǎn)量逐漸下降。這是因為鎂離子是很多酶的輔酶或激活劑，少量的鎂離子可促進微生物生長代謝，而高質(zhì)量濃度的鎂離子會抑制菌種的生長及L-蘋果酸的產(chǎn)量[25]。方差分析結果表明，MgSO4對L-蘋果酸產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01）。MgSO4質(zhì)量濃度為0.3 g/L左右較為適宜。

2.1.4 FeSO4·7H2O質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響

圖4 FeeSSOO4·77HH2O質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響Fig.4 Effect of FeSO4·7H2O concentration on the production ofL-malic acid

由圖4可知，L-蘋果酸的產(chǎn)量隨著FeSO4·7H2O質(zhì)量濃度的增加而逐漸增大，當FeSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.025 g/L時，L-蘋果酸產(chǎn)量達到最大，為29.98 g/L。當FeSO4·7H2O質(zhì)量濃度高于0.025 g/L時，L-蘋果酸產(chǎn)量下降。方差分析結果表明，F(xiàn)eSO4·7H2O對L-蘋果酸產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01）。FeSO4·7H2O質(zhì)量濃度為0.025 g/L左右較為適宜。

2.1.5 KH2PO4質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響

圖5 KH 5 KH2POPO4質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響Fig.5 Effect of KH2PO4concentration on the production ofL-malic acid

由圖5可知，L-蘋果酸產(chǎn)量隨著KH2PO4質(zhì)量濃度的升高而先增大后減小。當其質(zhì)量濃度為0.5 g/L時，L-蘋果酸產(chǎn)量最大，為33.76 g/L。在微生物代謝過程中，磷酸鹽的添加可促進菌體生長，影響菌體濃度、合成速率等多個方面，而培養(yǎng)基中添加的復合氮源中也很有可能含有磷元素，添加過量會引起菌體過于旺盛，從而降低了產(chǎn)酸量[26-27]。方差分析結果表明，KH2PO4對L-蘋果酸產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01）。因此，KH2PO4添加的較適質(zhì)量濃度為0.5 g/L。

2.1.6 ZnSO4質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響

圖6 ZnnSSOO4質(zhì)量濃度對LL--蘋果酸產(chǎn)量的影響Fig.6 Effect of ZnSO4concentration on the production ofL-malic acid

由圖6可知，L-蘋果酸產(chǎn)量隨著ZnSO4質(zhì)量濃度的升高而先增大后減小。當其質(zhì)量濃度為0.1 g/L時，L-蘋果酸產(chǎn)量最大，為28.32 g/L，當ZnSO4質(zhì)量濃度高于0.1 g/L時，L-蘋果酸產(chǎn)量下降。方差分析結果表明，ZnSO4對L-蘋果酸產(chǎn)量影響極顯著（P＜0.01），因此，ZnSO4添加的較適質(zhì)量濃度為0.1 g/L。

2.2 響應面試驗結果

2.2.1 響應面試驗結果與分析

中心組合試驗設計方案與結果見表1。

表1 中心組合試驗設計方案與結果Table 1 Central composite design matrix and corresponding experimental resuullttss

2.2.2 回歸模型的建立及其顯著性檢驗

利用Design-Expert軟件對試驗數(shù)據(jù)進行多元二次回歸擬合，得到的回歸方程模型為：

Y=34.64-0.94X1+1.70X2-0.13X3+0.61X4-0.66X1X2+ 1.06X1X3-0.52X1X4+1.45X2X3+0.91X2X4-0.84X3X4-2.95X12-4.52X22-4.72X32-5.58X42。

回歸方程及偏回歸系數(shù)方差分析結果見表2。

表2 回歸方程的方差分析Table 2 Analysis of variance for the fitted quadratic regression equaattiioonn

由表2可知，該回歸模型P＜0.000 1，失擬項P＞0.05，說明該模型回歸方程顯著，失擬不顯著。模型的決定系數(shù)R2=0.990 6，說明該模型的擬合程度很好，能較好地反映各因素與響應值變化的關系，可用于葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸的理論預測。回歸方程中的X1、X2、X4、X1X3、X2X3、X2X4、X3X4、X12、X22、X32、X42對L-蘋果酸產(chǎn)量影響高度顯著，X1X2對L-蘋果酸產(chǎn)量影響顯著。

該回歸模型的響應面趨勢圖和等高線圖解見圖7～11，(NH4)2SO4、ZnSO4、FeSO4·7H2O、MgSO4質(zhì)量濃度及其交互作用對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響可以從圖中直觀地反映出來。

圖7 ZnnSSOO4和((NNHH4)2SSOO4的質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量影響的響應面和等高線Fig.7 Response surface and contour plots for the interactive effects ofZnSO4and (NH4)2SO4on the production ofL-malic acid

圖8 FeeSSOO4·77HH2OO和((NNHH4)2SSOO4的質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量影響的響應面和等高線Fig.8 Response surface and contour plots for the interactive effects of FeSO4·7H2O and (NH4)2SO4on the production ofL-malic

圖9 ZnnSSOO4和FFeeSSOO4·77HH2O的質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量影響的響應面和等高線Fig.9 Response surface and contour plots for the interactive effects of ZnSO4 and FeSO4·7H2O on the production ofL-malic acid

圖10 MggSSOO4和ZZnnSSOO4的質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量影響的響應面和等高線Fig.10 Response surface and contour plots for the interactive effects of MgSO4and ZnSO4on the production ofL-malic acid

圖11 MggSSOO4和FFeeSSOO4·77HH2O的質(zhì)量濃度對L-蘋果酸產(chǎn)量影響的響應面和等高線Fig.11 Response surface and contour plots for the interactive effects of MgSO4 and FeSO4·7H2O on the production ofL-malic acid

由圖7可知，當把FeSO4·7H2O、MgSO4固定于零水平時，隨著(NH4)2SO4和ZnSO4質(zhì)量濃度的增加，L-蘋果酸產(chǎn)量均呈先增大后減小的趨勢，等高線呈橢圓形，說明兩因素的交互作用較強。由圖8可知，當把ZnSO4和MgSO4固定于零水平時，L-蘋果酸產(chǎn)量隨著(NH4)2SO4和FeSO4·7H2O質(zhì)量濃度的增加而先升高后降低，響應曲面的坡度陡峭，表明這兩個因素的交互效應顯著。同理，由圖9～11可知，ZnSO4和FeSO4·7H2O、MgSO4和ZnSO4、MgSO4和FeSO4·7H2O對L-蘋果酸產(chǎn)量的交互作用影響類似于圖8。

2.2.3 響應面因素水平優(yōu)化結果及模型驗證

對回歸模型進行響應面分析，得到L-蘋果酸產(chǎn)量預測達到最大值時各因素水平為：(NH4)2SO43.004 g/L，ZnSO40.092 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.025 g/L，MgSO40.343 g/L。預測值為34.644 g/L，當顯著性水平α=0.05時，L-蘋果酸產(chǎn)量的95%的預測區(qū)間為[34.128 9 g/L，35.159 1 g/L]。

為驗證回歸模型預測值的準確性，將上述最優(yōu)組合條件圓整為：(NH4)2SO43 g/L，ZnSO40.1 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O 0.025 g/L，MgSO40.3 g/L，進行重復4次驗證性實驗，得到L-蘋果酸產(chǎn)量平均值為（34.87±0.24）g/L，該值落在響應值的95%預測區(qū)間[34.128 9 g/L，35.159 1 g/L]內(nèi)。說明該回歸模型可用于米根霉利用葡萄糖糖發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸產(chǎn)量的預測。經(jīng)圓整后的最優(yōu)組合條件與Box-Behnken中心組合試驗設計方案表2中的中心點一致。

2.3 發(fā)酵工藝單因素試驗結果

2.3.1 發(fā)酵設備對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響

按照1.3.1.4節(jié)的條件將接種過孢子懸浮液的培養(yǎng)基在發(fā)酵罐中培養(yǎng)，考察利用發(fā)酵罐在72 h內(nèi)對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響，結果如圖12所示。

在發(fā)酵罐中反應的產(chǎn)量高于前期搖瓶實驗中的蘋果酸產(chǎn)量，搖瓶發(fā)酵裝液量少，發(fā)酵一段時間后溶氧不足，同時在培養(yǎng)過程中由于轉速不足，CaCO3容易將菌體包裹住，導致發(fā)酵效果不佳，蘋果酸產(chǎn)量下降，而利用德國Sartorius發(fā)酵罐進行實驗，該設備具有全自動、可以隨時調(diào)節(jié)溫度、轉速、通氣量等基本發(fā)酵條件，探究發(fā)酵工藝對產(chǎn)酸的影響。

圖12 發(fā)酵罐72 h內(nèi)不同時間段LL--蘋果酸的產(chǎn)量變化Fig.12 Time course ofL-malic acid yield during fermentation using stirring tank

2.3.2 發(fā)酵罐中通氣量對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響

發(fā)酵罐中的通氣量分別為（0.07、0.13、0.20、0.27 L/（min·L）），考察發(fā)酵溫度對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響，結果如圖13所示。

圖13 通氣量對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響Fig.13 Effect of ventilation on the production ofL-malic acid

隨著通氣量的增加，L-蘋果酸產(chǎn)量逐漸增加，當通氣量為0.20 L/（min·L）時，L-蘋果酸產(chǎn)量達到最大值，為39.35 g/L；當通氣量為0.27 L/（min·L）時，L-蘋果酸產(chǎn)量與0.20 L/（min·L）時接近，雖然會增加罐內(nèi)溶氧量，但由于通氣量過大容易造成罐體內(nèi)泡沫的產(chǎn)生，不利于后期發(fā)酵過程的進行，因此，有利于發(fā)酵產(chǎn)酸的較適通氣量為0.20 L/（min·L）。

2.3.3孢子懸浮液培養(yǎng)時間對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響

取已培養(yǎng)好的斜面菌種一支，加入20 mL無菌水，輕輕將瓊脂表面的孢子刮下，制成孢子懸浮液，再將20 mL孢子懸浮液加入到已經(jīng)滅菌的1 L孢子懸浮液發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵時間分別定為0、24、48、72 h，考察孢子懸浮液培養(yǎng)時間對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響，結果如圖14所示。

圖14 孢子懸浮液培養(yǎng)時間對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響Fig.14 Effect of the spore suspension on the production ofL-malic acid

由圖14可知，隨著孢子懸浮液培養(yǎng)時間的增加，L-蘋果酸產(chǎn)量逐漸增加，0～24 h的增長速率明顯高于其他時間段，當發(fā)酵時間達到48 h時，L-蘋果酸產(chǎn)量達到最大值，為39.51 g/L，當懸浮液培養(yǎng)時間超過48 h，達到72 h時，L-蘋果酸產(chǎn)量略有降低，可能是因為培養(yǎng)時間過長后導致菌體量較大，在發(fā)酵過程中消耗營養(yǎng)物質(zhì)速度加快，在消耗完營養(yǎng)物質(zhì)后可能會繼續(xù)消耗利用一部分代謝產(chǎn)物，所以導致最終蘋果酸產(chǎn)量有所降低。

2.3.4 發(fā)酵罐中攪拌槳轉速對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響

嘗試使用300、400、500、600 r/min進行實驗，發(fā)現(xiàn)300 r/min和400 r/min轉速過低，會導致CaCO3在罐體中無法攪拌均勻，容易被菌體包裹，發(fā)酵過程無法順利進行，而達到600 r/min時由于轉速過高，泡沫生成量較大，會使發(fā)酵罐處于報警狀態(tài)，發(fā)酵過程無法正常進行，所以采用500 r/min轉速較為合適。

2.3.5 補料發(fā)酵對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響

在發(fā)酵到48 h測量的蘋果酸產(chǎn)量趨于穩(wěn)定，所以在發(fā)酵進行48 h后加入培養(yǎng)基進行補料發(fā)酵，按照補充培養(yǎng)基成分為40 g/L的葡萄糖、25 g/L CaCO3、1 g/L (NH4)2SO4配制，加入1 L蒸餾水，滅菌處理?？疾爝B續(xù)發(fā)酵對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響，結果如圖15所示。

圖15 補料發(fā)酵對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響Fig.15 Effect of fed-batch fermentation on the production ofL-malic acid

由圖15可知，培養(yǎng)48 h，L-蘋果酸產(chǎn)量為39.95 g/L；加入培養(yǎng)基后發(fā)酵到72 h，L-蘋果酸產(chǎn)量最高，為55.4 g/L。故補料發(fā)酵可以有效增加L-蘋果酸的產(chǎn)量。

2.4發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸發(fā)酵罐發(fā)酵進程曲線

采用優(yōu)化的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，菌株發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸的發(fā)酵進程見圖16。0～72 h之間生物量一直增長迅速，最終達到9.14 g/L，表明菌體生長旺盛；0～36 h之間蘋果酸產(chǎn)量增長迅速，36～48 h之間蘋果酸產(chǎn)量增長緩慢，此時罐體內(nèi)培養(yǎng)基剩余量較少，在48 h時加入培養(yǎng)基進行補料發(fā)酵培養(yǎng)，48～72 h蘋果酸產(chǎn)量增長迅速，但由于發(fā)酵罐容量有限，所以在72 h后不再添加發(fā)酵培養(yǎng)基，最終測得L-蘋果酸產(chǎn)量達到57.71 g/L。由于米根霉在發(fā)酵過程中消耗氧氣，所以溶氧量在0～72 h一直在下降，但一直維持在50%以上，也說明發(fā)酵罐持續(xù)通氣會有利于反應的進行，克服了搖瓶發(fā)酵供氧不足的缺陷。

2.5 不同中和劑對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響

圖16 優(yōu)化條件下的發(fā)酵進程曲線Fig.16 Fermentation curve under optimized conditions

在前期搖瓶發(fā)酵實驗中發(fā)現(xiàn)，使用CaCO3作為中和劑時易被菌體包裹，造成無法有效產(chǎn)酸，不利于搖瓶發(fā)酵，嘗試采用NaOH和氨水代替CaCO3，解決在搖瓶發(fā)酵中出現(xiàn)的問題。NaOH的質(zhì)量濃度為200 g/900 mL，氨水的濃度為10 mol/L，同時采用優(yōu)化的培養(yǎng)基和發(fā)酵條件，pH值設為4.5，考察連續(xù)發(fā)酵對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響，結果如圖17所示。

圖17 不同中和劑對L-蘋果酸產(chǎn)量的影響Fig.17 Effect of different neutralizing agents on the production ofL-malic acid

由圖17可知，利用3 種不同的中和劑產(chǎn)酸效率和最終產(chǎn)酸量有明顯的不同，CaCO3的產(chǎn)酸量明顯高于NaOH和氨水，在48 h時添加培養(yǎng)基進行連續(xù)發(fā)酵，到72 h時利用不同中和劑進行發(fā)酵的產(chǎn)酸量均達到最大，使用CaCO3時的L-蘋果酸終產(chǎn)量為57.21 g/L，而利用其他兩種中和劑的產(chǎn)酸量分別為53.02 g/L和32.04 g/L，使用發(fā)酵罐進行試驗時由于較高的轉速可以有效避免中和劑被菌體包裹，所以在后期試驗中還是建議采用CaCO3作為中和劑，但同時需要控制轉速，從而使反應順利進行。

2.6 代謝途徑分析與主要酶活性檢測

2.6.1 蘋果酸合成主要途徑

目前研究發(fā)現(xiàn)L-蘋果酸在微生物細胞內(nèi)有4 條合成途徑：1）丙酮酸羧化或磷酸烯醇式丙酮酸羧化為草酰乙酸，再還原為L-蘋果酸；2）由草酰乙酸與乙酰輔酶A合成檸檬酸后進入三羧酸循環(huán)生成L-蘋果酸；3）支路乙醛酸循環(huán)合成L-蘋果酸；4）延胡索酸由延胡索酸酶轉化生成L-蘋果酸[28]。

2.6.2 酶活力檢測結果

根據(jù)蘋果酸在生物體內(nèi)的合成途徑，選擇合成途徑中的幾種關鍵酶，通過酶活測定初步判斷此發(fā)酵過程中可能涉及的蘋果酸合成路徑。

測定發(fā)酵40 h時的檸檬酸合酶，蘋果酸酶、蘋果酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶酶活，其中檸檬酸合成酶催化乙酰輔酶A合成檸檬酸，蘋果酸酶催化丙酮酸合成蘋果酸，蘋果酸脫氫酶催化草酰乙酸合成蘋果酸，丙酮酸羧化酶催化丙酮酸合成草酰乙酸。測得各個酶的酶活力分別為：檸檬酸合酶（35.075±1.550）U/mg、蘋果酸酶（75.400±1.602）U/mg、蘋果酸脫氫酶（626.65±7.58）U/mg、丙酮酸羧化酶（269.525±6.910）U/mg。

2.6.3 可能代謝途徑初探

根據(jù)反應產(chǎn)物和酶活力測定值，結合TCA繪制了簡要的代謝流程圖，如圖18所示。

圖18 菌株的簡易代謝過程圖Fig.18 Simple metabolic pathway for the strain

對比近幾年其他研究人員開展有機酸發(fā)酵實驗時測定的相關酶的活性數(shù)據(jù)，何皓等[29]在研究放線菌酮對米根霉積累L-蘋果酸代謝途徑的調(diào)控作用中測得的蘋果酸脫氫酶活性最高為256 U/mg，丙酮酸羧化酶最高活性為101.6 U/mg。在研究曲霉N1-14’胞質(zhì)酶活性與產(chǎn)L-蘋果酸能力的關系中測得蘋果酸酶的活性最高約為120 U/mg，蘋果酸脫氫酶活性最高約為400 U/mg[30]，結合本實驗酶活力數(shù)據(jù)和圖18可以看出，此發(fā)酵過程中檸檬酸合成酶的活性較強表明檸檬酸合成途徑較強，從而得出TCA和乙醛酸循環(huán)的反應過程較強，而高溶氧量（dissolved oxygen，DO）會促進TCA和乙醛酸循環(huán)的進行，所以增大通氣量和轉速會提高反應體系的溶氧量，故利用發(fā)酵罐提高溶氧量會有效促進發(fā)酵反應的進行。

同樣，相比其他研究中測得的酶活力比較可以發(fā)現(xiàn)，蘋果酸酶、蘋果酸脫氫酶和丙酮酸羧化酶的活性較強，可以促進蘋果酸生成反應的進行，由圖17可知，反應中加入的3種中和劑，CaCO3的效果最好，是因為在發(fā)酵中CaCO3會和生成的蘋果酸反應生成難溶的蘋果酸鈣，從而達到減弱對關鍵酶的反饋抑制，使代謝向著生成和積累蘋果酸的方向進行[31-32]，另外，產(chǎn)生蘋果酸的反應體系需要大量CO2作為底物，而CaCO3在作為中和劑時可以釋放一部分CO2，促進蘋果酸的累積，所以較其他兩種中和劑的效果較好。

初步探究得出產(chǎn)蘋果酸的主要路徑受CO2固定化的影響，其中蘋果酸酶催化丙酮酸生成蘋果酸，蘋果酸脫氫酶催化草酰乙酸生成蘋果酸兩個途徑為CO2羧基化的主途徑。

3 討 論

采用響應面分析法對米根霉發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸的培養(yǎng)基進行優(yōu)化，得到的最優(yōu)培養(yǎng)基配方為：葡萄糖100 g/L、(NH4)2SO44.0 g/L、MgSO40.30 g/L、FeSO4·7H2O 0.025 g/L、KH2PO40.5 g/L、ZnSO40.1 g/L、CaCO380 g/L，L-蘋果酸產(chǎn)量為（34.87±0.24）g/L，該值在模型響應值的95%預測區(qū)間[34.128 9 g/L，35.159 1 g/L]范圍內(nèi)，表明所建回歸方程對米根霉利用葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸產(chǎn)量具有較好的預測效果。但是由于利用搖瓶發(fā)酵實驗中轉速、溶氧等條件限制，會出現(xiàn)部分CaCO3被菌體包裹住，導致產(chǎn)酸量偏低的現(xiàn)象，所以又利用發(fā)酵罐來對實驗工藝進行改進，獲得較優(yōu)發(fā)酵條件為：發(fā)酵溫度32℃、通氣量0.20 L/（min·L）、轉速500 r/min、孢子懸浮液單獨培養(yǎng)48 h、發(fā)酵進行48 h后添加培養(yǎng)基進行補料發(fā)酵，發(fā)酵周期為72 h、L-蘋果酸的產(chǎn)量為57.71 g/L。通過酶活性檢測表明TCA和乙醛酸循環(huán)途徑活躍，其中的蘋果酸酶和蘋果酸脫氫酶的酶活性較強，促進了蘋果酸生成反應的進行，初步探究得出產(chǎn)蘋果酸的主要路徑受CO2固定化的影響（蘋果酸酶催化丙酮酸生成蘋果酸，蘋果酸脫氫酶催化草酰乙酸生成蘋果酸，這兩個途徑為CO2羧基化主途徑），以及部分受TCA及乙醛酸循環(huán)涉及的耗氧的影響。米根霉突變株CICC40503-JST能夠較好地以葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)L-蘋果酸，其產(chǎn)量得到有效提高，研究結果可為該菌株利用單糖或多糖發(fā)酵進行生物轉化提供參考。在后期實驗中，中和劑的有效利用、對代謝的調(diào)控和菌種的高產(chǎn)選育仍然是我們的研究重點。

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Optimization of Medium Components and Fermentation Conditions for L-Malic Acid Production by Rhizopus oryzae

LIU Ya, YANG Ying, SUN Ting, WANG Haitao, ZHANG Min, PAN Lijun, JIANG Shaotong, LI Xingjiang*(School of Biotechnology and Food Engineering, Hefei University of Technology, Hefei 230009, China)

In order to improve the yield ofL-malic acid, the fermentation process and glucose metabolism pathways forRhizopus oryzaemutant strain CICC40503-JST were preliminary studied in this paper. The culture medium and fermentation conditions were optimized by using combination of single factor method and response surface methodology with central composite design. Meanwhile, the production and possible metabolic pathway ofL- malic acid were explored using stirred tank fermentor. The results showed that the optimal medium composition for malate production were determined as follows: glucose, (NH4)2SO4, MgSO4, FeSO4·7H2O, KH2PO4, ZnSO4and CaCO3100, 4.0, 0.3, 0.025, 0.5, 0.1 and 80 g/L, respectively. The fermentation conditions were optimized to be spore suspension incubation for 48 h and subsequent fermentation in a Sartorius fermentor at 32℃for 48 h followed by another 24 h after addition of fresh culture medium with a ventilation rate of volume of 0.20 L/(min·L) and a rotation rate of 500 r/min. Under these conditions, the yield ofL-malic acid was 57.71 g/L. In conclusion, the yield of malate could be improved significantly through effective utilization of glucose under the optimized culture conditions.

Rhizopus oryzae; glucose;L-malic acid; central composite design; enzyme activity

TS201.3

1002-6630（2015）11-0100-10

10.7506/spkx1002-6630-201511020

2014-05-13

國家自然科學基金青年科學基金項目（31101352）；國家自然科學基金面上項目（31470002）

劉亞（1990—），男，碩士研究生，研究方向為食品微生物發(fā)酵。E-mail：liuya@mail.hfut.edu.cn

*通信作者：李興江（1978—），男，副教授，博士，研究方向為食品微生物發(fā)酵。E-mail：lixingjiang1978@hfut.edu.cn