苦丁冬青苦丁茶中咖啡?？崴犷愇镔|(zhì)與牛血清白蛋白的相互作用

徐冬蘭，周 莉，胡 冰，孫 怡，曾曉雄

苦丁冬青苦丁茶中咖啡?？崴犷愇镔|(zhì)與牛血清白蛋白的相互作用

徐冬蘭，周 莉，胡 冰，孫 怡*，曾曉雄

（南京農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，江蘇 南京 210095）

從苦丁冬青苦丁茶中分離純化得到了4種咖啡?？崴幔╟affeoylquinic acids，CQA）：5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA，并在模擬人體生理?xiàng)l件（pH 7.4，310 K）下，利用熒光光譜法分析4種CQA與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的相互作用，使用修正后的Stern-Volmer方程與van’t Hoff方程探討CQA-BSA之間的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位點(diǎn)數(shù)及熱力學(xué)參數(shù)。結(jié)果表明：4種CQA均能與BSA結(jié)合，從而導(dǎo)致BSA分子內(nèi)部熒光發(fā)生猝滅，結(jié)合能力的大小順序?yàn)?,4-diCQA＞3,5-diCQA＞4,5-diCQA＞5-CQA，說明咖啡?；脑龆嗵岣吡私Y(jié)合能力。熱力學(xué)參數(shù)ΔH＞0、ΔS＞0和ΔG＜0，表明CQA與BSA主要靠疏水作用力結(jié)合，反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行。此外，CQA的結(jié)合引起B(yǎng)SA 3D熒光光譜和同步熒光光譜的變化，表明兩者之間的結(jié)合主要是通過與BSA中色氨酸和酪氨酸的作用而實(shí)現(xiàn)的。

苦丁茶；咖啡酰奎尼酸；牛血清白蛋白；熒光光譜；相互作用

血清白蛋白是血漿中最豐富的蛋白質(zhì)，具有貯運(yùn)內(nèi)源代謝產(chǎn)物和外源性小分子等重要生理功能。當(dāng)藥物進(jìn)入人體后，首先通過血漿的貯存與運(yùn)輸達(dá)到受體部位，進(jìn)而發(fā)揮藥理作用。因此，研究藥物小分子和血清白蛋白的結(jié)合對于確定藥物的藥代動力學(xué)和藥效方面的性質(zhì)有著非常重要的作用[1]。近年來，茶多酚的多種藥理作用已被廣泛證明，探討茶多酚與蛋白質(zhì)之間的相互結(jié)合機(jī)理也成為了一個(gè)熱點(diǎn)[2]。例如，張海蓉等[3]利用光譜學(xué)方法研究了兒茶素與牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）之間的相互作用，確定了兩者結(jié)合的結(jié)合常數(shù)、結(jié)合位置和結(jié)合類型等參數(shù)。柳全文等[4]的研究表明咖啡酸能與BSA發(fā)生結(jié)合，從而導(dǎo)致其內(nèi)部的熒光發(fā)生猝滅。Nozaki等[5]采用圓二色譜法研究了表沒食子兒茶素沒食子酸酯（（-）-epigallocatechin gallate，EGCG）對BSA構(gòu)象的影響，探討了EGCG在BSA分子中的具體結(jié)合位點(diǎn)。

苦丁茶是由冬青科或木犀科等植物的葉加工而成的一種代用茶，在我國有著2 000多年的飲用歷史[6-8]?？喽〔柚饕譃閮纱箢悾憾嗫瓶喽〔韬湍鞠瓶喽〔?。目前用于加工苦丁茶的主要原料為冬青科的苦丁茶冬青、大葉冬青和枸骨[9-10]?？喽〔韪缓啤⒎铀犷?、黃酮以及氨基酸等多種活性物質(zhì)，具有抗氧化、抗炎癥、抗腫瘤以及降脂減肥等功效[11-12]。在前期的研究中，Liu Lixiang等[13]發(fā)現(xiàn)苦丁冬青苦丁茶中的主要多酚類物質(zhì)為咖啡?？崴幔╟affeoylquinic acids，CQA）類物質(zhì)，并表明其具有較強(qiáng)的體外抗氧化活性。王晴川等[14]以苦丁冬青苦丁茶為材料，通過柱層析和半制備色譜分離純化得到了6種CQA類物質(zhì)，包括3-CQA、4-CQA、5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA，其結(jié)構(gòu)式見圖1。CQA被證明具有多種藥理功能，如抗氧化活性、抑制消化酶作用、降低血糖以及抑制腫瘤發(fā)生等[15-18]。然而，關(guān)于CQA與血清白蛋白的相互作用卻鮮有報(bào)道。因此，在前期的研究基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)采用熒光光譜法研究并比較4種CQA（5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA）與BSA的結(jié)合作用，為闡明CQA在體內(nèi)的運(yùn)輸、吸收和代謝提供重要信息。

圖1 苦丁茶中CQA類物質(zhì)結(jié)構(gòu)Fig.1 General structures of caffeoylquinic acid derivatives (CQAs) from Kudingcha

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

苦丁冬青苦丁茶海南椰仙生物科技有限公司；大孔樹脂HP-20日本三菱公司。

四種咖啡?？崴幔?-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA、4,5-diCQA實(shí)驗(yàn)室自制，純度均＞95%；牛血清白蛋白（相對分子質(zhì)量為66 210）、Tris-HCl緩沖溶液（pH 7.4，0.05 mol/L，含0.1 mol/L NaCl）、甲醇（色譜純）美國Sigma公司；其他試劑均為分析純，實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。

1.2儀器與設(shè)備

F-7000型熒光分光光度計(jì)日本Hitachi公司；BL-220H分析天平日本Shimadzu公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋江蘇國華電器有限公司；Heidolph Laborota 4000真空旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀德國Heidolph公司；LyoQuest-55真空冷凍干燥機(jī)西班牙Telstar公司；Agilent 1100高效液相色譜儀美國Agilent公司；?KTA Purifier蛋白純化系統(tǒng)美國通用電氣公司。

1.3方法

1.3.1 5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA的制備

采用本實(shí)驗(yàn)室建立的方法[14,19]并稍作修改。稱取適量粉碎過篩的苦丁冬青苦丁茶粉末，以1∶10（m/V）的料液比加入沸水并于95℃水浴中浸提45 min，5 000×g離心15 min，取上清液，將剩余殘?jiān)貜?fù)抽提兩次，合并上清液，濃縮、冷凍干燥得到苦丁茶多酚粗提物。將粗提物用去離子水配制成溶液，上樣于HP-20大孔樹脂層析柱（5 cm×30 cm），之后分別用3個(gè)柱床體積的純水與體積分?jǐn)?shù)70%的乙醇洗脫，高效液相色譜法（high performance liquid chromatography，HPLC）在線檢測，收集相應(yīng)的洗脫液，并濃縮、冷凍干燥，經(jīng)Folin-Ciocalteu法測定初步純化產(chǎn)物總多酚含量為78.4%。以初步純化產(chǎn)物為原料，采用?KTA純化系統(tǒng)制備4種CQA單體，純化流程使用YMC-PACK ODS-A色譜柱（10 cm×250 mm，5μm），檢測波長為280 nm，每次進(jìn)樣500μL，流速為2 mL/min，先后用體積分?jǐn)?shù)為20%和40%的甲醇洗脫。根據(jù)HPLC檢測結(jié)果將出峰時(shí)間相同的物質(zhì)富集起來，對照各CQA的標(biāo)準(zhǔn)品，合并相同的組分，經(jīng)濃縮、凍干，得到5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA。經(jīng)過HPLC分析，4種CQA峰形清晰、單一，純度均在95%以上。

1.3.2 CQA與BSA相互作用的熒光光譜分析

熒光光譜測定：BSA和CQA均用Tris-HCl緩沖溶液（pH 7.4）溶解。在5 mL離心管中準(zhǔn)確移入3.0 mL 1.0×10-6mol/L的BSA溶液，用移液槍分別加入不同濃度（2.5×10-6、5.0×10-6、7.5×10-6、1.0×10-5、1.25×10-5、1.5×10-5、1.75×10-5mol/L）的4種CQA（5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA或4,5-diCQA）溶液。使用1.0 cm的石英比色皿，設(shè)定激發(fā)光柵和發(fā)射光柵的狹縫寬度為5.0 nm，激發(fā)波長（λex）為280 nm，恒溫掃描BSA及反應(yīng)混合物在290～450 nm波長范圍內(nèi)的熒光發(fā)射光譜。并以280 nm/340 nm為激發(fā)波長/發(fā)射波長（λex/λem），測定不同溫度（293、310 K）條件下體系的熒光強(qiáng)度，所得實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用于猝滅常數(shù)和結(jié)合常數(shù)等的計(jì)算。

3D熒光光譜分析：設(shè)定激發(fā)波長與發(fā)射波長的掃描范圍均為200～600 nm，狹縫寬度為5 nm，得到BSA及CQA-BSA反應(yīng)混合物的3D圖譜。

同步熒光光譜測定：在310 K的溫度條件下，采用同步掃描模式，將激發(fā)和發(fā)射波長之間的差值分別固定在15 nm和60 nm（Δλ=15、60 nm），狹縫寬度為5.0 nm，掃描速率為1 200 nm/min，同時(shí)掃描激發(fā)光譜和發(fā)射光譜，記錄BSA及反應(yīng)混合溶液的同步熒光光譜。

2 結(jié)果與分析

2.1 CQA對BSA熒光光譜的猝滅效應(yīng)

熒光光譜通常用來研究藥物及其他小分子與蛋白質(zhì)之間的相互作用[20]。小分子的結(jié)合可能導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部熒光發(fā)生猝滅。BSA分子中含有色氨酸、酪氨酸等氨基酸殘基使其具有內(nèi)源性熒光，并在激發(fā)波長和發(fā)射波長分別為280 nm和340 nm處有最大熒光峰[21]。由圖2可知，保持BSA的濃度不變，當(dāng)加入不同濃度的CQA后，BSA的熒光光譜發(fā)生了猝滅。隨著CQA濃度的不斷增大，BSA的熒光強(qiáng)度明顯降低。3種二取代咖啡?？崴幔?,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA）的猝滅效果大于單取代咖啡?？崴幔?-CQA），表明CQA和BSA之間發(fā)生了結(jié)合作用，并且分子中咖啡酰基的增多提高了CQA的結(jié)合能力。此外，BSA的最大發(fā)射波長發(fā)生微弱紅移（5-CQA從340 nm移至344 nm；3,4-diCQA從340 nm移至348 nm；3,5-diCQA從340 nm移至345 nm；4,5-diCQA從340 nm移至344 nm），表明CQA的結(jié)合導(dǎo)致了BSA發(fā)色團(tuán)疏水環(huán)境的改變。

圖2 310 K溫度條件下5-CQA（A）、3,4-diCQA（B）、3,5-diCQA（C）和4,5-diCQA（D）對BSA熒光圖譜的猝滅效應(yīng)Fig.2 Fluorescence quenching effects of 5-CQA (A), 3,4-diCQA (B), 3,5-diCQA (C) and 4,5-diCQA (D) on fluorescence spectra of BSA at 310 K

2.2 CQA對BSA的熒光猝滅機(jī)理及猝滅常數(shù)分析

熒光猝滅的機(jī)理主要分為動態(tài)猝滅和靜態(tài)猝滅。動態(tài)猝滅是由處于激發(fā)態(tài)的熒光分子與猝滅劑發(fā)生碰撞接觸而產(chǎn)生的，而靜態(tài)猝滅則是由處于基態(tài)的熒光分子與猝滅劑生成了不發(fā)熒光的復(fù)合物引起的[22]。為了確定CQA對BSA的猝滅機(jī)理，采用Stern-Volmer方程[23]分析熒光猝滅數(shù)據(jù)：

式中：F0、F分別表示猝滅劑不存在和存在時(shí)蛋白質(zhì)的熒光強(qiáng)度；[Q]為猝滅劑濃度；Kq為雙分子表觀猝滅速率常數(shù)；τ0為無猝滅劑存在時(shí)熒光分子的平均壽命，大部分生物大分子的熒光壽命為10-8s；Ksv為猝滅常數(shù)。

根據(jù)式（1），以F0/F對CQA濃度[Q]作圖，得到Stern-Volmer猝滅曲線，結(jié)果如圖3所示。根據(jù)曲線斜率計(jì)算得到CQA和BSA之間相互作用的表觀猝滅速率常數(shù)Kq及猝滅常數(shù)Ksv，結(jié)果見表1。對于動態(tài)猝滅，各類猝滅劑對生物大分子的最大Kq約為2×1010L/（mol·s）[24]。此外，動態(tài)和靜態(tài)猝滅可根據(jù)猝滅常數(shù)Ksv隨溫度的變化關(guān)系加以判斷。對于動態(tài)猝滅，由于其依賴于擴(kuò)散，因此溫度的升高將增加有效碰撞和加劇電子轉(zhuǎn)移過程，使Ksv隨溫度升高而增大，而靜態(tài)猝滅則正好相反[22]。根據(jù)表1數(shù)據(jù)可知，隨著溫度的升高，4種CQA類物質(zhì)對BSA的熒光猝滅常數(shù)Ksv均呈減小趨勢，并且反應(yīng)的Kq遠(yuǎn)大于各類猝滅劑對生物大分子的最大猝滅常數(shù)2×1010L/（mol·s），表明反應(yīng)形成了BSA-CQA基態(tài)復(fù)合體，猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅。另外，3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA的猝滅常數(shù)均大于5-CQA，說明diCQA與BSA更易形成穩(wěn)定的復(fù)合物，與猝滅效應(yīng)分析的結(jié)果一致。

圖3 不同溫度條件下5-CQA（A）、3,4-diCQA（B）、3,5-diCCQQAA（C）和4,5-diCQA（D）猝滅BSA的Stern-Volmer圖Fig.3 Stern-Volmer plots of BSA quenched by 5-CQA (A), 3,4-diCQA (B), 3,5-diCQA (C) and 4,5-diCQA (D) at different temperatures

表1 不同溫度條件下CQA對BSA的猝滅常數(shù)Table 1 Stern-Volmer quenching constants for the interactions of CQAs with BSA at different temperatures

2.3 結(jié)合常數(shù)及結(jié)合位點(diǎn)數(shù)的確定

對于靜態(tài)猝滅過程，當(dāng)小分子與大分子結(jié)合時(shí)，熒光猝滅強(qiáng)度與猝滅劑濃度之間的關(guān)系可用修正后的Stern-Volmer方程描述：

式中：Ka為CQA與BSA的結(jié)合常數(shù)；n為結(jié)合位點(diǎn)數(shù)。

以lg[（F0-F）/F]對lg[Q]作圖可得一組直線（圖4），由直線的斜率和截距可以求出不同CQA與BSA 相互作用的結(jié)合常數(shù)Ka和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n（表2）。

圖4 不同溫度條件下5-CQA（A）、3,4-diCQA（B）、3,5-diCQA（CC）和4,5-diCQA（D）對BSA熒光猝滅的雙對數(shù)圖Fig.4 Double logarithmic curves for the quenching of BSA fluorescence by 5-CQA (A), 3,4-diCQA (B), 3,5-diCQA (C) and 4,5-diCQA (D) at different temperatures

小分子與大分子之間的相互作用力包括氫鍵、范德華力、靜電作用及疏水作用力[25]。在溫度變化不大時(shí)，反應(yīng)的焓變ΔH可以看作一個(gè)常量，根據(jù)van’t Hoff方程，可計(jì)算出ΔH和ΔS。

式中：K為相應(yīng)溫度下（293、310 K）反應(yīng)體系的結(jié)合常數(shù)；R為氣體常數(shù)。

根據(jù)公式（3）、（4）計(jì)算得到ΔH和ΔS，再由式（5）計(jì)算得到ΔG，結(jié)果列于表2。

表2 不同溫度條件下CQA與BSA的結(jié)合常數(shù)及相關(guān)熱力學(xué)參數(shù)Table 2 Binding parameters and relative thermodynamic variables forCQAs binding to BSA at different temperatures

圖4和表2的結(jié)果表明，CQA和BSA之間存在強(qiáng)大的結(jié)合力，并且diCQA的結(jié)合能力強(qiáng)于5-CQA。所有CQA的結(jié)合常數(shù)均隨著溫度升高而增大，這表明溫度升高后，CQA與BSA的結(jié)合能力略有增強(qiáng)，從而導(dǎo)致BSA-CQA復(fù)合體的穩(wěn)定性增加。n值約為1，表明CQA與BSA具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。

2.4 CQA與BSA相互作用的熱力學(xué)參數(shù)及結(jié)合類型的確定

由表2可知，4種CQA與BSA反應(yīng)的ΔG＜0，表明反應(yīng)是自發(fā)進(jìn)行。Ross等[26]根據(jù)大量實(shí)驗(yàn)總結(jié)了水相中小分子與生物大分子結(jié)合的熱力學(xué)參數(shù)與主要作用力之間的關(guān)系，1）若ΔH＞0、ΔS＞0，則為疏水作用力；2）若ΔH＜0、ΔS＜0，則為氫鍵和范德華力；3）若ΔH≈0，ΔS＞0，則為靜電引力。根據(jù)表2計(jì)算結(jié)果，CQA與BSA結(jié)合反應(yīng)的ΔH和ΔS均＞0，表明反應(yīng)的主要作用力為疏水相互作用。

2.5 CQA對BSA的3D熒光猝滅效應(yīng)

圖5 BSA及CQA-BSA復(fù)合體的3D熒光光譜Fig.5 Three dimensional spectral contour maps of BSA and BSA-CQA system

近年來，蛋白質(zhì)的3D熒光圖譜經(jīng)常被用來研究小分子對蛋白分子結(jié)構(gòu)的影響[27]。如圖5所示，4種CQA與BSA結(jié)合后，對BSA的熒光特征吸收峰產(chǎn)生了影響。CQA在檢測波長內(nèi)無熒光峰，BSA在激發(fā)波長為230 nm和280 nm，發(fā)射波長為340 nm處分別有一個(gè)最大吸收峰。其中230 nm/340 nm（λex/λem）處的特征光譜峰是由于蛋白質(zhì)肽鏈結(jié)構(gòu)中π-π*和n-π*電子轉(zhuǎn)移引起的，而280 nm/340 nm（λex/λem）處的吸收峰表現(xiàn)的是蛋白結(jié)構(gòu)中酪氨酸和色氨酸殘基的光譜特性[22]。當(dāng)加入CQA后，BSA的兩個(gè)特征峰均被不同程度地猝滅，表明CQA與BSA發(fā)生了結(jié)合，從而導(dǎo)致蛋白肽鏈的伸展，分子內(nèi)部的熒光發(fā)色基團(tuán)所處的微環(huán)境發(fā)生變化。

2.6 CQA對BSA構(gòu)象的影響

蛋白質(zhì)的同步熒光光譜常被用來判斷蛋白質(zhì)的構(gòu)象變化，得到關(guān)于生色團(tuán)分子周圍環(huán)境的信息[28]。當(dāng)固定激發(fā)波長和發(fā)射波長的掃描差值為15 nm（Δλ=15 nm）時(shí)，只顯示酪氨酸殘基的熒光特征光譜，當(dāng)固定Δλ=60 nm時(shí)，只顯示色氨酸殘基的特征熒光，因此由熒光波長的改變可判斷蛋白質(zhì)中酪氨酸和色氨酸殘基所處微環(huán)境的變化[29]。牛血清白蛋白含有色氨酸和酪氨酸殘基，當(dāng)加入不同CQA后，其在Δλ為15 nm和60 nm處的同步熒光光譜均發(fā)生了改變（圖6）。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)濃度固定時(shí)，隨著CQA濃度的增加，BSA中色氨酸殘基和酪氨酸殘基的熒光強(qiáng)度都不斷降低，表明CQA可以猝滅BSA內(nèi)部熒光，并且3種diCQA的猝滅效果大于5-CQA。從圖中還可以看出，CQA使BSA中色氨酸殘基的最大激發(fā)波長發(fā)生了紅移，而酪氨酸殘基的最大激發(fā)波長則發(fā)生了微弱的藍(lán)移，表明兩者的結(jié)合影響了BSA的構(gòu)象，改變了兩個(gè)殘基所處微環(huán)境的疏水性。由此可以判斷CQA與BSA的相互作用可能是通過CQA與色氨酸和酪氨酸的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。

圖6 CQA與BSA相互作用的同步熒光光譜Fig.6 Synchronous fluorescence spectra of CQA-BSA interaction

3 結(jié) 論

采用熒光光譜的方法研究與比較了苦丁冬青苦丁茶中5-CQA、3,4-diCQA、3,5-diCQA和4,5-diCQA在不同溫度條件下與BSA的相互作用。研究發(fā)現(xiàn)4種CQA均能與BSA發(fā)生結(jié)合，形成穩(wěn)定復(fù)合物，導(dǎo)致BSA的熒光發(fā)生猝滅，并且diCQA的猝滅效果大于5-CQA，表明結(jié)構(gòu)中的咖啡?；鶎Y(jié)合過程貢獻(xiàn)很大。Stern-Volmer方程分析得到兩個(gè)溫度下（293、310 K）的猝滅常數(shù)，表明猝滅機(jī)理為靜態(tài)猝滅。采用修正后的Stern-Volmer方程計(jì)算了反應(yīng)的結(jié)合常數(shù)和結(jié)合位點(diǎn)數(shù)，說明CQA和BSA之間存在強(qiáng)大的結(jié)合力，具有一個(gè)結(jié)合位點(diǎn)。熱力學(xué)參數(shù)計(jì)算結(jié)果表明CQA與BSA之間主要依靠疏水作用力結(jié)合，反應(yīng)自發(fā)進(jìn)行。CQA的結(jié)合引起B(yǎng)SA 3D光譜和同步熒光光譜的變化，推測CQA與BSA的作用可能是通過與BSA中色氨酸和酪氨酸殘基的結(jié)合而實(shí)現(xiàn)的。本實(shí)驗(yàn)為探討咖啡?；崴犷惢衔镌谏矬w內(nèi)的作用及其機(jī)制提供了重要信息。

[1] MULLER W E, WOLLERT U. Human serum albumin as a‘silent receptor’for drugs and endogenous substances[J]. Pharmacology, 1979, 19(2): 59-67.

[2] BANDYOPADHYAY P, GHOSH A K, GHOSH C. Recent developments on polyphenol-protein interactions: effects on tea and coffee taste, antioxidant properties and the digestive system[J]. Food & Function, 2012, 3(6): 592-605.

[3]張海蓉,邊賀東,潘英明,等.光譜法研究兒茶素與牛血清白蛋白的相互作用[J].光譜學(xué)與光譜分析, 2009, 29(11): 3052-3056.

[4]柳全文,徐慧,李桂華,等.咖啡酸與牛血清白蛋白相互作用的熒光光譜法研究[J].食品科學(xué), 2010, 31(1): 24-28.

[5] NOZAKI A, HORI M, KIMURA T, et al. Interaction of polyphenols with proteins: binding of (-)-epigallocatechin gallate to serum albumin, estimated by induced circular dichroism[J]. Chemical & Pharmaceutical Bulletin, 2009, 57(2): 224-228.

[6]劉國民,李娟玲,陳榆,等.我國苦丁茶冬青種質(zhì)資源的形態(tài)學(xué)研究Ⅰ.莖葉的形態(tài)學(xué)研究[J].貴州科學(xué), 2004, 22(3): 9-23.

[7]王新,陸慧寧,林少琨.苦丁茶冬青葉化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].天然產(chǎn)物研究與開發(fā), 2005, 17(3): 366-370.

[8]劉韶,杜方麓.冬青屬苦丁茶研究進(jìn)展[J].湖南中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2001, 21(2): 68-70.

[9]陳杖洲.苦丁茶的開發(fā)及其利用[J].中國茶葉加工, 1998(4): 29-31.

[10] 鄢東海.苦丁茶名稱的演變、植物種類及保健價(jià)值[J].貴州農(nóng)業(yè)科學(xué), 2007, 35(1): 114-116.

[11] LI L, XU L J, MA G Z, et al. The large-leaved kudingcha (Ilex latifoliaThunb andIlex kudingchaC.J. Tseng): a traditional Chinese tea with plentiful secondary metabolites and potential biological activities[J]. Journal of Natural Medicines, 2013, 67(3): 425-437.

[12]劉瑾,丁平.冬青屬藥用植物資源、化學(xué)成分及藥理作用研究進(jìn)展[J].廣州中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào), 2008, 25(3): 277-280.

[13] LIU Lixiang, SUN Yi, LAURU T, et al. Determination of polyphenolic content and antioxidant activity of kudingcha made fromIlex kudingchaC.J. Tseng[J]. Food Chemistry, 2009, 112(1): 35-41.

[14]王晴川,張鑫,張文芹,等.苦丁冬青苦丁茶中咖啡?？崴犷愇镔|(zhì)的分離純化和高效液相色譜法分析[J].食品科學(xué), 2013, 34(22): 119-122. doi: 10.7506/spkx1002-6630-201322024.

[15] THUONG P T, SU N D, NGOC T M, et al. Antioxidant activity and principles of Vietnam bitter teaIlex kudingcha[J]. Food Chemistry, 2009, 113(1): 139-145.

[16] SONG Chengwu, XIE Chao, ZHOU Zhiwen, et al. Antidiabetic effect of an active components group fromIlex kudingchaand its chemical composition[J]. Evidence-Based Complementary & Alternative Medicine, 2012. doi: 10.1155/2012/423690.

[17] MURASE T, MISAWA K, MINEGISHI Y, et al. Coffee polyphenols suppress diet-induced body fat accumulation by downregulating SREBP-1c and related molecules in C57BL/6J mice[J]. American Journal of Physiology: Endocrinology and Metabolism, 2011, 300(1): E122-E133.

[18] OOI K L, MUHAMMAD T S T, TAN M L, et al. Cytotoxic, apoptotic and anti-α-glucosidase activities of 3,4-di-O-caffeoyl quinic acid, an antioxidant isolated from the polyphenolic-rich extract ofElephantopus mollisKunth[J]. Journal of Ethnopharmacology, 2011, 135(3): 685-695.

[19]孫怡,張鑫,張文芹,等.苦丁茶冬青苦丁茶中多酚類物質(zhì)的分離純化與結(jié)構(gòu)解析[J].食品科學(xué), 2011, 32(11): 60-63.

[20] RAWEL H A, MEIDTNER K, KROLL J. Binding of selected phenolic compounds to proteins[J]. Journal of Agricultural and Food Chemistry, 2005, 53(10): 4228-4235.

[21] LI Daojin, WANG Ye, CHEN Jianjun, et al. Characterization of the interaction between farrerol and bovine serum albumin by fluorescence and circular dichroism[J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2011, 79(3): 680-686.

[22] SINGHA R A, PANDEY N K, DASGUPTA S. Preferential binding of fisetin to the native state of bovine serum albumin: spectroscopic and docking studies[J]. Molecular Biology Reports, 2013, 40(4): 3239-3253.

[23] LAKOWICZ J R. Principles of fluorescence spectroscopy[M]. New York: Springer, 2006: 8-12.

[24] BI Shuyun, SONG Daqian, KAN Yuhe, et al. Spectroscopic characterization of effective components anthraquinones in Chinese medicinal herbs binding with serum albumins[J]. Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy, 2005, 62(1): 203-212.

[25] WU Xuli, WANG Wenpu, ZHU Tian, et al. Phenylpropanoid glycoside inhibition of pepsin, trypsin and α-chymotrypsin enzyme activity in Kudingcha leaves fromLigustrum purpurascens[J]. Food Research International, 2013, 54(2): 1376-1382.

[26] ROSS P D, SUBRAMANIAN S. Thermodynamics of protein association reactions: forces contributing to stability[J]. Biochemistry, 1981, 20(11): 3096-3102.

[27] YUE Yuanyuan, ZHANG Yaheng, QIN Jin, et al. Study of the interaction between esculetin and human serum albumin by multispectroscopic method and molecular modeling[J]. Journal of Molecular Structure, 2008, 888(1/3): 25-32.

[28]陶慧林,黎舒懷,徐銘澤,等.山奈素與牛血清蛋白相互作用: Tachiya模型與Stern-Volmer方程的對比研究[J].分析測試學(xué)報(bào), 2013, 32(2): 186-192.

[29] LIU Xiaoli, XIA Wenshui, JIANG Qixing, et al. Binding of a novel bacteriostatic agent-chitosan oligosaccharides-kojic acid graft copolymer to bovine serum albumin: spectroscopic and conformation investigations[J]. European Food Research and Technology, 2015, 240(1): 109-118.

Interaction of Caffeoylquinic Acid Derivatives from Ilex kudingcha C. J. Tseng with Bovine Serum Albumin

XU Donglan, ZHOU Li, HU Bing, SUN Yi*, ZENG Xiaoxiong
(College of Food Science and Technology, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China)

In the present study, the interactions between bovine serum albumin (BSA) and four caffeoylquinic acid (CQA) derivatives (5-CQA, 3,4-diCQA, 3,5-diCQA and 4,5-diCQA) isolated from the leaves ofIlex kudingchaC. J. Tseng were investigated by fluorescence spectroscopy under simulated physiological condition (pH 7.4 and 310 K). The binding parameters were calculated according to modified Stern-Volmer equation, and the thermodynamic parameters were determined by the van’t Hoff equation. The results showed that CQA derivatives interacted with BSA, and the binding constants were ranked in the following order: 3,4-diCQA ＞ 3,5-diCQA ＞ 4,5-diCQA ＞ 5-CQA, suggesting that the addition of caffeoyl moiety significantly increased the binding capacity. Thermodynamic analysis showed that the ΔHand ΔSvalues were both positive and the ΔGwas negative, indicating that the interaction process was spontaneous, and hydrophobic force might be primarily responsible for the interaction. In addition, the conformational change of BSA was observed by 3D fluorescence and synchr onous fluorescence spectra, indicating that the interaction between CQA and BSA was achieved through the binding of CQA to the tryptophan and tyrosine residues of BSA.

Kudingcha; caffeoylquinic acid; bovine serum albumin; fluorescence spectroscopy; interaction

TS272；TS201.3

1002-6630（2015）11-0006-07

10.7506/spkx1002-6630-201511002

2015-01-26

國家自然科學(xué)基金面上項(xiàng)目（31171666）；江蘇高校優(yōu)勢學(xué)科建設(shè)工程資助項(xiàng)目（PAPD）

徐冬蘭（1990—），女，碩士研究生，研究方向?yàn)槭称飞锛夹g(shù)。E-mail：2013108031@njau.edu.cn

*通信作者：孫怡（1966—），女，高級實(shí)驗(yàn)師，博士，研究方向?yàn)槭称窢I養(yǎng)與化學(xué)。E-mail：sunyi01@njau.edu.cn