不同林齡木麻黃浸提液的GC-MS分析

姚 瑤，李 蕾，2，劉楠楠，陳香燕，曹明奮，徐志霞＊

（1.海南師范大學(xué) 生命科學(xué)院，海南 ?？?71158；2.海南省熱帶動植物生態(tài)學(xué)重點實驗室，海南 ?？?71158）

木麻黃（Casuarina equisetifolia）為雙子葉植物綱木麻黃科木麻黃屬植物，原產(chǎn)于澳大利亞和波利西亞等地［1］。常綠喬木，生長迅速，抗風(fēng)性強，耐鹽堿、貧瘠、干旱土壤。在海南省現(xiàn)有海防林中木麻黃是主要的海防樹種，其面積達到5萬hm2［2］，這些天然屏障優(yōu)化了沿海地區(qū)人民的生活環(huán)境。但由于木麻黃林樹種單一，人工林群落結(jié)構(gòu)簡單，海南許多地方的木麻黃林木枯梢、斷梢，病蟲害嚴(yán)重，出現(xiàn)了自然衰退現(xiàn)象。木麻黃林出現(xiàn)衰退，林分更新困難的一個重要原因是木麻黃能夠分泌化感物質(zhì)抑制其自身生長［3-5］。前期已經(jīng)分析了不同林齡木麻黃林地土壤理化性質(zhì)和生化活性以及木麻黃的浸提液對青皮生長的影響，同時也完成了木麻黃乙醚浸提液的分離與鑒定［6-11］。研究表明，木麻黃分泌的具有化感效應(yīng)的物質(zhì)殘留于土壤中還會影響下一代木麻黃生長，從而導(dǎo)致木麻黃二次更新存在障礙。而這種化感效應(yīng)與化感物質(zhì)的產(chǎn)生部位、化感物質(zhì)的積累有關(guān)，會隨著木麻黃林齡的變化發(fā)生相應(yīng)的變化。為此，對不同林齡木麻黃根、根際土壤及凋落物中的物質(zhì)進行了提取與分離，并用GC-MS氣質(zhì)聯(lián)用儀對其組分進行測定，為木麻黃化感作用的研究提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

在海南省?？谑徐`山海岸和桂林洋海岸的木麻黃海防林中，按林齡劃分為幼齡林（林齡5～8a）、中齡林（林齡15～20a）和成熟林（林齡30a及以上）3種林地。分別采集各林齡林地中凋落物、20～50cm的側(cè)根及根際土壤樣本。

1.2 提取方法

按1kg樣品（凋落物、根、土壤）3L蒸餾水的比例進行浸泡，常溫下浸泡48h并經(jīng)常翻動，用紗布初濾后得到濾液。將所得濾液過0.45μm微孔濾膜，在旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀上進行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)并結(jié)合冷凍干燥儀除去水分。所得樣品分2組，分別加入1mL正己烷和1mL甲醇溶液萃取，最后進行GC-MS檢測。

1.3 GC-MS測定

檢測儀器為GC-MS（氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀，Thermo Finnigan120150-T230L）。色譜柱為 HP-5MS毛細(xì)管柱，固定相為（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷。用電子轟擊源轟擊，電壓為70eV，掃描范圍m／z 30～450amu，掃描速度0.4s，掃描全程，離子源的溫度為250℃。毛細(xì)管柱的規(guī)格30m×0.01 mm×0.25mm；進樣口溫度280℃，柱溫120℃（3 min，以15℃·min-1程序升溫至250℃后，保持3 min；載氣為 He，流量1mL·min-1，進樣量1μL。通過面積歸一化法對鑒定的樣品進行分析，檢索數(shù)據(jù)庫為 NIST 08MS Library and AMDIS。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同林齡木麻黃不同部位浸提液中GC-MS分析結(jié)果

對不同林齡木麻黃不同部位浸提液（正己烷、甲醇萃取）總離子流圖（圖略）中的各色譜峰通過計算機自動在Willey等質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫中查找，對混合物中的組分進行了鑒定和峰面積歸一化計算各組分相對百分含量。

2.1.1 不同林齡木麻黃不同部位浸提液的2種萃取液檢測結(jié)果比較 本試驗分別采用甲醇和正己烷有機溶劑進行萃取，通過對GC-MS的結(jié)果鑒定分析，由2種萃取液處理后檢出100多種物質(zhì)，除去一些烷類后相對含量超過0.1%的物質(zhì)如表1～表6所示。其中酯類檢測出14種，酮類檢測出11種，酚類檢測出6種，酸類檢測出3種，醇類檢測出8種，還有一些吡啶、烯烴等物質(zhì)。其中采用正己烷進行萃取得到的物質(zhì)種類與含量比用甲醇萃取要少。由甲醇作為萃取液檢測出的物質(zhì)多為酮類、醇類、酚類，正己烷萃取液中檢測出的物質(zhì)多為烷類、醇類。

表1 不同林齡木麻黃根的正己烷萃取液中檢測出物質(zhì)的相對含量Table 1 The n-hexane extraction of roots of the C.equisetifolia with different ages %

表2 不同林齡木麻黃根的甲醇萃取液中檢測出物質(zhì)的相對含量Table 2 The methanol extract of roots of the C.equisetifolia with different ages %

2.2 不同林齡木麻黃不同部位浸提液中共有物質(zhì)的分析

表3 不同林齡木麻黃凋落物的正己烷萃取液中檢測出物質(zhì)的相對含量Table 3 The n-hexane extract of litter under the C.equisetifolia with different ages %

除酚類和醇類，試驗結(jié)果表明在不同林齡木麻黃的部分樣品中檢測出一定含量的3，5-二羥基-4，7-二甲氧基黃酮、7，9-二叔丁基-1-氧雜螺（4，5）癸-6，9-二烯-2，8-二酮、棕櫚酸甲酯、硬脂酸甲酯、二苯砜。

表4 不同林齡木麻黃凋落物的甲醇萃取液中檢測出物質(zhì)的相對含量Table 4 The methanol extract of litter under the C.equisetifolia with different ages %

表5 不同林齡木麻黃土壤的正己烷萃取液中檢測出物質(zhì)的相對含量Table 5 The n-hexane extract of soil under the C.equisetifolia with different ages %

表6 不同林齡木麻黃土壤的甲醇萃取液中檢測出物質(zhì)的相對含量Table 6 The methanol extract of soil under the C.equisetifolia with different ages %

2.3 不同林齡木麻黃不同部位浸提液中特有物質(zhì)的分析

在不同林齡木麻黃樣品中鑒定出的特有物質(zhì)主要有52種。在木麻黃的根系及凋落物中均鑒定出25種，其中根系樣品中相對含量較高的主要有9，9，10-三甲基-9，10-二氫蒽、2-（苯基乙炔基）-吡啶、4-丁氧-1-正丁醇、2-三甲基硅基-1，3-二噻吩等。這幾種物質(zhì)皆在中齡林中檢測到，產(chǎn)生這種現(xiàn)象可能與植物體內(nèi)物質(zhì)的轉(zhuǎn)化以及中齡林中特有微生物的作用有關(guān)。木麻黃凋落物樣品中相對含量較高的主要有2-丙基十一烷基亞硫酸酯、蒽，9，10-二氫9，9，10三甲基、吡啶、己二酸二辛酯等。木麻黃土壤樣品中檢測出2種，分別為（Z）-4-硝基-α-（對硝基苯基）肉桂酸和β-甲基d-呋喃糖苷。

3 結(jié)論與討論

GC-MS技術(shù)應(yīng)用廣泛，具有需樣量小、靈敏度高，能對待測組分的功能團進行有效鑒定等優(yōu)點。李艷賓等利用氣相色譜-質(zhì)譜（GC-MS）聯(lián)用技術(shù)分析出棉稈腐解物的化感成分［12］。曾任森等經(jīng)運用GC-MS測定出蜂蟆菊中的5，22-二烯-3-豆甾醇乙酸脂、十六烯酸甲酯和十八烯酸甲酯3個化合物的混合物，并鑒定其具有較弱的化感作用［13］。本文通過GC-MS技術(shù)對不同林齡木麻黃的水浸提液進行鑒定分析，檢測出酸、酯、烷、醛、酮、酰胺及酚類等有機化合物。對這些化合物進行整理分析，發(fā)現(xiàn)不同林齡木麻黃浸提液中共有的物質(zhì)有7種，主要為2，4-二叔丁基苯酚。目前，對酚酸類物質(zhì)的化感作用研究較多，秦波［14］等人的研究表明2，4-二叔丁基苯酚對稗草、水稻、萵苣種子的萌發(fā)以及幼苗生長的綜合抑制作用活性很強。王明道［15］等人通過GC-MS從地黃組織中分離鑒定出2，4-二叔丁基苯酚，并通過驗證性試驗證明該物質(zhì)是地黃抑制芝麻生長發(fā)育的主要化感物質(zhì)。吳鳳芝［16］等通過實驗發(fā)現(xiàn)高濃度的酚酸會破壞植物葉綠體、線粒體和細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，會破壞根系細(xì)胞核及貯藏組織結(jié)構(gòu)。Roshchi-na［17］等人研究報道一些多酚類化合物能抑制受體植物SOD和CAT酶活性，導(dǎo)致體內(nèi)活性氧增多，啟動膜脂過氧化，進而產(chǎn)生化感作用，抑制植物對養(yǎng)分的吸收。除2，4-二叔丁基苯酚外，還檢測出醇類、酮類及酯類等6種共有物質(zhì)。而不同林齡木麻黃浸提液中特有的物質(zhì)檢測出52種（根系中含有25種、土壤中含有2種、凋落物中含有25種）。

從不同林齡不同部位的浸提液中物質(zhì)的種類數(shù)量和其相對百分含量來看，中齡林木麻黃凋落物中檢測出物質(zhì)最為豐富，而在木麻黃中齡林的其他部位浸提液中物質(zhì)種類也是相對比較多的。這些物質(zhì)的相對含量較高，說明可能對木麻黃的自身生長和代謝密切相關(guān)，可能是影響其衰退的潛在因素。它們的相對含量在不同林齡不同部位的浸提液中是變化的，這與物質(zhì)分泌途徑、微生物作用以及木麻黃自身生長需要有關(guān)，其中微生物的作用是非常重要的。李小容［8］等對海南島不同林齡的木麻黃林地土壤微生物的功能多樣性進行研究，發(fā)現(xiàn)其多樣性是隨林齡的增加而增高的。而不同林齡木麻黃林地的土壤具有特有的微生物，這也是不同林齡木麻黃林地土壤中檢測出物質(zhì)的種類和相對含量差別的原來之一。

目前研究數(shù)據(jù)顯示，3種林齡木麻黃根系、根際土壤，凋落物的水浸提液中檢測到的物質(zhì)已有部分有報道其對植物生長有一定的化感效應(yīng)，而有部分物質(zhì)尚未見報道，但是這幾十種物質(zhì)究竟是否對木麻黃產(chǎn)生自毒作用和作用機理尚待進一步研究。

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