饑餓誘導(dǎo)人胚腎細(xì)胞自噬模型的構(gòu)建

黃楨鈞 劉慰華 鐘赟 劉少軍

基礎(chǔ)研究論著

饑餓誘導(dǎo)人胚腎細(xì)胞自噬模型的構(gòu)建

黃楨鈞 劉慰華 鐘赟 劉少軍

目的探討?zhàn)囸I誘導(dǎo)的人胚腎細(xì)胞（HEK293）自噬模型的構(gòu)建。方法采用Earle's平衡鹽溶液（EBSS）分別處理HEK293細(xì)胞0、1、2、4、8 h，顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)變化，蛋白免疫印跡法檢測(cè)自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈（LC）3-Ⅱ／LC3-Ⅰ和p62的表達(dá)；雙熒光mRFP-eGFP-LC3（ptfLC3）質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞24 h后，熒光顯微鏡觀(guān)察EBSS饑餓條件下細(xì)胞內(nèi)紅色和綠色LC3熒光亮點(diǎn)的變化。結(jié)果饑餓處理后，HEK293細(xì)胞皺縮、變小變圓，蛋白免疫印跡法可檢測(cè)到LC3的蛋白表達(dá)和LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值增加；熒光顯微鏡可觀(guān)察到細(xì)胞內(nèi)紅色和綠色LC3熒光亮點(diǎn)均增加。結(jié)論饑餓可成功誘導(dǎo)HEK293細(xì)胞自噬，表現(xiàn)為L(zhǎng)C3蛋白表達(dá)和LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值的增加，以及熒光顯微鏡下細(xì)胞內(nèi)紅色和綠色LC3熒光亮點(diǎn)的增加。

饑餓；自噬；自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈3；p62；雙熒光檢測(cè)

自噬是細(xì)胞內(nèi)的一種蛋白降解途徑，即細(xì)胞中受損的蛋白質(zhì)、細(xì)胞器被雙層膜結(jié)構(gòu)包繞形成自噬體，與溶酶體結(jié)合后即可被降解［1］。自噬普遍存在于真核細(xì)胞內(nèi)，無(wú)論是在生理過(guò)程還是在病理狀態(tài)下，均可見(jiàn)自噬現(xiàn)象。研究表明，自噬參與了神經(jīng)退行性疾病、心臟疾病和惡性腫瘤等多種疾病的發(fā)生、發(fā)展［2-3］。當(dāng)細(xì)胞缺乏營(yíng)養(yǎng)即饑餓時(shí)可激活自噬，饑餓性自噬是最基本的自噬過(guò)程。本研究選用常用的工具細(xì)胞——人胚腎細(xì)胞（HEK293細(xì)胞），以Earle's平衡鹽溶液（EBSS）處理作為饑餓手段，建立HEK293細(xì)胞自噬模型，旨在為自噬的研究提供更具有普遍意義的方法學(xué)參考［4］。

材料與方法

一、細(xì)胞來(lái)源

HEK293細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)，采用含10%胎牛血清、1%鏈-青霉素的DMEM培養(yǎng)液，在37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)，0.25%胰酶消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

二、主要試劑

DMEM培養(yǎng)液、EBSS購(gòu)自美國(guó)Gibco公司，雷帕霉素購(gòu)自上海生工生物工程股份有限公司，mRFP-eGFP-自噬微管相關(guān)蛋白輕鏈（LC）3質(zhì)粒購(gòu)自美國(guó)Addgene公司。LC3B兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，p62兔抗人多克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司，內(nèi)參照物GAPDH鼠抗人單克隆抗體購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz公司，辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記羊抗兔、羊抗小鼠IgG購(gòu)自美國(guó)Cell Signaling公司。脂質(zhì)體Lipofactamine 3000轉(zhuǎn)染試劑盒購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司。

三、主要儀器

包括美國(guó)Thermo scientific 3110系列ⅡCO2培養(yǎng)箱，美國(guó)Thermo scientific 1300系列A2生物安全柜，美國(guó)AMG EVOS fl熒光顯微鏡，美國(guó)Thermo scientific BCA蛋白測(cè)定試劑盒，美國(guó)Biotek Epoch酶標(biāo)儀，美國(guó)Bio-Rad電泳儀和轉(zhuǎn)膜儀。

四、方法

1.細(xì)胞形態(tài)變化的觀(guān)察

以EBSS代替DMEM培養(yǎng)液，饑餓處理HEK293細(xì)胞0、1、2、4、8 h，并與另一自噬誘導(dǎo)劑雷帕霉素（200 nmol／L）作陽(yáng)性對(duì)照，使用高倍顯微鏡在400倍視野下觀(guān)察細(xì)胞的形態(tài)變化，并采集相應(yīng)的圖片。

2.LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ和p62蛋白表達(dá)水平檢測(cè)

采用蛋白免疫印跡法，按前述方法分組處理HEK293細(xì)胞，收集蛋白前用4℃預(yù)冷磷酸鹽緩沖液（PBS）洗2遍，加RIPA蛋白裂解液冰上裂解5 min，超聲充分裂解細(xì)胞。調(diào)整蛋白濃度后行12%SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）電泳，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜1 h，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，一抗LC3（1∶2 000）、p62（1∶1 000）和GAPDH（1∶2 000）4℃搖床孵育過(guò)夜。二抗室溫孵育1 h，電化學(xué)發(fā)光顯影。采用Image-Pro Plus 6.0軟件分析灰度值，計(jì)算LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ。

3.自噬流的監(jiān)測(cè)

對(duì)自噬流進(jìn)行雙熒光mRFP-eGFP-LC3監(jiān)測(cè)。采用mRFP-eGFP-LC3質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞，轉(zhuǎn)染24 h后分為未經(jīng)處理的陰性對(duì)照組、EBSS饑餓處理組、雷帕霉素陽(yáng)性對(duì)照組，分別處理2 h。由于eGFP綠色熒光和mRFP紅色熒光在自噬體同時(shí)存在，在紅、綠熒光合成圖像中呈黃色；但在自噬溶酶體酸性環(huán)境中eGFP綠色熒光降解，只剩下紅色熒光。因此可用合成圖像中的黃色斑點(diǎn)（自噬體）和紅色斑點(diǎn)（自噬溶酶體）較完整地反映細(xì)胞內(nèi)自噬囊泡的數(shù)量［5］。分組處理細(xì)胞后在400倍熒光顯微鏡下觀(guān)察，隨機(jī)采集300個(gè)細(xì)胞內(nèi)的紅、綠色LC3熒光圖，計(jì)數(shù)其合成圖像中平均每個(gè)細(xì)胞含有黃色亮點(diǎn)和紅色亮點(diǎn)的數(shù)量。

五、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

結(jié) 果

一、顯微鏡下HEK293細(xì)胞形態(tài)的變化

與對(duì)照組相比，EBSS饑餓處理1 h時(shí)，HEK293細(xì)胞形態(tài)即有明顯變化，細(xì)胞皺縮、變小變圓鈍，隨著饑餓時(shí)間延長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)變化越大；雷帕霉素處理未見(jiàn)明顯細(xì)胞形態(tài)變化，見(jiàn)圖1。

二、HEK293細(xì)胞中LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ和p62蛋白表達(dá)水平變化

與饑餓處理0 h組相比，饑餓處理1 h后LC3-Ⅱ表達(dá)及LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ均增加，2 h達(dá)到峰值，之后逐漸減少；饑餓未明顯誘導(dǎo)p62蛋白表達(dá)下降，見(jiàn)圖2。

三、饑餓處理對(duì)HEK293細(xì)胞自噬流的影響

經(jīng)EBSS及雷帕霉素處理2 h后，紅、黃色熒光亮點(diǎn)數(shù)均比陰性對(duì)照組明顯增加（P＜0.05），提示自噬體和自噬溶酶體增加，說(shuō)明饑餓處理使HEK293細(xì)胞中自噬流增加，見(jiàn)圖3。

討 論

自噬作為與溶酶體相關(guān)的主要蛋白降解途徑之一，影響著細(xì)胞的能量代謝。自噬產(chǎn)生的氨基酸、脂肪酸等降解產(chǎn)物可供細(xì)胞重新利用，因而適度的自噬水平有利于維持細(xì)胞能量代謝促使細(xì)胞存活；而自噬過(guò)度激活可能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。自噬激活或缺陷在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要作用［6-7］。研究細(xì)胞自噬機(jī)制可為惡性腫瘤和神經(jīng)退行性疾病等的治療提供新的途徑和作用靶點(diǎn)［8-10］。自噬是一個(gè)非常復(fù)雜、連續(xù)動(dòng)態(tài)的過(guò)程，目前還沒(méi)有任何一種檢測(cè)方法能夠單獨(dú)反映整個(gè)自噬過(guò)程?，F(xiàn)有檢測(cè)方式缺乏特異性。

圖1 饑餓處理后HEK293細(xì)胞的形態(tài)變化

圖2 饑餓處理后HEK293細(xì)胞內(nèi)LC3和p62的蛋白表達(dá)水平變化

圖3 饑餓處理后HEK293細(xì)胞自噬流增加

電鏡下觀(guān)察到自噬結(jié)構(gòu)是自噬存在最直接的證據(jù)，主要用于定性分析［11］。典型的自噬體為雙層膜結(jié)構(gòu)，其內(nèi)包含有如線(xiàn)粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或高爾基體碎片等細(xì)胞器成分。但自噬體轉(zhuǎn)化為自噬溶酶體后則變?yōu)閱螌幽そY(jié)構(gòu)，其內(nèi)容物也逐漸被降解，自噬囊泡的辨認(rèn)難度加大。另外，細(xì)胞內(nèi)的線(xiàn)粒體或包繞線(xiàn)粒體的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等雙層膜結(jié)構(gòu)，也易與真正的雙層膜自噬體結(jié)構(gòu)混淆。盡管可以對(duì)樣品進(jìn)行多次切片并測(cè)量自噬結(jié)構(gòu)的橫截面積以期定量細(xì)胞自噬活性，但在細(xì)胞中鑒別出自噬體結(jié)構(gòu)本身就已經(jīng)相當(dāng)困難，而且自噬結(jié)構(gòu)在細(xì)胞內(nèi)并非均勻分布，使這種定量方法很難準(zhǔn)確反映細(xì)胞自噬水平。

免疫金電鏡技術(shù)是相對(duì)可行的定量方法，用膠體金顆粒標(biāo)記異噬體和兩性體內(nèi)的異噬內(nèi)容物，或者標(biāo)記自噬前體和自噬體膜上的LC3，從而把自噬前體、自噬體和自噬溶酶體鑒別開(kāi)來(lái)。需要注意的是，這種定量方法也只能反映靜態(tài)自噬水平，不能反映自噬流的變化。另外，丹酰戊二胺染色、吖啶橙染色等方法也可以用于標(biāo)記自噬囊泡，但因特異性較差，應(yīng)用價(jià)值有限。

蛋白免疫印跡法檢測(cè)LC3蛋白表達(dá)水平及LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值變化是簡(jiǎn)便可行的方法。LC3是酵母ATG在哺乳動(dòng)物中的同源物，是目前最可靠的自噬標(biāo)記蛋白。正常情況下，LC3-Ⅰ分布在細(xì)胞質(zhì)中，與磷脂酰乙醇胺結(jié)合形成LC3-Ⅱ后即轉(zhuǎn)移到自噬體的內(nèi)外膜上，并貫穿于整個(gè)自噬過(guò)程。電鏡和GFP-LC3轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證實(shí)，LC3-Ⅱ含量增加能夠反映細(xì)胞內(nèi)自噬囊泡的增加。另外，多種細(xì)胞尤其是腫瘤細(xì)胞存在一定水平的基礎(chǔ)自噬，在細(xì)胞狀態(tài)不同時(shí)LC3-Ⅱ含量也可能發(fā)生明顯變化。因此，LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ比值是反映自噬水平的可靠指標(biāo)。本研究以EBSS制造細(xì)胞饑餓環(huán)境，LC3-Ⅱ及LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰ的增加均在2 h達(dá)到峰值。p62／SQSTM1是一種自噬降解底物，屬于泛素樣結(jié)合蛋白，與LC3偶聯(lián)參與自噬體的形成，在自噬中晚期被降解。自噬激活時(shí)細(xì)胞內(nèi)p62可減少，然而這種減少在很多情況下較難觀(guān)察到［12］。

以GFP-LC3融合蛋白的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，熒光顯微鏡下可觀(guān)察到LC3-Ⅰ呈綠色熒光彌散分布于細(xì)胞質(zhì)中，而LC3-Ⅱ大量聚集在自噬體膜上，呈綠色亮點(diǎn)，或者稱(chēng)為GFP-LC3亮點(diǎn)，亮點(diǎn)可用來(lái)反映自噬體的數(shù)目。這是目前應(yīng)用比較廣泛的自噬定量方法。但由于GFP綠色熒光在自噬溶酶體內(nèi)酸性條件下易降解，GFP-LC3不能完全反映自噬結(jié)構(gòu)。Kimura等［5］根據(jù)RFP紅色熒光不易在溶酶體內(nèi)降解這一原理，使用mRFP-eGFP-LC3轉(zhuǎn)染細(xì)胞，證實(shí)紅色熒光和綠色熒光在自噬前體和自噬體共表達(dá)，呈黃色；而當(dāng)自噬體與溶酶體融合形成自噬溶酶體后，GFP綠色熒光消失，只剩下紅色熒光。因此可以通過(guò)統(tǒng)計(jì)合成圖像中平均每個(gè)細(xì)胞含有的黃色和紅色亮點(diǎn)代表自噬體和自噬溶酶體的數(shù)量，這比單純GFP-LC3法更全面地反映自噬活性和自噬通量的變化。因此，本研究采用mRFP-eGFP-LC3替代GFP-LC3觀(guān)察LC3亮點(diǎn)。

本研究建立了一個(gè)簡(jiǎn)便而實(shí)用的細(xì)胞自噬模型，為進(jìn)一步研究細(xì)胞自噬本身的分子機(jī)制以及自噬在腫瘤等方面的作用提供了可靠的實(shí)驗(yàn)對(duì)象。由于雙熒光mRFP-eGFP-LC3法還未在多種類(lèi)型的細(xì)胞中應(yīng)用，因而還需要進(jìn)行更多的實(shí)驗(yàn)建立更可靠、合理的實(shí)驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)。

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Establishment of HEK293 cell line with starvation-induced autophagy

Huang Zhenjun，Liu Weihua，Zhong Yun，Liu Shaojun.Guangzhou Institute of Cardiovascular Disease／Department of Cardiology，the Second Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou 510260，China

ObjectiveTo establish HEK293 cell model with starvation-induced autophagy.MethodsHEK293 cells were treated with Earle's balanced salt solution（EBSS）for 0，1，2，4 and 8 h.Then the changes in cell morphology were observed under a microscope.And the expression levels of two autophagy-related proteins including LC3 and p62 were detected by western blotting.After transfected with plasmids encoding mRFP-eGFP tandem fluorescent-tagged LC3（ptfLC3）for 24 h，the changes in LC3 puncta labeled with red and green fluorescence were observed under fluorescence microscopy when HEK293 cells were starved in EBSS.ResultsHEK293 cells shrank obviously and became smaller and round after starvation.The expression of LC3 protein and the ratio of LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰwere increased detected by western blotting.The number of LC3 puncta labeled with red and green fluorescence was elevated under fluorescence microscopy.ConclusionsAutophagy in HEK293 cells can be successfully induced by starvation，manifested as increased expression of LC3 protein and enhanced ratio of LC3-Ⅱ／LC3-Ⅰand elevated number of LC3 puncta labeled with red and green fluorescence.

Starvation；Autophagy；LC3；p62；mRFP-eGFP

2014-12-20）

（本文編輯：林燕薇）

10.3969／g.issn.0253-9802.2015.04.004

510260廣州，廣州心血管疾病研究所廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科［黃楨鈞（碩士研究生），劉慰華，鐘赟，劉少軍］

，劉少軍，E-mail：shaojunliu＠yahoo.com