注射用醋酸艾塞那肽緩釋微球的制備及體外釋藥研究

支 欽 李新宇 姚志勇

深圳市健元醫(yī)藥科技有限公司，深圳 518057

注射用醋酸艾塞那肽緩釋微球的制備及體外釋藥研究

支 欽 李新宇 姚志勇

深圳市健元醫(yī)藥科技有限公司，深圳 518057

目的制備注射用醋酸艾塞那肽緩釋微球，以達到緩釋作用，從而減少用藥次數(shù)。方法以聚乳酸-羥基乙酸為載體，羧甲基纖維素鈉水溶液為分散介質(zhì)，乙酸乙酯為有機溶劑，甘露醇為保護劑，通過復乳-液中干燥法和冷凍干燥法制備注射用醋酸艾塞那肽緩釋微球。以微球收率、粒徑、包封率為指標，采用正交試驗法來優(yōu)化微球的處方和制備工藝。采用透析法考察含藥微球的體外釋藥特性，計算微球累積釋藥百分率，繪制體外釋藥曲線。結果通過正交設計篩選出制備注射用醋酸艾塞那肽緩釋微球的處方和制備工藝，載藥量為21.3%，包封率為94.6%，Zeta電位為(-29.3±1.51)mV，含藥緩釋微球的體外釋藥過程符合Higuchi方程。結論制備的注射用醋酸艾塞那肽緩釋微球具有30 d的緩釋效果。

醋酸艾塞那肽;緩釋微球;體外釋放

艾塞那肽最先是從大毒晰的唾液分泌物中分離出來的含有39個氨基酸的天然腸促胰島素類似物，能模擬胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)的作用，從而達到控制血糖的效果。人工合成的艾塞那肽是首個獲準上市的腸促胰島素類似物，體外研究顯示，該化合物可以結合、活化人體GLP-1受體，通過cAMP或其他細胞內(nèi)信號傳導機制來增加葡萄糖依賴性胰島素的合成或增加胰島素在體內(nèi)的分泌，臨床上主要用于改善二甲雙胍和磺酰脲類藥物治療不理想的2型糖尿病患者的血糖控制，還具有心血管保護作用［1-6］。聚乳酸-羥基乙酸(PLGA)是一種高分子材料，它由乳酸和羥基乙酸聚合而成，具有生物相容性的，可在體內(nèi)降解［7-9］。在人體，艾塞那肽半衰期較短，為延長其作用時間，減少患者的用藥次數(shù)，降低血藥濃度峰谷波動，增加患者的順應性，本研究將該藥物制備成緩釋微球，使之具有緩釋效果［10］，并考察其包封率、載藥量和體外釋藥特性。

1 儀器與材料

1.1 儀器

FJ200-T定時高速分散均質(zhì)攪拌機(深圳市鼎鑫宜實驗設備有限公司)，XS64電子天平(十萬分之一，梅特勒-托利多)，e2695高效液相色譜儀(2998型紫外檢測器，美國Waters公司)，Perkinelmer Clarus 500型氣相色譜儀(PE公司)，S-205D超聲波脆碎儀(Harvard Apparatus)，LG-J型冷凍干燥機 (北京四環(huán)科學儀器廠)，JSM-5600LV型掃描電子顯微鏡(SEM)(日本電子光學公司)，高靈敏度Zeta電位及激光粒度分析儀［Zeta phase analysis light scattering(PALS)型，美國布魯克海文儀器公司］。

1.2 材料

乳酸-乙醇酸共聚物(PLGA，25 000，85:15，中國科學院成都有機化學有限公司，批號:130411，藥用級)，醋酸艾塞那肽(自制，純度為98%)，羧甲基纖維素鈉(CMC-Na，天津愛樂易醫(yī)藥材料有限公司，批號:1305206，藥用級)，甘露醇(廣東新寧制藥廠，批號:131003，藥用級)，乙酸乙酯(南京化學試劑股份有限公司，批號:130233，藥用級)。

2 方法與結果

2.1 處方優(yōu)化

通過復乳-溶劑揮發(fā)法制備醋酸艾塞那肽緩釋微球［11-12］。在預實驗的基礎上，得出對微球性質(zhì)影響較為明顯的4個因素，分別為分散介質(zhì)(CMC-Na)的濃度、攪拌速度、PLGA的濃度及投料比。按L9(34)正交表中的4因素、3水平來設計實驗，對4個因素進行考察(表1)。

表1 醋酸艾塞那肽緩釋微球L9(34)正交表因素及水平

以微球包封率(Q1)、收率(Q2)和粒徑落在20～50μm的百分數(shù)(Q3)為指標進行綜合評價(Q)，Q= Q1+Q2+Q3。其中Q值越高，實驗條件越好。試驗方案和結果見表2。

表2 醋酸艾塞那肽緩釋微球L9(34)正交試驗方法及結果

從表2的直觀分析結果可以得出，4個因素對緩釋微球質(zhì)量的影響程度的順序為:A＞B＞C＞D，從而得出最佳化處方為A3B1C1D3，即藥物-PLGA質(zhì)量比為1:5，油水比例為1:3，PLGA的濃度為0.1 g/ml、分散介質(zhì)CMC-Na的濃度為0.4%。

2.2 緩釋微球的制備方法

通過復乳-液中干燥法制備含藥緩釋微球［13-14］。其制備方法為:將66.7 mg藥物加入到6 ml的蒸餾水中，得水相；取PLGA 200 mg，用2 ml的乙酸乙酯溶解，得油相；水相、油相均超聲6min，至溶解。將上述水相加入油相，使用超聲波脆碎儀進行乳化分散，得初乳，然后將初乳緩慢加入到40ml的CMC-Na溶液中(濃度為0.1%)，使用均質(zhì)攪拌機以2000 r/min進行乳化分散，得W/O/W型復乳；將此復乳繼續(xù)攪拌3～4 h，揮發(fā)除去有機溶劑，經(jīng)過濾之后，收集固化的載藥微球，用蒸餾水洗滌微球，分3次進行，棄去濾液，得到含藥微球；配制一定濃度的甘露醇溶液，將微球加入其中，冷凍干燥，即得注射用含藥微球。

2.3 緩釋微球的粒徑分布和Zeta電位的測定

用SEM觀察上述醋酸艾塞那肽緩釋微球的外觀和形態(tài)，鏡下可見所制備的微球均呈圓球狀，且大小均勻、規(guī)整(圖1)，微球的粒徑平均值為34.6μm，粒徑范圍為20～50μm的微球量占總微球量的79.6%(圖2)。采用Zeta電位分析儀測定緩釋微球的Zeta電位，結果顯示微球的Zeta電位值為(-28.3±1.51)mV，其表面所帶電荷為負電荷。

圖2 醋酸艾塞那肽緩釋微球的粒徑分布圖

2.4醋酸艾塞那肽緩釋微球的體外釋放

2.4.1 色譜條件 色譜柱:TSKGelG2011SW柱(300mm× 7.5 mm)；流動相:水-乙腈-0.15 mol/L枸櫞酸-三氟乙酸(體積比20:75:5:0.2)；檢測波長:217 nm；柱溫: 25℃；流速:0.8ml/min；進樣量:20μl［15］。

2.4.2 含量測定 取8mg的上述含藥微球，精密稱定，加入2 ml乙酸乙酯使其溶解，加入2ml蒸餾水提取微球中藥物，重復3次進行提取。將3次所得提取液進行渦旋、離心，最后合并上清液。取上清液1～10ml容量瓶中，用蒸餾水定容，即為待測樣品。參照“2.4.1”項下方法對待測樣品進行相關測定，以載藥量=藥物含量/微球重量計算載藥量，以包封率=藥物含量/投藥量計算包封率，結果載藥量為21.3%，包封率為94.6%。

2.4.3 含藥緩釋微球體外釋藥及釋藥結果模型擬合精密稱取上述緩釋微球，每份5 mg，置于20個體積為10 ml的西林瓶中，每份中加入含有0.1 mol/L的Na2HPO4和0.1 mol/L的NaH2PO4的pH為7.4的緩沖溶液，加入體積為8 ml，將西林瓶靜置于37℃恒溫水浴中，在第0、1、5、10、15、20、25、30天8個時間點分別取樣并按“2.4.1”項下方法測定，計算含藥微球的累計釋放度［16-17］，并根據(jù)釋放結果繪制釋藥曲線(圖3)。采用模型擬合釋藥，結果顯示，Higuchi模型擬合方程為M=0.183t1/2+0.036，一級釋藥模型擬合方程為ln(1-M)=-0.048t+2.199，零級釋藥擬合方程為M=0.030t+0.210，三者的r2分別為0.991、0.808、0.904。鑒于相關系數(shù)越接近1，擬合效果越好，本研究結果提示，在這3種擬合模型中，通過Higuchi方程的擬合結果最好。

圖3 醋酸艾塞那肽緩釋微球體外釋藥曲線

2.5 殘留溶劑的測定

采用氣相色譜法對微球中的乙酸乙酯殘留量進行測定。其色譜條件為:HP-INNOWAX毛細管柱(30m× 0.53 mm×1μm)，以氮氣為載氣，流速為1.0 m l/mim；柱溫采用程序升溫:初始溫度為50℃，保持10min后以6℃/min升溫至120℃，保持5 min，再以40℃/min升溫至200℃，保持2 min；氫火焰離子化檢測器(FID)，進樣口及檢測器溫度均為250℃；于80℃將供試品平衡25min，吸取頂空進樣瓶的上部氣體進行進樣，吸取體積為1ml；分流比為10:1［18-19］。

取上述醋酸艾塞那肽緩釋微球100mg，精密稱定，加二甲基亞砜溶解至3 ml，置頂空瓶中，按上述色譜條件進行測定。結果顯示，微球中乙酸乙酯殘留量為0.27%，在《中國藥典》規(guī)定的限度0.5%以內(nèi)。

3 討論

緩釋微球的載體材料可直接影響微球的各項性能。近幾年，具有生物可降解特性的高分子材料受到高度重視，而在這類生物可降解材料中，聚酯類是至今為止被研究最多且應用最為廣泛的高分子材料，它們大多數(shù)是由羥基酸或其內(nèi)酯聚合而成。在這個過程中，羥基乙酸和乳酸為常用的羥基酸，具體包括聚乳酸-聚乙二醇嵌段共聚物、聚3-羥基丁酸酯、丙交酯-乙交酯共聚物、聚乳酸等，它們均具有成膜性及成球性好、無毒、化學穩(wěn)定性高等特點，另外還可注射給藥。

乳化-溶劑揮發(fā)法是制備PLGA微球常用方法之一。采用復乳-液中干燥法制備緩釋微球，在制備過程中對溫度要求低，可減少由于高溫導致的PLGA降解，且采用此方法對遇熱不穩(wěn)定的蛋白質(zhì)以及多肽類藥物可起到一定的保護作用。

PLGA的濃度、攪拌速度、投藥量、油水比例、溫度、乳化劑濃度等因素均可影響微球的成形性。在PLGA對緩釋微球影響的考察過程中發(fā)現(xiàn)，微球的包封率隨著PLGA質(zhì)量分數(shù)的增大而增大，PLGA質(zhì)量分數(shù)對微球粒徑也有同樣的影響；另外，粒徑雖然受溫度的影響不大，但溫度卻可以較明顯地影響微球的包封率，因此為了提高包封率，可以適當提高溫度，但是考慮到主藥的穩(wěn)定性問題，溫度不可過高。

載體材料PLGA在體內(nèi)降解的機制為本體溶蝕，這種降解機制導致基質(zhì)內(nèi)部聚合物的降解速度等于甚至快于基質(zhì)表面的聚合物，除此之外，PLGA的分子量、聚合單體摩爾比以及分布情況也是影響其降解和緩釋性能的主要因素。通常，隨著PLGA中羥基酸比例的增加，微球的溶蝕速度會加快，微球中藥物的釋放速度也加快，尤其是當乳酸與羥基乙酸的摩爾比例為50:50時，PLGA的降解速度達到最快；在分子量分布范圍較窄的PLGA中，較少的羧基端基可用于自身催化，因此聚合物的降解速度也相對較緩慢，反之，分子量分布范圍較寬的PLGA則降解較快。

緩釋微球中，藥物在微球中的所處部位和載體的性質(zhì)很大程度上決定藥物的釋放特性。藥物既可以被吸附在微球的表面也可以被完全包封在微球中，還可以分布在表層和空隙中，不同部位的藥物釋放速度不同，未被完全包封于微球中的藥物，可以較快地釋放出來，無需待載體材料降解之后才從微球中釋放出來。本方法制備的載藥緩釋微球，可實現(xiàn)持續(xù)、穩(wěn)定釋放藥物，其體外釋放結果符合Higuchi方程。其釋放期長達30 d，從而減少用藥次數(shù)。

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Study on the preparation and release in vitro of Exenatide Acetate Sustained-releasing M icrospheres for injection

ZHIQin LIXin-yu YAO Zhi-yong
Shenzhen JYMed Technology Co.,Ltd.,Shenzhen 518057,China

ObjectiveTo prepare Exenatide Acetate Sustained-release Microspheres to realize the sustained-release effect and reduce the frequency of drug use.MethodsExenatide Acetate Sustained-release Microspheres were prepared by themethod of double-elusion drying in liquid with PLGA as the carrier,ethyl acetate as the organic solvent, CMC-Na water solution as the dispersion medium and mannitol as the diluents and themethod of freezing drying.The prescription and preparation processwere optimized by orthogonal testwith particle size,yield and encapsulation as the investigating index.The property of releasing drug in vitro was investigated by the method of dialysis.The cumulative drug-releasing percentage of Sustained-release Microspheres was calculated and the drug-releasing curve was drawn.ResultsThe prescription and preparation process were screened according to the orthogonal test with a drug loading capacity of 21.3%,an encapsulation efficiency of 94.6%and a Zeta potential of(-29.3±1.51)mV.The releasing profile in vitro was in accordance with Higuchi equation.ConclusionThe Exenatide Acetate Sustained-release Microspheres for injection have releasing effect of 30 days.

Exenatide Acetate;Sustained-release Microspheres;Release in vitro

R943.41

A

1674-4721(2015)09(c)-0010-04

2015-05-22 本文編輯:衛(wèi) 軻)