規(guī)?；i場(chǎng)肺炎支原體、鼻支原體與藍(lán)耳病病毒感染情況調(diào)查

于 淼，王洪利，王新福，王 濤，王克偉，于 江，張玉玉，韓 紅，吳家強(qiáng)

（1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊 261061；2.臨沂市蘭山區(qū)畜牧局，山東臨沂 276000；3.蒙陰縣畜牧獸醫(yī)局，山東蒙陰 276200；4.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南 250100）

規(guī)?；i場(chǎng)肺炎支原體、鼻支原體與藍(lán)耳病病毒感染情況調(diào)查

于 淼1，王洪利1，王新福2，王 濤3，王克偉4，于 江4，張玉玉4，韓 紅4，吳家強(qiáng)4

（1.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東濰坊261061；2.臨沂市蘭山區(qū)畜牧局，山東臨沂276000；3.蒙陰縣畜牧獸醫(yī)局，山東蒙陰 276200；4.山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東濟(jì)南250100）

[目的] 為分析豬肺炎支原體（MHP）、豬鼻支原體（MHR）與豬藍(lán)耳病病毒（PRRSV）在臨床感染中的相互關(guān)系。[方法]對(duì)從山東省規(guī)模化豬場(chǎng)收集的213份疑似病料進(jìn)行PRRSV、MHP和MHR的檢測(cè)，結(jié)合豬場(chǎng)的免疫背景對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。[結(jié)果]發(fā)現(xiàn)在豬肺炎支原體免疫豬場(chǎng)，豬肺炎支原體感染比例顯著降低，而在豬肺炎支原體非免疫豬場(chǎng)，豬鼻支原體與豬肺炎支原體、豬藍(lán)耳病病毒的混合感染率極高。無論在肺炎支原體免疫場(chǎng)還是非免疫場(chǎng)，豬藍(lán)耳病病毒與豬鼻支原體的混合感染率，都超過了豬藍(lán)耳病病毒與豬肺炎支原體的混合感染率。[結(jié)論]PRRSV與MHP和MHR之間有著密切的關(guān)系，除豬肺炎支原體外，豬鼻支原體目前已成為危害養(yǎng)豬業(yè)的又一重要因素。

豬鼻支原體；豬肺炎支原體；豬藍(lán)耳病病毒；病料檢測(cè)；感染比例；混合感染

豬支原體是豬呼吸道疾病綜合征的主要病原之一[1]，臨床癥狀主要表現(xiàn)為豬地方性肺炎（又叫豬氣喘病，SEP），病豬和帶菌豬是主要傳染源，帶菌母豬可垂直傳染仔豬，豬群間主要通過接觸傳染[2]。豬鼻支原體（MHR）為豬呼吸道疾病綜合征的第二致病原，可以引發(fā)肺炎或者協(xié)同豬肺炎支原體共同引起肺炎[4]。近幾年的研究表明，豬肺炎支原體的感染可加重豬藍(lán)耳病病毒的感染[5]。通過對(duì)多個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)的213份臨床病料進(jìn)行檢測(cè)，分析總結(jié)出了豬鼻支原體感染豬群的現(xiàn)狀及與豬藍(lán)耳病病毒、豬肺炎支原體的混合感染的規(guī)律。

1 材料與方法

1.1 試劑

dNTP Mixture、ExTaqDNA聚合酶、TRIZOL試劑等試劑，購自Invitrogen公司；M-MLV，購自Promega公司；豬肺炎支原體PCR 檢測(cè)試劑盒，購自大連寶生物工程有限公司。

表1 樣品免疫背景

表2 豬肺炎支原體和豬鼻支原體雙重PCR引物和PRRSV引物序列

表3 病料檢測(cè)結(jié)果統(tǒng)計(jì)

表4 MHP免疫場(chǎng)病料檢測(cè)結(jié)果

表5 MHP未免疫場(chǎng)檢測(cè)結(jié)果

1.2 臨床樣品

臨床樣品采集于山東省地區(qū)的規(guī)模化豬場(chǎng)，全部為有肺炎癥狀的豬肺臟組織。免疫背景如表1：

1.3 臨床病料檢測(cè)

1.3.1 病料中核酸的提取。將病料按1∶3的比例與PBS緩沖液混合后充分研磨，凍融三次后離心，取上清液分別利用大連寶生物公司的豬肺炎支原體PCR檢測(cè)試劑盒及Invitrogen公司的TRIZOL試劑對(duì)病料進(jìn)行DNA及RNA提取；經(jīng)RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA后，與病料DNA分別保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 病料的PCR檢測(cè)。支原體檢測(cè)引物及反應(yīng)體系參照劉茂軍等[6]建立的豬肺炎支原體與豬鼻支原體鑒別雙重PCR，PRRSV引物序列及反應(yīng)體系參照鄧雨修等不同引物RT-PCR方法檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的比較研究[7]，取PCR產(chǎn)物于1%瓊脂糖凝膠電泳觀察。

2 結(jié)果

2.1 三種病原的檢測(cè)率結(jié)果對(duì)規(guī)?；i場(chǎng)的213份臨床病料（肺臟）進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表3所示：從結(jié)果中可以看出，PRRSV的臨床

檢出率非常高，陽性率超過了80%（包括疫苗毒），而MHP與MHR的陽性率均超過了30%，說明豬場(chǎng)的支原體感染嚴(yán)重。在調(diào)查的規(guī)?；i場(chǎng)中，MHR的感染比例（38.97%）超過了MHP的感染比例（32.39%），差異顯著（P＜0.05）。同時(shí)，MHR與PRRSV的混合感染率（33.80%）超過了MHP與PRRSV的混合感染率（24.88%），差異極顯著（P＜0.01）。

2.2 免疫豬肺炎支原體疫苗對(duì)病原檢測(cè)結(jié)果的影響

將46份免疫過豬肺炎支原體疫苗的病料和167份未免疫過豬肺炎支原體疫苗的病料進(jìn)行分析，結(jié)果見表4、表5。

從表中可以看到，接種豬肺炎支原體疫苗的豬場(chǎng)，MHP的陽性率顯著降低，但是，豬肺炎支原體疫苗的接種對(duì)于MHR的發(fā)病率并沒有明顯的改善（P＞0.05），甚至免疫場(chǎng)MHR的陽性率還高于未免疫場(chǎng)（P＜0.05）。而在MHP免疫豬場(chǎng)，PRRSV的檢出率仍舊很高，達(dá)到了86.96%（包括疫苗毒），但PRRSV與MHP的混合感染率相對(duì)于未免疫場(chǎng)有了明顯的改善（P＜0.05），而PRRSV與MHR的混合感染率相對(duì)于未免疫場(chǎng)沒有明顯的改觀。

3 討論

豬鼻支原體（MHR）是仔豬上呼吸道存在的正常菌株，與MHP相似。MHR能粘附于呼吸道上皮細(xì)胞上，且部分菌株能夠引起肺炎、多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎、中耳炎等。在地方性肺炎（SEP）的發(fā)生過程中，MHR常常作為第二致病菌，協(xié)同MHP共同或單獨(dú)致病。如Kim等[8]證實(shí)，MHR感染實(shí)驗(yàn)豬，可引起豬的肺炎，并伴發(fā)多發(fā)性漿膜炎、關(guān)節(jié)炎及中耳炎等臨床癥狀；中國的Lin等[9]通過人工感染試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MHR可單獨(dú)引起肺炎，并且發(fā)現(xiàn)在SEP病料中，MHR的陽性率從72.3%上升至99.4%。

本研究對(duì)部分規(guī)模化豬場(chǎng)有肺炎癥狀的肺臟進(jìn)行了PRRSV、MHP、MHR的檢測(cè)。通過檢測(cè)結(jié)果的分析發(fā)現(xiàn)，目前MHR的總檢測(cè)率高于MHP的檢測(cè)率。PRRSV與MHP和MHR之間有著密切的關(guān)系，混合感染率均超過了30%，而且PRRSV與MHR的混合感染率要高于其與MHP的混合感染率。該結(jié)果在一定程度上表明豬鼻支原體與PRRSV之間的相互關(guān)系比豬肺炎支原體與PRRSV的關(guān)系更加密切（表2）。豬的鼻腔有阻止和過濾灰塵顆粒的作用，支氣管纖毛可黏附和清除病菌；支原體肺炎屬免疫抑制性疾病，一方面，可破壞纖毛，大大降低其黏附和清除病菌的功能；另一方面，豬支原體肺炎可使肺泡巨噬細(xì)胞對(duì)病菌的吞噬和消除能力下降，造成機(jī)體的免疫力下降。因此豬感染支原體后，可繼發(fā)感染其它病毒或細(xì)菌，如PRRSV、PCV2、SIV、APP、HPS等[10]，多種病原共同作用，使得豬群臨床發(fā)病情況變的尤為復(fù)雜。

使用疫苗接種的效果遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于藥物控制，且更加經(jīng)濟(jì)[11]。在MHP免疫場(chǎng)中，MHP的陽性率有了明顯降低，說明MHP疫苗對(duì)MHP具有良好的保護(hù)效果，但是MHP疫苗的免疫對(duì)MHR的檢出率沒有顯著的影響，說明豬肺炎支原體疫苗幾乎不能提供對(duì)MHR的交叉免疫保護(hù)；雖然豬場(chǎng)免疫了MHP疫苗，但MHP的檢出率達(dá)15.22%，可能跟免疫程序、豬場(chǎng)管理方式、豬群飼養(yǎng)條件以及機(jī)體內(nèi)有其他免疫抑制因素（如霉菌毒素、PCV2等）使疫苗保護(hù)率降低有關(guān)。同時(shí)，MHP疫苗的接種，對(duì)于PRRSV感染未能體現(xiàn)出應(yīng)有的效果，除了病料太少（僅46份）的原因外，豬鼻支原體感染可能是導(dǎo)致MHP免疫未能體現(xiàn)效果的重要原因。采集樣品的豬場(chǎng)均使用PRRSV弱毒疫苗免疫，本檢測(cè)方法尚不能區(qū)分疫苗毒與野毒，因此在免疫過MHP和PRRSV疫苗的46個(gè)豬場(chǎng)中，PRRSV的檢測(cè)率高于MHP未免疫組，可能有疫苗毒的存在。在MHP免疫場(chǎng)，PRRSV與MHR的混合感染率相對(duì)于未免疫場(chǎng)沒有明顯的改善。同時(shí)，在免疫場(chǎng)的46份病料中有7份檢測(cè)到MHP，而在這7份病料中同時(shí)檢測(cè)到了PRRSV和MHR，盡管樣本數(shù)量太少，但推測(cè)，MHR在很大程度上能夠促進(jìn)PRRSV的感染和傳播，而且跟MHP的發(fā)生可能有很密切的關(guān)系。

[1] 王華，張清，王君瑋，等.豬支原體肺炎流行病學(xué)和診斷技術(shù)研究進(jìn)展[J].動(dòng)物醫(yī)學(xué)進(jìn)展，2009.30（9）：73-77.

[2] 楊俊杰，李石，李劼，等. 新疆北疆部分規(guī)模豬場(chǎng)支原體肺炎流行病學(xué)調(diào)查[J].中國動(dòng)物檢疫，2011.28（11）：44-46.

[3] Clark K，Army S，Scheidt K，et al. Investigating the transmission of Mycoplasma hyopneumoniae in a swine herd with enzootic pneumonia [J]. Vet M ed，1991（3）：543 -550.

[4]金升藻.豬支原體肺炎的診斷與綜合防治[J].上海畜牧獸醫(yī)通訊，2008（6）：33-35.

[5]劉青海，車秀華，孫洪升.豬支原體肺炎的研究進(jìn)展[J].畜牧獸醫(yī)科技信息，2005（6）：12-13.

[6]劉茂軍，王占偉，韋艷娜，等.豬肺炎支原體和豬鼻支原體雙重PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用[J].中國獸藥雜志2012，47（9）7-10.

[7] 鄧雨修，李玉峰，姜平，等.不同引物RT-PCR方法檢測(cè)豬繁殖與呼吸綜合征病毒的比較研究[J].畜牧與獸醫(yī)，2006，38（4）：8-11.

[8]Kim B，Lee K，Han K，et al. Development of in situ hybridization for the detection of Mycoplasma hyorhinis informalin-fixed paraffinembedded tissues from naturally infected pigs with polyserositis[J]. J Vet Med Sci，2010，72（9）：1225-1227.

[9]LIN J H，CHEN S P，YEH K S，et al.Mycoplasma hyorhinis in Taiwan：diagnosis and isolation of swine pneumonia pathogen[J].Vet Microbiol，2006，15（1-3）：111-116.

[10]王茂文.豬肺炎支原體病的特點(diǎn)及其防制措施[J].畜禽業(yè)，2008（2）：16-17.

[11]何敬軍.我區(qū)豬支原體肺炎（MPS）的流行與防制[J].中國動(dòng)物檢疫2004，21（8）35-36.

Investigation on Mycoplasma hyopneumoniae，
Mycoplasmahyorhins and PRRSV Infections in Large-scale Swine Farms

Yu Miao1，Wang Hongli1，Wang Xinfu2，Wang Tao3，Wang Kewei4，Yu Jiang4，Zhang Yuyu4，Han Hong4，Wu Jiaqiang4
（1.Shandong Vocational Animal Science and Veterinary College，Weifang，Shandong 261061；2.Linyi Lanshan Animal Husbandry Bureau，Linyi，Shandong 276000；3.Mengyin Animal Husbandry Bureau，Mengyin，Shandong 276200；4.Shandong Key Lab of Animal Disease Control and Breeding，Jinan，Shandong 250022）

[Objective]In order to analysis the relationship of Mycoplasma hyopneumoniae（MHP）、Mycoplasmahyorhins（MHR）and Porcine reproductive and respiratory syndrome virus（PRRSV）in clinical infection.[Method]A total of 213 suspected samples were collected from large-scale swine farms in Shandong province and MHP，MHR and PRRSV were detected by PCR. The detection reports were analyzed on the basis of immunization background of swine herds.[Result]The results showed that positive rate of MHP infection reduced largely in the vaccinated swine herds. The mixed infection rate of MHP，MHR and PRRSV was very high in the non- vaccinated swine herds. The mixed infection rate of MHR and PRRSV was higher than that of MHP and PRRSV whether in the vaccinated or nonvaccinated swine herds.[Conclusion]Those results indicated that MHR had become another important factor threatening pig industry.

MHR；MHP；PRRSV；sample detection；positive rate；mixed infection

S851.31

：B

：1005-944X（2015）02-0008-04

國家自然科學(xué)基金（編號(hào)：31340047）；山東省現(xiàn)代農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系（編號(hào)：SDAIT-06-022-06、06-021-07）；山東省農(nóng)科院重大科技成果培育計(jì)劃等（編號(hào)：2014CGPY04、2014YDHZ32）

吳家強(qiáng)