Graves病患者外周血中樹突狀細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的變化

吳 嘉,謝 謙,張寧波,毛吉炎,袁建輝*

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院內(nèi)分泌科,廣東深圳518036;2.深圳市疾病預(yù)防控制中心)

Graves病患者外周血中樹突狀細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子的變化

吳 嘉1,謝 謙1,張寧波1,毛吉炎2,袁建輝2*

(1.北京大學(xué)深圳醫(yī)院內(nèi)分泌科,廣東深圳518036;2.深圳市疾病預(yù)防控制中心)

目的 檢測Graves病人外周血細(xì)胞因子和樹突狀細(xì)胞(DCs)不同亞群的數(shù)量和表達(dá)情況,初步探討DCs細(xì)胞亞群在疾病中的作用。 方法 利用流式細(xì)胞儀檢測30例Graves病患者和30名健康體檢者的外周血樹突狀細(xì)胞亞群數(shù)量,同時利用ELISA檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、干擾素-γ(IFN-γ)、白細(xì)胞介素-2(IL-2)及IL-6等細(xì)胞因子的水平。 結(jié)果 測得Graves組髓樣樹突狀細(xì)胞(pDC)和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(mDC)值均高于正常對照組。ELISA檢測細(xì)胞因子發(fā)現(xiàn),Graves患者血清中TNF-α、IFN-γ、IL-6水平均高于正常對照組,其中TNF-α顯著升高(P＜0.01),而IL-2水平顯著低于對照組(P＜0.01)。 結(jié)論 Graves病人中pDC和mDC水平升高,細(xì)胞因子分泌失調(diào),Th1/Th2失衡,從而導(dǎo)致機(jī)體自身免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。

Graves病; 樹突狀細(xì)胞; 細(xì)胞因子

格雷夫斯病(Graves'disease,GD)又稱毒性彌漫性甲狀腺腫,是最常見的自身免疫性甲狀腺疾病(ATID)[1]。樹突狀細(xì)胞(DC)是目前已知的體內(nèi)功能最強(qiáng)的專職性抗原提呈細(xì)胞,根據(jù)其表面標(biāo)記,可將其分為髓樣樹突狀細(xì)胞(mDC)和漿細(xì)胞樣樹突狀細(xì)胞(pDC),他們可以激活初始的T淋巴細(xì)胞向Th1、Th2細(xì)胞分化。本研究采用流式細(xì)胞儀技術(shù)檢測Graves病血液中mDC、pDC的變化,并用ELISA檢測TH1、TH2相關(guān)的細(xì)胞因子,以探索DC細(xì)胞亞群與TH1/TH2細(xì)胞失衡的關(guān)系,初步研究DC細(xì)胞在Graves疾病發(fā)生中的作用。

1 資料與方法

1.1 主要儀器和試劑

流式細(xì)胞儀BD FACSArial,淋巴細(xì)胞分離液,熒光抗體,pDC標(biāo)記試劑:(CD14+,CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD33-PCS;mDC標(biāo)記試劑:(CD14+,CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD123-PC5;鞘液、溶血素、HUMAN TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6 ELISA KIT 等。

1.2 一般資料

收集本院2013年5月～2014年2月門診及住院Graves病患者30例(均無其他自身免疫性疾病,1年內(nèi)沒有使用過免疫抑制劑),其中男性14例(46.7%),女性16例(53.3%);平均年齡42.6歲。另選同期30例年齡和性別匹配的健康志愿者作為正常對照組,男女各15例(50%),平均年齡為41.8歲。兩組的平均年齡、性別的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。研究經(jīng)醫(yī)院批準(zhǔn)并在開始前均獲得研究對象的知情同意。

1.3 外周血單個核細(xì)胞(PBMC)的分離

取研究對象的抗凝靜脈血5 mL,1 000 r/min離心10 min,留取血清后再用等體積的PBS液稀釋1倍,加入淋巴細(xì)胞分離液,密度梯度離心,3 000 r/min離心20 min,收集單核細(xì)胞層于15 mL離心管中,用PBS液洗滌2次,得到PBMC,用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。

1.4 DC比例檢測

取200μL PBMC細(xì)胞懸液分別加入熒光抗體(CD14+,CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD33-PCS和CD14+,CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD123-PC5;另取200μL PBMC細(xì)胞懸液加入FITC-mouse IgG和PE-mouse IgG混勻后室溫避光放置30 min;每管加入2 mL PBS混勻后洗滌3次,再加入1 mL PBS重懸,流式細(xì)胞儀檢測pDC和mDC占淋巴細(xì)胞的比例。

1.5 細(xì)胞因子檢測

分離Graves組和正常對照組血清,利用ELISA檢測試劑盒分別檢測 TNF-α、IFN-γ、IL-2、IL-6 細(xì)胞因子水平,具體實(shí)驗(yàn)步驟按ELISA檢測試劑盒說明書進(jìn)行。最后利用酶標(biāo)儀檢測492 nm處吸光度(OD)。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線測出樣品中各個細(xì)胞因子的濃度。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 18.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析,數(shù)據(jù)均以表示。多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析(One Way ANOVA)。進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較時,采用SNK檢驗(yàn)。

2 結(jié) 果

2.1 兩組外周血pDC和mDC水平的比較

利用流式細(xì)胞儀檢測Graves組和正常對照組外周血單核細(xì)胞中pDC及mDC亞群水平變化,結(jié)果見表1。與正常對照組相比,Graves組pDC和mDC水平均顯著性升高(P＜0.01)。

表1 Graves組與正常對照組DC亞群在外周血單核細(xì)胞的比例_____________________________________________

2.2 血清細(xì)胞因子水平檢測

酶聯(lián)免疫檢測Graves組和正常對照組細(xì)胞因子的濃度,結(jié)果見表2。檢測結(jié)果可以發(fā)現(xiàn)Graves組血清中 TNF-α、IFN-γ、IL-6細(xì)胞因子均高于正常對照組,其中TNF-α顯著升高了2.7倍(P＜0.01),而IL-2顯著低于正常對照組(P＜0.01)。

表2 Grave組與正常對照組血清中細(xì)胞因子濃度的比較(pg/mL)

3 討 論

Graves病是一種伴甲狀腺激素分泌增多的器官特異性自身免疫病,其發(fā)病機(jī)理十分復(fù)雜,細(xì)胞免疫和體液免疫紊亂均與GD免疫病理形成密切相關(guān)。目前研究表明:多種免疫細(xì)胞、細(xì)胞因子和miRNA共同參與了GD發(fā)病機(jī)制,尤其是T淋巴細(xì)胞、DC細(xì)胞及其相關(guān)因子[2-3]。

樹突細(xì)胞是人體內(nèi)最強(qiáng)的抗原提呈細(xì)胞,根據(jù)細(xì)胞表型常分為mDC和pDC兩亞群,mDC為CD14+、CD16+、CD33+、D85K+,主要發(fā)揮抗原提呈的功能,促進(jìn)細(xì)胞免疫的發(fā)生,mDC是人體主要的抗原提呈細(xì)胞(APC),激活體內(nèi)T淋巴細(xì)胞,同時參與初始(native)T細(xì)胞的活化,在特異性免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用;pDC為CD14+、CD16+、CD123+、D85K+,主要產(chǎn)生干擾素TFN-α,促進(jìn)體液免疫的發(fā)生[4]。pDC除有較弱的APC功能外,在人體受到病毒攻擊時pDC還可以產(chǎn)生大量干擾素,抑制病毒復(fù)制和增強(qiáng)人體免疫功能,從而在天然的免疫應(yīng)答過程中發(fā)揮重要作用[5]。本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀分別檢測(CD14+、CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD33-PCS和(CD14+、CD16+)-FITC/CD85K-PE/CD123-PC5,得到病患者血液中pDC和mDC在淋巴細(xì)胞中的比例,結(jié)果表明兩者均高于正常對照組,說明Graves病即與體液免疫有關(guān),又受到細(xì)胞免疫的影響。目前關(guān)于許多研究都表明DC細(xì)胞與多種病病的發(fā)生有關(guān)[5-6],如:紅斑狼瘡、哮喘等等。

此外本研究通過ELISA檢測Grave病患者血清細(xì)胞因子,發(fā)現(xiàn) TNF-α、IFN-γ、IL-6 顯著升高,而 IL-2顯著降低(P＜0.01)。這些細(xì)胞因子主要是輔助T細(xì)胞產(chǎn)生具有多種生物學(xué)活性的蛋白質(zhì)或肽類,他們通過與各目的靶細(xì)胞表面特異性受體結(jié)合發(fā)揮作用[7]。Th1細(xì)胞激發(fā)遲發(fā)型超敏反應(yīng),介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答,主要分泌 IL-2和 IFN-γ細(xì)胞因子[8]。Th2細(xì)胞促進(jìn)抗體產(chǎn)生,介導(dǎo)體液免疫應(yīng)答,主要表達(dá)IL-4、IL-6、IL-10等細(xì)胞因子[9]。 ELISA 檢測Grave病患者IL-6水平升高,說明Th2介導(dǎo)的免疫應(yīng)答在GD發(fā)病的有重要作用。此外檢測Graves病患者TNF-α細(xì)胞因子明顯升高,可能是pCD細(xì)胞增加引起的。IL-2顯著性降低,表明Th1介導(dǎo)細(xì)胞免疫應(yīng)答在Graves病發(fā)生作用較小,同時發(fā)現(xiàn)IFN-γ有所升高,但沒有明顯差異,IFN-γ主要是由Th1細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生[10]。不同的淋巴細(xì)胞產(chǎn)生相同細(xì)胞因子,同一種淋巴細(xì)胞可以產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,這些細(xì)胞因子間有著非常復(fù)雜的相互調(diào)節(jié)作用,淋巴細(xì)胞及細(xì)胞因子間構(gòu)成了復(fù)雜的免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[11-12]。免疫調(diào)控網(wǎng)絡(luò)失調(diào)導(dǎo)致自身免疫紊亂引發(fā)Graves病。

綜上所述,Graves病人中pDC和mDC水平升高,細(xì)胞因子分泌失調(diào),Th1/Th2失衡,從而導(dǎo)致機(jī)體自身免疫反應(yīng)的產(chǎn)生。

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The Changes of the Peripheral Blood Dendritic Cells and Some Related Cytokines in Graves'Disease Patients

WU Jia,XIE Qian,ZHANG Ningbo,et al
(Peking University Shenzhen Hospital,Shenzhen,Guangdong 518036,China)

Objective To discuss the role of DC cells in Graves disease,we detect the frequency of different DC subsets and the secretion of cytokines in Graves patients'peripheral blood. Method Flow cytometry(FCM)was performed to assess the frequency of different DCsubsets in peripheral blood of 30 Graves patients and 30 healthy cases respectively.And ELISA was applied to detect the secretion of TNF-α,IFN-γ,IL-2 and IL-6 and other cytokines in the peripheral blood. Results The frequency of pDCs and mDCs in Graves disease group was higher than that in healthy cases.And ELISA results showed that the secret of TNF-α,IFN-γ and IL-6 in Graves disease patients'peripheral blood were significant higher than that in normal control group,while IL-2 were significantly lower than the control group(P＜0.01).Conclusion The frequency of pDCs and mDCs in Graves disease were higher than that of healthy controls,which indicated that pDC and mDC were involved in the pathogenesis of Graves.

Graves'disease; dendritic cells; cytokine

R581.3

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.02.008

2014-09-19;

2015-02-15

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目(201201028,201203029);深圳市科技研發(fā)資金項(xiàng)目(JCYJ20120615085512920,JCYJ20140410164217365,ZYC201006180477A).

*通訊作者,E-mail:jianhui_yuan@126.com.

(此文編輯:朱雯霞)