神經(jīng)源性肺水腫大鼠模型的改進(jìn)與評價

符 暉,王橋生*,劉 雁,周 斌,彭忠田

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,湖南衡陽421001;2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

神經(jīng)源性肺水腫大鼠模型的改進(jìn)與評價

符 暉1,王橋生1*,劉 雁2,周 斌2,彭忠田1

(1.南華大學(xué)附屬第一醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科,湖南衡陽421001;2.南華大學(xué)醫(yī)學(xué)院)

目的 評價改進(jìn)后的小腦延髓池穿刺法制作神經(jīng)源性肺水腫大鼠模型的使用價值。 方法 60只清潔級SD大鼠隨機(jī)均分為4組:正常對照組、假手術(shù)組、小腦延髓池穿刺直接注射組(直接注射組)、小腦延髓池穿刺延長留置時間組(延長留置時間組)。延長留置時間組造模成功率達(dá)90%。直接注射組采用傳統(tǒng)的小腦延髓池穿刺直接注射法造模;延長留置時間組即小腦延髓池穿刺成功后,在腦池內(nèi)留置1 mL注射器針頭20 min后注射纖維蛋白原(100 mg/mL)和凝血酶(200 U/mL)各0.075 mL。通過觀察各組大鼠肺大體形態(tài)學(xué)、病理改變及比較生存時間,評價兩種制模方法的價值。正常對照組不予任何干預(yù)。 結(jié)果 正常對照組無肺水腫表現(xiàn)。同直接注射組相比,延長留置時間組大鼠肺體積明顯增大,肺泡及肺間質(zhì)滲出明顯增多。延長留置時間組大鼠生存時間較直接注射組縮短,分別為5.008±2.612 h和7.482±3.034 h(t=2.394,P=0.024)。 結(jié)論 小腦延髓池穿刺延長留置時間法復(fù)制的神經(jīng)源性肺水腫癥狀典型,是研究神經(jīng)源性肺水腫較為理想的動物模型。

神經(jīng)源性肺水腫; 小腦延髓池; 纖維蛋白原; 凝血酶

神經(jīng)源性肺水腫(Neurogenic Pulmonary Edema,NPE)是指無原發(fā)心、肺、腎疾病,而是由各種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病所致的引發(fā)急性肺水腫,故又稱為中樞性肺水腫[1]。癥狀表現(xiàn)為呼吸困難、呼吸窘迫、咳粉紅色泡沫痰、咯血、呼吸循環(huán)衰竭等急性癥狀。該病發(fā)展迅速,死亡率高,但目前NPE的機(jī)制還不明確,復(fù)制理想的動物模型是研究該疾病的基礎(chǔ),也是制約實驗研究的主要環(huán)節(jié)。目前,NPE造模的方法主要包括小腦延髓池穿刺直接注射法[2-3]、腎上腺素腹腔注射法[4]和脊髓損傷法[5-6]等。其中,小腦延髓池穿刺注射法應(yīng)用較廣,其復(fù)制的模型更加符合臨床NPE的病理生理特點(diǎn)。但是,小腦延髓池穿刺直接注射法造模引起NPE程度較輕,發(fā)展速度慢,癥狀不明顯,不便于實驗觀察及研究。為復(fù)制理想的NPE模型,本文對小腦延髓穿刺法造模進(jìn)行改進(jìn)并對其進(jìn)行了評價。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

纖維蛋白原(長沙鵬博生物科技有限公司);凝血酶(長沙鵬博生物科技有限公司);水合氯醛(長沙鵬博生物科技有限公司)。

1.2 實驗動物及分組

清潔級雄性SD大鼠60只,月齡3～4月,200～250 g,購于湖南斯萊克景達(dá)動物有限公司;按照隨機(jī)數(shù)字法分為4組:(1)正常對照組;(2)假手術(shù)組;(3)小腦延髓池穿刺直接注射組(直接注射組);(4)小腦延髓池穿刺延長留置時間組(延長留置時間組)。每組各為15只。

1.3 造模方法

實驗大鼠術(shù)前12 h禁食但不禁水,10%水合氯醛300 mg/kg腹腔注射進(jìn)行麻醉固定,麻醉后氣管切開行氣管插管,用1 mL注射器從枕骨粗隆下0.6～0.7 cm進(jìn)針,進(jìn)針深度1.0～1.5 cm,穿刺進(jìn)入小腦延髓池[7]。直接注射組采用傳統(tǒng)的小腦延髓池穿刺直接注射法,穿刺針進(jìn)入小腦延髓池后即刻在大鼠腦池內(nèi)注射纖維蛋白原(100 mg/mL)和凝血酶(200 U/mL)各0.075 mL[3]。延長留置時間組,采用改進(jìn)的小腦延髓池穿刺延長留置時間法,即穿刺針進(jìn)入小腦延髓池后在腦池內(nèi)留置注射器針頭20 min后注射纖維蛋白原(100 mg/mL)和凝血酶(200 U/mL)各0.075 mL。假手術(shù)組按實驗方法進(jìn)行麻醉固定、氣管切開并行氣管插管,但不行小腦延髓池穿刺及注藥。正常對照組不予手術(shù)及藥物干預(yù)。

1.4 肉眼觀察肺大體標(biāo)本及病理學(xué)檢查

造模6 h后隨機(jī)選取5只大鼠進(jìn)行解剖,肉眼觀察肺臟大體標(biāo)本顏色、腫脹情況、氣管內(nèi)水腫液及肺組織切面滲液情況。然后分別經(jīng)肺門平面、肺門平面以上1.0 cm及肺門平面以下1.0 cm取肺組織予10%的中性甲醛固定,常規(guī)石蠟切片,HE染色,光鏡下觀察肺門、肺尖及肺底病理改變。

1.5 觀察大鼠生存時間

造模成功后,每組10只大鼠,記錄各組大鼠生存時間。

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)使用SPSS18.0進(jìn)行處理。兩組間生存時間用均數(shù)+標(biāo)準(zhǔn)差表示,組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗,以P＜0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 一般情況

正常對照組大鼠呼吸平穩(wěn),節(jié)律齊,唇舌黏膜正常,未聞及濕羅音。而直接注射組造模30 min后均可見明顯呼吸困難,出現(xiàn)呼吸困難、頻率加快、肌肉無力,隨著可見廣泛肌顫、全身抽搐,最后因呼吸衰竭死亡;其中延長留置時間組大鼠進(jìn)展較直接注射組癥狀更嚴(yán)重,嚴(yán)重時從鼻孔與口腔涌出血性泡沫樣液體。兩組造模成功率達(dá)90%。

2.2 各組大鼠肺大體標(biāo)本形態(tài)學(xué)改變

正常對照組及假手術(shù)組:雙肺正常、淺粉紅色,表面光滑,未見淤血,切面未見溢出粉紅色液體,分別見圖1A、圖1B。直接注射組:擠壓雙肺可見氣管有泡沫樣液體,大鼠肺體積稍增大,邊緣稍鈍,表面呈暗紅色,氣管分叉處可見淡紅色水腫液。見圖1C。延長留置時間組:氣管內(nèi)可見泡沫樣液體,肺體積明顯增大、腫脹,邊緣鈍,肺表面呈暗紅色,多發(fā)點(diǎn)狀或片狀出血,肺切面有泡沫樣血性液體溢出。見圖1D。

2.3 各組肺組織光鏡下改變

正常對照組及假手術(shù)組,經(jīng)肺尖、肺門及肺底切片,可見肺間質(zhì)、肺泡形態(tài)結(jié)構(gòu)基本正常,未見明顯肺泡、肺間質(zhì)滲出及出血改變;而直接注射組,經(jīng)肺尖、肺門及肺底切片均可見肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)可見少量滲出物;延長留置時間組,經(jīng)肺尖、肺門及肺底切片,可見肺間質(zhì)滲出增加,肺泡腔內(nèi)可見大量淡紅 色絮狀滲出物及紅細(xì)胞。見圖2。

2.4 大鼠生存時間比較

延長留置時間組大鼠生存時間較直接注射組稍有縮短,分別為5.008±2.612 h和 7.482±3.034 h(t=2.394,P=0.024)。相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)肺水腫模型生存時間約數(shù)十分鐘至數(shù)小時不等,這可能與肺水腫發(fā)展迅速導(dǎo)致動物死亡所致[8-9]。本文中延長留置時間組大鼠較直接注射組大鼠死亡時間縮短,可能與神經(jīng)中樞損害加重有關(guān)。對實驗研究NPE相關(guān)藥物干預(yù)或機(jī)制并不影響。

3 討 論

NPE是一個復(fù)雜的病理過程,是多種因素綜合作用的結(jié)果,其發(fā)病機(jī)制還不明確。目前比較認(rèn)可的機(jī)制是中樞神經(jīng)系統(tǒng)損傷后,其中延髓是 NPE發(fā)生的關(guān)鍵神經(jīng)中樞,機(jī)體發(fā)生過度應(yīng)激,交感神經(jīng)過度興奮引起兒茶酚胺物質(zhì)大量釋放是導(dǎo)致NPE的重要原因。因此,理想的NPE模型應(yīng)該吻合這一病理生理機(jī)制[1,10-11]。雖然,國內(nèi)外有一些學(xué)者提出不同的NPE造模方法,主要包括小腦延髓池穿刺注射法、腎上腺素腹腔注射法和脊髓損傷法等。薛敬禮等[4]報道腎上腺素經(jīng)腹腔注射可引起大鼠NPE,誘發(fā)肺水腫成功率高,但劑量大小與模型成功與否有很大關(guān)系,大部分模型數(shù)十分鐘內(nèi)死亡。大鼠急性脊髓損傷可誘發(fā)NPE,但損傷程度不易控制,大鼠很快死亡,死亡原因可能與脊髓損傷有直接關(guān)系,不能確定大鼠是否死于NPE[12]。上述模型不完全符合NPE發(fā)病機(jī)制,不便于實驗觀察及研究。蛛網(wǎng)膜下腔出血可并發(fā)NPE[13],但是蛛網(wǎng)膜下腔出血并NPE發(fā)病急、進(jìn)展快、病情重,死亡率高,重復(fù)性差,亦不便于實驗觀察及研究。

小腦延髓池穿刺直射法通過分別注入纖維蛋白原及凝血酶,繼發(fā)顱內(nèi)高壓,誘發(fā)NPE[2-3]。該模型符合NPE的發(fā)病機(jī)理。但是,小腦延髓池穿刺直接注射法造模后,亦存在NPE形成慢,癥狀不典型等缺陷。

本文經(jīng)過小腦延髓池穿刺,通過延長留置穿刺針后再注藥,成功復(fù)制了NPE模型。同小腦延髓池穿刺直接注射法造模法相比,延長留置時間法造模,大鼠肺水腫癥狀典型,肺組織大體形態(tài)及病理改變更顯著,肺水腫發(fā)展程度更重,重復(fù)性好,成功率高。同直接注射組相比,雖然延長留置時間組大鼠生存時間縮短,分別為7.482±3.034 h和5.008±2.612 h,具體機(jī)制無相關(guān)文獻(xiàn)報道,這可能與留置時間組大鼠神經(jīng)中樞損害加重,肺水腫發(fā)展更迅速,發(fā)展程度更重有關(guān)。但與文獻(xiàn)報道的其他復(fù)制NPE模型方法相比,時間明顯延長,可更好地進(jìn)行實驗觀察和研究。

但是該造模方法也存在以下不足之處:(1)留置時間過長可導(dǎo)致顱腦損傷程度加重,可能誘發(fā)腦疝的形成;(2)延長留置時間的過程中可加重腦干損傷,導(dǎo)致呼吸、循環(huán)中樞的抑制,直接導(dǎo)致大鼠死亡。因此,要嚴(yán)格把握進(jìn)針深度及時間。

小腦延髓池穿刺延長留置時間法復(fù)制的神經(jīng)源性肺水腫癥狀典型,是研究神經(jīng)源性肺水腫較為理想的動物模型。

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Improvement of Neurogenic Pulmonary Edema Model Induced by Cerebellomedullary Cistern Puncture in Rats

FU Hui,WANG Qiaosheng,LIU Yan,et al
(Department of Critical Care Medicine,the First Affiliated Hospital,University of South China,Hengyang,Hunan 421001,China)

Objective To evaluate the worth of neurogenic pulmonary edema model induced by improved cerebellomedullary cistern puncture. Methods 60 SD ras were randomly divided into four groups:control group(n=15);Sham operation group(n=15);direct injection through cerebellomedullary cistern puncture group(abbreviated:direct injection group,n=15);prolonging the indwelling time and injection through cerebellomedullary cistern puncture group(abbreviated:prolonging indwelling time group,n=15).90%of them is successful in the prolonging indwelling time group.Neurogenic pulmonary edema model was induced by classic cerebellomedullary cistern puncture in the direct injection group,however,that in the prolonging indwelling time group was induced by injecting 0.75 mL Fibrinogen(100 mg/mL)and 0.75 mL thrombin(200 U/mL)respectively after 20 min indwelling needle maintained in cerebellomedullary cistern.The experimental parameters including pulmonary morphology,pathology change and survival time in each group were evaluated. Results The pulmonary edema of rats did not be discovered in the control group,however,that in the direct injection group and prolonging indwelling time group were both discovered significantly.Compared with the rats in the direct injection group,the lung volume,exudation of the pulmonary alveoli and pulmonary interstitium increased significantly in the prolonging indwelling time group.Survival time of the rats in the prolonging indwelling time group was shorter than that of the direct injection group,they are(5.008+2.612)h and(7.482+3.034)h,respectively,(t=2.394,P=0.024). Conclusion It is perfect NPE model for research that the modified NPE model has typical NPE symptoms.

neurogenic pulmonary edema; cerebellomedullary cistern; fibrinogen; thrombin

2014-08-08;

2014-12-01

湖南省醫(yī)藥衛(wèi)生科研計劃課題項目(B2013-040);湖南省科技計劃項目(項目編號:2014SK3088).

*通訊作者,E-mail:docwqs@163.com.

R563

A

10.15972/j.cnki.43-1509/r.2015.02.005

(此文編輯:蔣湘蓮)