5種中藥顆粒劑與水煎劑對5種耐藥菌株的體外抑菌作用比較

李藹文，譚俊青，王康椿，黃雙旺，周 兵，劉啟波

(廣東省第二中醫(yī)院檢驗(yàn)科，廣東廣州510095)

目前，抗菌藥物耐藥菌的大量產(chǎn)生增加了臨床患者死亡的危險(xiǎn)性[1-2]，尋求能夠?qū)苟嘀啬退幘奶娲咕幬颷3]已經(jīng)成為全球關(guān)注的一個熱點(diǎn)。中藥抗菌有著悠久的歷史，許多研究表明中藥飲片對多重耐藥細(xì)菌有明顯的抑菌作用[4]。單味中藥抑菌作用的研究多以水煎劑居多[5-6]，其作為中醫(yī)臨床用藥的傳統(tǒng)劑型，卻有攜帶、煎煮不便的缺點(diǎn)。中藥配方顆粒是以中藥飲片為原料，經(jīng)現(xiàn)代化制藥技術(shù)提取、分離、濃縮、干燥、制粒、包裝而成的顆粒狀劑型，供中醫(yī)臨床配方時應(yīng)用。它既保留了中藥飲片的藥性、藥效，又不需要煎煮，質(zhì)量可控[7]，是一種安全、高效、方便的現(xiàn)代中藥制劑。目前，國內(nèi)已可生產(chǎn)多種配方顆粒劑，但它能否保持傳統(tǒng)水煎劑的藥效，尚無明確定論。我們選取了有抑菌作用的5種中藥(苦參、連翹、薄荷、薄公英、黃芩)，采用體外抑菌試驗(yàn)比較5種中藥顆粒劑與水煎劑對臨床分離的5種多重耐藥菌的抑菌效果，為臨床使用顆粒劑型中藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)選用材料

1.中藥水煎劑 苦參、連翹、薄荷、蒲公英、黃芩由廣東省第二中醫(yī)院中藥房提供并鑒定。

2.中藥顆粒劑 苦參、連翹、薄荷、蒲公英、黃芩中藥顆粒劑由廣東一方藥業(yè)公司提供，符合《中國藥典》的規(guī)定。

3.臨床耐藥菌株 耐藥菌株為從廣東省第二中醫(yī)院呼吸科、重癥監(jiān)護(hù)病房(intensive care unit，ICU)患者尿液、血液、痰標(biāo)本中分離的耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(meticillin-resistant Staphylococcus aureus，MRSA)、產(chǎn)金屬酶的銅綠假單胞菌、產(chǎn)β-內(nèi)酰胺酶的肺炎克雷伯菌，產(chǎn)超廣譜β-內(nèi)酰胺酶(extended spectrum beta-lactamase，ESBL)的大腸埃希菌、天然耐藥的鮑曼不動桿菌。

4.藥敏紙片 阿米卡星、氨芐西林、氨曲南、頭孢他啶、頭孢噻肟、頭孢唑啉、慶大霉素、亞胺培南、復(fù)方磺胺甲噁唑、氨芐西林/舒巴坦、阿莫西林/棒酸、氯霉素、頭孢唑啉、環(huán)丙沙星、慶大霉素、苯唑西林、青霉素、萬古霉素藥敏紙片均購自O(shè)xoid公司。萬古霉素紙片含量為30 μg，亞胺培南紙片含量為10 μg。

5.儀器及培養(yǎng)基 梅里埃VITEK-2全自動細(xì)菌鑒定儀(法國生物梅里埃公司)。血平板購自江門市凱林貿(mào)易有限公司(批號140506)。MH平板購自江門凱林貿(mào)易有限公司(批號140512)。

二、方法

1.中藥水煎劑的制備 稱取中藥飲片50 g，置于砂鍋中，加10倍量水浸泡過夜，加熱至沸后改用文火煎30 min，趁熱過濾，濾渣另加8倍量水，同法煎煮30 min，過濾，合并2次濾液于同一燒杯中，水浴濃縮后放涼至室溫，并于50 mL容量瓶中定容，再倒入輸液瓶，蓋薄膜，壓膠塞和鋁蓋，高壓(表壓:0.7 kg/cm2，溫度:115℃，時間:30 min)滅菌，取出放涼，即得1 mL相當(dāng)于原藥材1 g(1∶1)的中藥煎劑溶液。

2.中藥顆粒劑溶液的制備 用分析天平準(zhǔn)確稱取5種中藥顆粒劑適量(相當(dāng)于原中藥飲片50 g)，分別置于燒杯中，用蒸餾水溶解，并在50 mL量筒中定容，再倒入無菌帶蓋容器中，高壓(表壓:0.7 kg/cm2，溫度:115 ℃，時間:30 min)滅菌，取出放涼即得1 mL相當(dāng)于原藥材1 g(1∶1)的中藥顆粒劑溶液。

3.耐藥菌液的制備 將鑒定后的MRSA、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌在血平板上分純，于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。培養(yǎng)后取出細(xì)菌以生理鹽水校正濃度至0.5麥?zhǔn)蠞岫?相當(dāng)于108CFU/mL)。

4.無菌小紙片的制備 將打孔器制成的小紙片(直徑為5 mm)放入平皿中，高壓(表壓:0.7 kg/cm2，溫度:115℃，時間:30 min)滅菌，取出放涼，即得實(shí)驗(yàn)用的無菌小紙片。

5.體外抑菌試驗(yàn) 采用藥敏紙片瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行體外抑菌試驗(yàn)。用無菌接種環(huán)將0.5麥?zhǔn)蠞岫鹊木壕鶆蛲坎加贛-H平板，中間選取一個抗菌藥物紙片做陽性對照(MRSA選取萬古霉素，其它4種細(xì)菌選取亞胺培南)，用無菌鑷子在平板四周貼6片無菌的小紙片(5 mm)，左右兩邊各3片，靜置10 min，左邊3片用校準(zhǔn)過的加樣槍加入1 g/mL中藥水煎劑溶液10μL，右邊3片同樣加入等量的同種中藥顆粒劑溶液。于37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后用游標(biāo)卡尺測量抑菌圈的直徑，分別求出其均值()與標(biāo)準(zhǔn)差(s)。

三、試驗(yàn)結(jié)果判斷標(biāo)準(zhǔn)

中草藥對病原菌的抑菌效果目前國內(nèi)外尚無統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，我們參照國內(nèi)同類型的實(shí)驗(yàn)[8-9]的標(biāo)準(zhǔn)作為結(jié)果的判斷依據(jù):抑菌圈直徑＞20 mm為高度敏感，10～19 mm為中度敏感，＜10 mm為不敏感。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

結(jié) 果

一、5種臨床分離耐藥菌的耐藥譜

見表 1、2。

二、5種中藥對5種耐藥菌的抑菌效果比較

除黃芩、連翹、薄荷對MRSA表現(xiàn)為敏感、黃芩對鮑曼不動桿菌表現(xiàn)為敏感外，其余中藥對5種耐藥菌均表現(xiàn)為不敏感或無抑菌作用?？偟膩碚f，黃芩的抑菌效果最好。見表3。

三、同一種中藥水煎劑與顆粒劑的抑菌效果比較

表1 4種革蘭陰性桿菌的耐藥譜

對于MRSA，黃芩、連翹、薄荷、蒲公英、苦參2種劑型均有抑菌效果，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)。見表3。

表2 MRSA的耐藥譜

表3 5種中藥水煎劑與顆粒劑對5種耐藥菌的抑菌作用 (±s，mm)

表3 5種中藥水煎劑與顆粒劑對5種耐藥菌的抑菌作用 (±s，mm)

注:－表示無抑菌作用，+表示有抑菌作用

銅綠假單胞菌 大腸埃希菌 肺炎克雷伯菌 鮑曼不動桿菌連翹 顆粒劑中藥 劑型 MRSA 11.10 ±0.50 7.42 ±0.57 － － 6.20 ±0.3水煎劑 12.00±0.30 8.67±0.57 － － 7.10±0.5蒲公英 顆粒劑 7.10±0.20 － － － －水煎劑 7.66±0.30 － － － －黃芩 顆粒劑 19.00 ±0.90 6.65±0.10 7.6 ±0.3 6.2±0.57 11.00 ±0.5水煎劑 20.36 ±0.50 7.00 ±0.20 8.1 ±0.2 7.1 ±0.10 12.10 ±0.5薄荷 顆粒劑 13.70±0.14 6.50±0.59 － － 7.60±0.2水煎劑 15.35±0.57 7.83±0.59 － － 8.10±0.3苦參 顆粒劑 6.80±0.10 － － － －水煎劑 7.30±0.30 － － － －陽性對照+++++

對于耐藥性銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌，黃芩、連翹、薄荷2種劑型均有抑菌效果，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);蒲公英，苦參2種劑型均無抑菌效果。

對于大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌，黃芩的2種劑型有抑菌效果，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05);連翹、薄荷、蒲公英、苦參2種劑型均無抑菌作用。

討 論

本研究選用的耐藥菌株均從臨床分離所得，對多種抗菌藥物耐藥。研究結(jié)果顯示，5種中藥無論顆粒劑或水煎劑對5種耐藥菌株的抑菌作用各不相同。其中，黃芩抑菌效果最好，其2種劑型均對MRSA、銅綠假單胞菌、大腸埃希菌、肺炎克雷伯菌、鮑曼不動桿菌有一定的抑菌效果。連翹、薄荷對MRSA、銅綠假單胞菌、鮑曼不動桿菌亦有一定的抑菌效果。雖然抑菌圈大小有一定的差異，敏感性亦不同，但提示這幾種常用的中藥有很好的應(yīng)用前景，可用于細(xì)菌耐藥性的研究，通過進(jìn)一步分析體內(nèi)抑菌活性，更好地指導(dǎo)臨床用藥。

同一種中藥水煎劑與顆粒劑相比，同濃度的黃芩、連翹、薄荷、蒲公英、苦參，顆粒劑和水煎劑抑菌效果差異不明顯。這與王育紅等[10]的報(bào)道不一致。很多研究結(jié)果顯示在體外抑菌試驗(yàn)(試管倍比稀釋法)中，中藥水煎劑明顯要比顆粒劑抑菌效果好。分析與報(bào)道不一致的原因，可能有以下幾方面的影響因素。

首先，與制備工藝和過程有關(guān)。中藥湯劑一直沿用“一只砂鍋二碗水，頭煎二煎服下肚”的傳統(tǒng)煎煮方法，既無加工工藝，又無質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，而且中藥煎煮涉及到藥材的浸泡、先煎后下、水量、火候、煎煮時間、煎煮容器等問題，操作相對復(fù)雜，在實(shí)際應(yīng)用過程中，使飲片活性成分提取受到一定限制。導(dǎo)致煎劑出現(xiàn)質(zhì)量不穩(wěn)定、溶解不充分等缺點(diǎn)。李學(xué)林等[11]證明不同的煎煮方法對中藥煎液的質(zhì)量影響很大。

單味中藥濃縮顆粒是按照國家中醫(yī)藥管理局《單味中藥濃縮顆粒研制指南》要求，采用符合炮制規(guī)范的中藥飲片為原料，經(jīng)現(xiàn)代化科學(xué)提取、低溫濃縮、噴霧干燥、干壓制劑制成的現(xiàn)代“飲片”顆粒。其性味、歸經(jīng)、功能主治、用法用量與原中藥飲片完全一致。但仍存在一些問題，如尚缺少統(tǒng)一的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)、包裝規(guī)格少、對單味中藥濃縮顆粒的應(yīng)用劑量和原飲片劑量沒有科學(xué)的折算等。同時，在配制過程中，顆粒劑稱取的量和溶解性等問題有可能會導(dǎo)致顆粒劑的實(shí)際濃度比理論濃度高。因此，這就需要科研人員不斷挖掘與探索中藥藥效，分析其物理與化學(xué)特性，并與更多的水煎劑比較，為其臨床使用顆粒劑型中藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

其次，與實(shí)驗(yàn)方法也有關(guān)。本研究采用藥敏紙片法，是一種半定量的試驗(yàn)方法，操作簡便，工作量小，但紙片所吸附的藥量不易確定，且吸附到紙片上的藥液擴(kuò)散不同，故可能會影響藥物的抑菌效果[12]。試管連續(xù)稀釋法[13]操作的工作量大，但它能夠精確測出各種中草藥的最低抑菌濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)值。而且藥物在液體環(huán)境中，抑菌有效成分具有較好的擴(kuò)散性，能持續(xù)地作用于細(xì)菌。因此，應(yīng)進(jìn)一步做試管稀釋法，測定MIC，更準(zhǔn)確地判斷顆粒劑與水煎劑的抑菌效果。

中草藥的清熱解毒藥理作用，主要體現(xiàn)為抗病原微生物、抗病毒、清熱、抗炎、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等，故深入研究中藥對細(xì)菌的體內(nèi)體外的抑菌作用，無論是顆粒劑或水煎劑，對控制耐藥菌的感染與蔓延具有非常重要的實(shí)際意義。

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