IL-17和IL-23在成人原發(fā)性腎病綜合征患者中的變化及意義

周韻嬌，張麗紅，李 鵬，葉鮮嫵，牛建英

(1.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院中心實驗室，上海200240;2.復(fù)旦大學(xué)附屬上海市第五人民醫(yī)院腎內(nèi)科，上海200240)

原發(fā)性腎病綜合征(primary nephrotic syndrome，PNS)是以大量蛋白尿、低蛋白血癥、水腫和高脂血癥為臨床表現(xiàn)的一組綜合征，可由多種不同病理類型的原發(fā)性腎小球疾病引起。目前認(rèn)為多數(shù)腎小球疾病是免疫介導(dǎo)的炎性反應(yīng)，T細(xì)胞免疫功能紊亂及一些炎癥細(xì)胞因子的刺激是PNS發(fā)病過程中的主要環(huán)節(jié)[1]。自Th17細(xì)胞被確立為單獨的T細(xì)胞亞群后，白細(xì)胞介素17(interleukin 17，IL-17)和白細(xì)胞介素23(interleukin 23，IL-23)逐漸成為炎癥和自身免疫性疾病的研究熱點[2]。IL-17、IL-23和白細(xì)胞介素 6(interleukin 6，IL-6)分別由Th17細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞等抗原遞呈細(xì)胞、活化的單核細(xì)胞產(chǎn)生，分別發(fā)揮促炎癥作用、穩(wěn)定Th17細(xì)胞表型和促進(jìn)Th17細(xì)胞增殖、介導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的功能[3-7]。為了探討IL-17和IL-23在成人PNS疾病發(fā)生和進(jìn)展中可能的作用，我們對臨床激素治療有效的35例PNS患者強的松治療前后外周血T細(xì)胞亞群及血清和24 h尿液中IL-17、IL-23、IL-6水平的變化分別進(jìn)行了觀察。

材料和方法

一、研究對象

從2010年9月至2013年11月初次于上海市第五人民醫(yī)院就診的86例PNS住院患者中選取35例激素治療有效的患者作為實驗組，其中男20例、女15例，年齡(29±7)歲，臨床和實驗室檢查排除繼發(fā)性病因和遺傳性疾病引起的腎病綜合征，并且均符合 PNS診斷標(biāo)準(zhǔn)[8]，近期內(nèi)未接受過激素或免疫抑制劑治療。上述患者入院后使用強的松進(jìn)行治療，按1 mg/(kg·d)進(jìn)行起始治療，4～6周緩解后開始減量，每1～2周遞減10%，直至停藥，強的松治療臨床完全緩解的指征為24 h蛋白定量＜300 mg/d。對照組為上海市第五人民醫(yī)院同期健康體檢者20名，其中男11名、女9名，年齡(30±6)歲，肝、腎功能檢查正常，無心、肝、肺、腎等重要臟器疾病。兩組性別構(gòu)成及年齡差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。

二、試劑和儀器

1.試劑 雙色淋巴細(xì)胞亞群分析檢測試劑盒[抗體組成為 CD3/CD4、CD3/CD8、IgG1/IgG2a，均為異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate，F(xiàn)ITC)/藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)雙色標(biāo)記]購自美國Becton-Dickinson公司，溶血素和標(biāo)準(zhǔn)熒光微球購自 Beckman-Coulter公司，IL-17、IL-23、IL-6檢測試劑盒均購自美國R＆D公司，24 h尿蛋白定量試劑盒購自Roche公司。

2.儀器 Beckman-Coulter Epics XL流式細(xì)胞分析儀，Thermo公司 MK3酶標(biāo)儀，Modular公司4P型全自動生化分析儀。

三、方法

1.標(biāo)本采集 空腹采集對照組、實驗組強的松治療前和治療4～6周完全緩解時的靜脈血5 mL，分成2份，一份為乙二胺四乙酸二鉀抗凝全血，用于T細(xì)胞亞群分析，另一份無添加劑，分離血清，-80℃保存，用于細(xì)胞因子檢測;同時，留取研究對象24 h尿液標(biāo)本，用于尿蛋白定量和細(xì)胞因子檢測。

2.T細(xì)胞亞群檢測 采用流式細(xì)胞儀檢測所有研究對象的外周血T細(xì)胞亞群，具體操作嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行。為了獲得準(zhǔn)確可靠的實驗結(jié)果，每次檢測前，采用標(biāo)準(zhǔn)熒光微球?qū)x器進(jìn)行光路校準(zhǔn)，使得Half變異系數(shù)＜2%;為了消除背景熒光對實驗的干擾，采用同型對照調(diào)節(jié)電壓。

3.細(xì)胞因子檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測所有研究對象血清和24 h尿液中IL-17、IL-23和IL-6的水平，具體操作嚴(yán)格根據(jù)試劑盒說明書進(jìn)行，所有標(biāo)本的檢測采用復(fù)孔，結(jié)果取平均值。

4.24 h尿蛋白定量 用全自動生化分析儀進(jìn)行24 h尿蛋白定量。

四、統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，方差齊性時多組間的兩兩比較采用LSD分析，方差不齊時采用Games-Howell分析，相關(guān)性研究采用Pearson相關(guān)分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

一、對照組與PNS患者強的松治療前后外周血T細(xì)胞亞群結(jié)果比較

與對照組比較，PNS患者治療前外周血CD3+、CD3+CD4+細(xì)胞數(shù)明顯減少(P ＜0.05)，CD3+CD8+細(xì)胞數(shù)及CD4/CD8比值差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);治療后 PNS患者 CD3+、CD3+CD4+細(xì)胞數(shù)較治療前明顯增加(P＜0.05)，CD3+CD8+細(xì)胞數(shù)及 CD4/CD8 比值較治療前無明顯變化(P＞0.05)。見表1。

表1 不同組別外周血T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果比較 (±s)

表1 不同組別外周血T細(xì)胞亞群檢測結(jié)果比較 (±s)

注:與對照組比較，*P ＜0.05;與 PNS組治療前比較，#P ＜0.05

CD4/CD8對照組組別 CD3+(%) CD3+CD4+(%) CD3+CD8+(%)24.55 ±7.67 1.91 ±1.16 67.92 ±6.56 37.38 ±3.72 22.56 ±5.44 1.77 ±0.50 PNS組治療前 63.63 ±6.07* 34.17 ±4.07* 24.78 ±4.86 1.45 ±0.38治療后 68.11 ±6.82# 39.94 ±5.95#

二、對照組與PNS患者強的松治療前后血清中 IL-23、IL-17、IL-6 水平比較

與對照組比較，PNS患者治療前血清中IL-17和IL-6水平明顯增加(P＜0.05)，IL-23水平雖有增加趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05);經(jīng)治療，PNS患者血清IL-17、IL-23和IL-6水平較治療前雖有減少趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。見表2。

表2 不同組別血清IL-23、IL-17和IL-6水平比較 (±s，pg/mL)

表2 不同組別血清IL-23、IL-17和IL-6水平比較 (±s，pg/mL)

注:與對照組比較，*P ＜0.05、＊＊P ＜0.01

組別IL-23 IL-17 IL-6對照組310.96 ±74.03 436.74 ±80.81 54.99 ±11.65 PNS組治療前 371.08 ±65.90 524.56 ±83.35＊＊ 63.43 ±8.11*治療后353.53 ±129.24 503.19 ±144.87 61.63 ±12.08

三、對照組與PNS患者強的松治療前后24 h尿液中IL-23、IL-17、IL-6水平比較

與對照組比較，PNS患者治療前24 h尿液中IL-17、IL-23、IL-6水平明顯增加(P ＜0.01);經(jīng)治療，PNS患者 IL-17、IL-23、IL-6水平較治療前明顯降低(P ＜0.05)。見表3。

四、PNS患者外周血T細(xì)胞亞群與24 h尿蛋白定量相關(guān)性分析

表3 不同組別24 h尿液中IL-23、IL-17、IL-6水平比較 (±s，pg/mL)

表3 不同組別24 h尿液中IL-23、IL-17、IL-6水平比較 (±s，pg/mL)

注:與對照組比較，*P＜0.01;與 PNS組治療前比較，#P＜0.05、##P ＜0.01

組別IL-23 IL-17 IL-6對照組108.21 ±9.84 71.02 ±9.16 51.06 ±3.95 PNS組治療前 118.47 ±10.47*79.20 ±6.29* 55.64 ±7.04*治療后 106.48 ±9.66## 70.42 ±10.85## 51.21 ±5.28#

PNS患者治療前外周血CD3+、CD3+CD4+、CD3+CD8+細(xì)胞數(shù)以及CD4/CD8比值與24 h尿蛋白定量無明顯相關(guān)性(r=-0.248、-0.290、0.286、-0.317，P 均 ＞0.05)。

五、PNS患者血清和24 h尿液IL-23、IL-17、IL-6水平與24 h尿蛋白定量相關(guān)性分析

PNS患者治療前血清 IL-17、IL-23水平與24 h 尿蛋白定量呈顯著正相關(guān)(r=0.850、0.703，P均＜0.01)，見圖1;IL-6水平與24 h尿蛋白定量無相關(guān)性(r=0.228，P ＞0.05)。24 h 尿液中IL-17、IL-23水平與24 h尿蛋白定量呈顯著正相關(guān)(r=0.695、0.637，P ＜0.01)，見圖 2;而 IL-6 水平與24 h尿蛋白定量無相關(guān)性(r=0.113，P ＞0.05)。

圖1 血清IL-17、IL-23水平與24 h尿蛋白定量的相關(guān)性分析

圖2 24 h尿液IL-17、IL-23水平與24 h尿蛋白定量的相關(guān)性分析

討 論

PNS由多種不同病理類型的原發(fā)性腎小球疾病所引起，是一種常見的免疫性腎病，發(fā)病機(jī)制十分復(fù)雜，與細(xì)胞免疫、體液免疫、自由基的毒性、白細(xì)胞介素功能紊亂等因素有關(guān)。感染、血栓栓塞、急性腎功能衰竭是PNS常見的并發(fā)癥，嚴(yán)重影響著疾病的預(yù)后，威脅到患者的生命，因此探索PNS可能的免疫學(xué)機(jī)制，對尋找合理有效的治療手段，減少并發(fā)癥的發(fā)生有著重要的意義。然而，不同病理類型的PNS發(fā)生的免疫學(xué)機(jī)制不同，對激素治療的敏感性也不同，因此本研究僅選取激素治療有效的35例PNS患者作為研究對象，對其治療前后細(xì)胞免疫狀態(tài)和細(xì)胞因子的變化進(jìn)行分析。

有研究表明，細(xì)胞免疫功能紊亂和T細(xì)胞亞群失衡是 PNS發(fā)病的重要因素[9]。CD4+和CD8+細(xì)胞是T細(xì)胞的2個亞群，兩者形成的T細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)在維持和調(diào)節(jié)機(jī)體正常的細(xì)胞免疫平衡中發(fā)揮重要作用，任何原因引起的CD4+和CD8+T細(xì)胞比例失調(diào)均會導(dǎo)致機(jī)體免疫功能的異?；蛭蓙y。有文獻(xiàn)報道，4周的激素治療可緩解PNS患者的臨床癥狀，但免疫功能紊亂的狀態(tài)未得到糾正，激素治療8周達(dá)到完全緩解時，T淋巴細(xì)胞失衡得到改善[10]。

本研究結(jié)果顯示，與對照組比較，PNS患者治療前 CD3+、CD3+CD4+細(xì)胞數(shù)明顯減少(P＜0.05)，CD3+CD8+細(xì)胞數(shù)和 CD4/CD8 比值分別有增加和減少的趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，提示PNS患者可能存在細(xì)胞免疫功能紊亂和T細(xì)胞亞群失衡;經(jīng)治療，PNS患者CD3+、CD3+CD4+細(xì)胞數(shù)較治療前明顯增多，提示4～6周的激素治療能夠改善PNS患者的免疫失衡狀態(tài)，該結(jié)果與此前的一些研究結(jié)果相似。本實驗結(jié)果還提示，CD4+T細(xì)胞是造成T細(xì)胞亞群失衡的主要因素，T淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少，導(dǎo)致PNS患者細(xì)胞免疫功能降低，這可能是PNS患者易并發(fā)感染的原因之一。

CD4+T細(xì)胞根據(jù)產(chǎn)生細(xì)胞因子的不同，可以分為 Th1、Th2、Th17 和調(diào)節(jié)性 T(regulatory T cell，Treg)細(xì)胞4個亞群，各自通過分泌相應(yīng)的細(xì)胞因子發(fā)揮免疫學(xué)作用。以往關(guān)于PNS發(fā)病的細(xì)胞免疫學(xué)機(jī)制的探討多集中于Th1和Th2細(xì)胞，關(guān)于Th1和Th2的優(yōu)勢應(yīng)答存在較大的爭議[11-12]，直到2005年HARRINGTON等[2]確立了 Th17作為單獨的T細(xì)胞亞群存在后，IL-17作為Th17表達(dá)的重要細(xì)胞因子在實驗研究中受到關(guān)注。越來越多的研究認(rèn)為，IL-23/IL-17軸在炎癥和自身免疫性疾病中扮演著重要的角色[13-14]。PAUST等[15]通過基因敲除小鼠闡明了IL-23/IL-17軸在實驗性腎小球腎炎的小鼠模型中的作用及其機(jī)制。LIU等[16]的研究表明，IL-17在腎臟局部微環(huán)境中發(fā)揮著重要的作用。

為了進(jìn)一步探討IL-17和IL-23在成人PNS疾病進(jìn)展中可能的免疫學(xué)機(jī)制和產(chǎn)生的免疫學(xué)效應(yīng)，評估其對臨床激素治療的指導(dǎo)意義，本研究對入選的35例PNS患者強的松治療前后血清和24 h尿液中IL-17、IL-23和IL-6的水平進(jìn)行了檢測。結(jié)果顯示，PNS患者治療前血清中IL-17和IL-6水平以及24 h尿液中IL-17、IL-23和IL-6的水平較對照組明顯增加(P＜0.05)，經(jīng)治療，PNS患者血清中的IL-17、IL-23和IL-6水平較治療前有減少趨勢，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，而24 h尿液中IL-17、IL-23和IL-6水平較治療前明顯降低(P＜0.05)。說明PNS患者在病情緩解的過程中，24 h尿液中IL-17、IL-23和IL-6水平的變化較血清更為敏感，對尿液中 IL-17、IL-23和IL-6水平的檢測可能成為PNS病情緩解的一個較為敏感的指標(biāo);同時也提示強的松可能通過調(diào)節(jié)IL-17和IL-23的分泌使PNS病情得到緩解。

既往的研究發(fā)現(xiàn)，微小病變型腎病患者腎組織中IL-17的表達(dá)明顯高于正常對照組，急性腎功能衰竭患者IL-17異常增高[16]。我們的相關(guān)分析顯示，PNS患者血清中IL-23和IL-17水平的變化以及24 h尿液中IL-17和IL-23水平的變化與24 h尿蛋白定量均呈顯著正相關(guān)，結(jié)合已有的研究，IL-17能夠誘導(dǎo)足細(xì)胞凋亡，減少足細(xì)胞相關(guān)蛋白podocalyxin的表達(dá)，是引起兒童PNS患者大量蛋白尿的因素之一[17]，提示 IL-17和IL-23可能與PNS患者大量蛋白尿的形成有關(guān)。IL-17不僅能夠促進(jìn)成纖維細(xì)胞和上皮細(xì)胞分泌趨化因子和細(xì)胞因子，促進(jìn)炎癥細(xì)胞向腎組織招募，引起腎臟組織細(xì)胞的浸潤和破壞，導(dǎo)致腎小球濾過膜通透性增加，而且還能夠誘導(dǎo)IL-6表達(dá)，后者協(xié)同轉(zhuǎn)化生長因子β(transforming growth factor beta，TGF-β)，在IL-23的參與下介導(dǎo) Th17細(xì)胞的分化，導(dǎo)致IL-17水平進(jìn)一步增加，發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，促進(jìn)了PNS患者大量蛋白尿的形成。此外，過表達(dá)的IL-6作為攻擊性炎癥介質(zhì)發(fā)揮作用，促進(jìn)腎組織的損傷，參與疾病的病理過程[18]。然而，缺乏腎臟病理學(xué)基礎(chǔ)是本研究的局限性所在。另有研究表明，兒童PNS患者外周血Th17細(xì)胞數(shù)量較正常人增多，Treg細(xì)胞數(shù)量減少，兩群細(xì)胞平衡的破壞與PNS患者蛋白尿的出現(xiàn)和病理過程密切相關(guān)[19]，因此未分析Th17和Treg細(xì)胞間的平衡是本文所存在的不足。

綜上所述，PNS患者存在細(xì)胞免疫功能紊亂和T細(xì)胞亞群失衡，CD4+T細(xì)胞是引起T細(xì)胞亞群失衡的主要因素;IL-17和IL-23可能與PNS患者大量蛋白尿的形成有關(guān);通過對PNS患者治療前后血清和24 h尿液中IL-17、IL-23水平進(jìn)行檢測，有利于判斷病情嚴(yán)重程度和指導(dǎo)免疫治療，尤其是24 h尿液中的水平變化，可能成為PNS病情緩解中一個較為敏感的指標(biāo)。進(jìn)一步研究IL-23和IL-17在激素治療無效的PNS患者中的變化，將有助于全面認(rèn)識其在病情判斷和臨床治療中的指導(dǎo)意義。

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