雌激素及其受體調(diào)節(jié)劑對APOE基因敲除小鼠胸主動脈CD40/CD40L的影響

陳 瑛，趙煥英，楊 穎，宋學(xué)英，郭 偉，薛 冰(首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京友誼醫(yī)院，北京 00050;首都醫(yī)科大學(xué)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)與測試中心;首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京天壇醫(yī)院;通訊作者，E-mail:xuebing_bj@6．com)

近年來，隨人口老齡化和生活水平的提高，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)的發(fā)病率和致死率在不斷攀升。尤其絕經(jīng)后的中年女性發(fā)病率明顯比絕經(jīng)前發(fā)病率増高。AS是許多免疫炎性因子參與的一種慢性炎癥疾?。?］。研究報道人白細(xì)胞分化抗原CD40及其配體CD40L作為上游炎性因子，參與了炎癥、動脈粥樣硬化和血栓形成的各個環(huán)節(jié)，成為AS病理過程中重要的研究因子［2-3］。除了抗炎治療外，雌激素替代療法也成為女性AS治療重要手段，但雌激素治療效果頗具爭議，雌激素對AS有效治療有很多報道［4］。但也有研究報道雌激素替代治療并不能減少已有冠心病絕經(jīng)后婦女AS發(fā)生，也不能減慢AS發(fā)展［5］。本研究觀察不同絕經(jīng)期小鼠給予雌激素治療對雌激素受體(Estrogen receptor，ER)敏感性及對炎性因子CD40/CD40L系統(tǒng)影響。為進(jìn)一步明確絕經(jīng)后激素治療對動脈粥樣斑塊穩(wěn)定性影響提供證據(jù)。

1 材料與方法

1．1 實(shí)驗(yàn)動物及主要試劑和儀器

去勢APOE(-/-)小鼠，品系C57BL/6J;戊酸雌二醇(又名補(bǔ)佳樂，美國拜耳公司)，非特異性ER受體拮抗劑ICI 182780和特異性雌激素受體β(ERβ)拮抗劑 PHTTP均購于英國 TOCRIS公司;CD40、CD40L抗體(abcam)，兔二步法檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)，羅丹明標(biāo)記羊抗兔IgG(H+L)二抗(KPL);Rneasy Lipid Tissue Kit(Qiagen)，第一鏈合成試劑盒(Invitrogen)，Power SYBR Green Master Mix(ABI公司);Masson染色試劑盒(Solarbio)。Nanodrop2000(Thermo Fisher)，IQ5 real-time PCR 儀(Bio-Rad)，萊卡顯微鏡等。

1．2 AS動物分組及給藥方式

確定AS斑塊形成，24只APOE(-/-)雌鼠隨機(jī)分成三組:第一組給予生理鹽水0．2 ml/d(對照組);第二組給予非特異ER拮抗劑ICI和雌激素(estrogen，E2):ICI皮下注射 0．13 ml/周 +E2 0．028 mg/(kg·d)(ICI+E2組);第三組給予特異性雌激素 β 受體(Estrogen receptor β，ERβ)拮抗劑 PHTTP和雌激素:PHTTP 0．13 ml/d+E2 0．028 mg/(kg·d)(PHTTP+E2組)。給藥8周后麻醉處死。

1．3 免疫組化和免疫熒光染色

小鼠胸主動脈石蠟包埋組織切片8 μm，常規(guī)脫蠟到水，3%過氧化氫室溫避光20 min阻斷內(nèi)源性過氧化物酶，蒸餾水洗2 min×3次。然后行枸櫞酸熱修復(fù)10 min后，0．01mol/L PBS洗5 min×3次;滴加5%牛血清封閉抗原，濕盒內(nèi)30 min，傾去封閉液，滴加1∶100稀釋CD40和CD40L抗體，置濕盒內(nèi)于4℃過夜孵育。次日PBS洗10 min×3次，CD40玻片滴加1∶300兔兩步法檢測試劑盒二抗，后續(xù)程序按試劑盒說明操作。CD40L按1∶500滴加羅丹明標(biāo)記的兔二抗，室溫孵育1 h，PBS洗10 min×3次，DAPI復(fù)染細(xì)胞核，PBS洗3次后，甘油封片，以PBS代替一抗為陰性對照，調(diào)節(jié)曝光時間，在熒光顯微鏡下采集圖片。

1．4 real-time PCR檢測CD40/CD40L mRNA

新鮮主動脈血管組織液氮保護(hù)下研磨，按Rneasy Lipid Tissue Kit試劑盒說明書提取總RNA，Nanodrop2000檢測提取核酸質(zhì)量，質(zhì)量合格的納入下游實(shí)驗(yàn)，用第一鏈試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)。PCR反應(yīng)中以β-actin為內(nèi)參基因，各基因序列見表1。定量PCR反應(yīng)體系為:cDNA模板50 ng，上下游引物(10 μm)各 0．5 μl，Power SYBR Green PCR master mix 10 μl，補(bǔ)充水至 20 μl。然后進(jìn)行 PCR 反應(yīng)程序，95℃預(yù)變性10 min;95℃變性15 s，60℃退火1 min，在這步采集熒光信號，共40個循環(huán);PCR反應(yīng)之后熔解曲線分析程序:95℃ 1 min，40℃ 1 min，65-95℃逐漸升溫，驗(yàn)證引物特異擴(kuò)增。

表1 研究所用引物的序列Table 1 Primers used in the study

1．5 Masson 染色

主動脈血管常規(guī)石蠟切片脫蠟至水，按Solarbio公司試劑盒說明，先用Weigert鐵蘇木素染色液染細(xì)胞核5-10 min，酸性乙醇分化液分化、水洗。Masson藍(lán)化液返藍(lán)、水洗。蒸餾水洗1 min;再用麗春紅品紅染色液染色5-10 min，磷鉬酸溶液洗1-2 min，弱酸工作液洗1 min;最后放入苯胺藍(lán)染色液中染色1-2 min，弱酸工作液洗1 min。梯度乙醇快速脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。

1．6 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SPSS 13．0統(tǒng)計軟件。各組之間 CD40/CD40L表達(dá)的差異應(yīng)用Kruskal-Wallis檢驗(yàn)，多重比較應(yīng)用Student-Newman-Keuls法。P＜0．05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2．1 免疫組化和免疫熒光結(jié)果

從圖1可見，CD40/CD40L在動脈粥樣硬化斑塊中的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞上均表達(dá)。CD40在斑塊細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)尤其高(圖1A，B中棕染部位)。CD40L在平滑肌上和血管內(nèi)外膜上表達(dá)多。Leica圖像分析軟件顯示對照組、PHTTP+E2組和ICI+E2組的CD40/CD40L 表達(dá)分別為 12．35 ±1．23，7．67 ±0．97，10．54 ±1．17。三組小鼠 CD40/CD40L 的表達(dá)量有顯著不同(H=10．38，P=0．03)。與對照組相比，PHTTP+E2組CD40/CD40L表達(dá)明顯下降(q=12．46，P=0．02)，而ICI+E2組CD40/CD40L下降不明顯。

圖1 CD40和CD40L在動脈粥樣硬化斑塊中的內(nèi)皮細(xì)胞、平滑肌細(xì)胞上的表達(dá)Figure 1 Expression of CD40 and CD40L in the endothelial cells and smooth muscle cells of atherosclerotic plaques

2．2 real-time PCR 結(jié)果

提取三組小鼠主動脈總RNA，反轉(zhuǎn)錄cDNA，以內(nèi)參基因β-actin為內(nèi)參校準(zhǔn)基因，用CD40/CD40L引物，用SYBRGreen染料法擴(kuò)增CD40/CD40L mRNA，以相對定量2-ΔΔCt計算各組擴(kuò)增 Ct值，以對照組表達(dá)量為1，其他兩組相對它的表達(dá)結(jié)果顯示，激素治療組與對照組相比CD40和CD40L mRNA表達(dá)量顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0．05，見圖2)。

圖2 CD40和CD40L mRNA在各組中的相對表達(dá)量Figure 2 The real-time PCR result of CD40 and CD40L mRNA expression in three groups

2．3 Masson 染色結(jié)果

Masson將細(xì)胞核染色為黑藍(lán)色，肌原纖維染色為紅色或淡紅色，膠原纖維為藍(lán)色。對照組膠原纖維在動脈粥樣硬化斑塊處明顯減少，其次為ICI+E2組，而給予ERβ拮抗劑后，再給予雌激素治療，膠原纖維表達(dá)量未見減少(見圖3)，說明纖維斑塊穩(wěn)定。

3 討論

AS是一種全身性、慢性炎性反應(yīng)性疾病，主要是細(xì)胞纖維基質(zhì)、脂質(zhì)和組織碎片的異常沉積，在動脈內(nèi)膜或中層發(fā)生增生等復(fù)雜的病理變化［6］。婦女絕經(jīng)前與同年齡男性相比，動脈硬化的發(fā)病率和死亡率低很多，但絕經(jīng)后發(fā)生率迅速上升，60歲以后接近同年齡組男性水平，絕經(jīng)是心血管疾病發(fā)病率和死亡率上升的獨(dú)立危險因素。激素療法能降低早期絕經(jīng)心血管事件，而隨絕經(jīng)期延長雌激素替代治療并不能減少已有冠心病絕經(jīng)后婦女AS發(fā)生［7，8］，推測絕經(jīng)后激素替代療法對不同絕經(jīng)期心血管效應(yīng)不同，與心血管系統(tǒng)的基礎(chǔ)狀態(tài)及血管上雌激素受體量有關(guān)［9，10］。ER是雌激素替代治療AS的重要靶標(biāo)，ER有ERα和ERβ兩種類型。本課題早期建立絕經(jīng)早期和晚期小鼠模型，發(fā)現(xiàn)主動脈ERα受體在絕經(jīng)早期小鼠的表達(dá)量明顯高于晚期小鼠，ERβ在早期和晚期AS小鼠中表達(dá)無明顯差異［11］。本研究以不同激素調(diào)節(jié)劑進(jìn)一步證明激素替代治療作用機(jī)制，及對AS小鼠主動脈斑塊穩(wěn)定性相關(guān)炎性因子CD40/CD40L系統(tǒng)表達(dá)的影響。發(fā)現(xiàn)與對照組相比，PTHHP+E2組CD40/CD40L表達(dá)量明顯下降;而非特異受體阻斷劑ICI和雌激素(ICI+E2)組CD40/CD40L表達(dá)量下降不顯著。說明ERα介導(dǎo)的激素治療能顯著降低CD40/CD40L系統(tǒng)的表達(dá)。

圖3 主動脈壁Masson染色后膠原纖維在各組中的表達(dá)Figure 3 Expression of fibrils in each group after Masson staining of aortic wall

CD40/CD40L系統(tǒng)在AS的發(fā)生、發(fā)展及斑塊破裂的各個環(huán)節(jié)發(fā)揮重要作用，它是炎性上游因子，可激活下游炎性因子如 IL-1、IL-6、IL-8、IL-12、IFN-γ、TNF-α 的高表達(dá)，從而級聯(lián)放大炎性反應(yīng)［12，13］，同時它還可誘導(dǎo)多種基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)的表達(dá)，使 AS 斑塊的纖維帽變薄［14］，降解間質(zhì)膠原［15］，促進(jìn)斑塊內(nèi)細(xì)胞發(fā)生凋亡，從而進(jìn)一步引發(fā)斑塊壞死核的形成［16］。因此對于AS激素替代治療中檢測CD40/CD40L含量是預(yù)判治療效果的生化指標(biāo)之一。Masson染色顯示，對照組膠原纖維降解嚴(yán)重，結(jié)合炎性因子CD40/CD40L在對照組中含量最高，說明AS斑塊中易觸發(fā)炎性細(xì)胞反應(yīng)，易導(dǎo)致斑塊不穩(wěn)定與心血管事件的發(fā)生。而加入特異雌激素受體ERβ抑制劑PTHHP和雌激素治療后，膠原纖維含量穩(wěn)定，非特異抑制劑和雌激素組膠原含量也有部分降解。說明雌激素通過ERα發(fā)揮治療功能。ERα在AS中是心血管疾病的保護(hù)性因素，而ERβ可能婦女AS的不良因素。

［1］von Hundelshausen P，Schmitt MM．Platelets and their chemokines in atherosclerosis-clinical applications［J］．Front Physiol，2014，8(5):294．

［2］Antoniades C，Bakogiannis C，Tousoulis D，et al．The CD40/CD40 ligand system:linking inflammation with atherothrombosis［J］．J Am Coll Cardiol，2009，54(8):669-677．

［3］Wolf D，Jehle F，Michel NA，et al．Coinhibitory suppression of T cell activation by CD40 protects against obesity and adipose tissue inflammation in mice［J］．Circulation，2014，129(23):2414-2425．

［4］Schierbeck L．Primary prevention of cardiovascular disease with hormone replacement therapy［J］．Climacteric，2015，18(4):492-497．

［5］Anderson GL，Limacher M，Assaf AR，et al．Effects of conjugated equine estrogen in postmenopausal women with hysterectomy:the Women’s Health Initiative randomized controlled trial［J］．JAMA，2004，291(14):1701-1712．

［6］Steinberg D．Atherogenesis in perspective:hypercholesterolemia and inflammation as partners in crime［J］．Nat Med，2002，8(11):1211-1217．

［7］Vitale C，Mercuro G，Cerquetani E，et al．Time since menopause influences the acute and chronic effect of estrogens on endothelial function［J］．Arterioscler Thromb Vasc Biol，2008，28(2):348-352．

［8］Bechlioulis A，Naka KK，Calis KA，et al．Cardiovascular effects of endogenous estrogen and hormone therapy［J］．Curr Vasc Pharmacol，2010，8(2):249-258．

［9］Oviedo PJ，Hermenegildo C，Sobrino A，et al．Therapeutic dosages of oral or transdermal estradiol did not modify sCD40L levels in postmenopausal women［J］．Gynecol Endocrinol，2008，24(6):354-357．

［10］Meyer MR，Barton M．ER alpha，ER beta，and gp ER:novel aspects of oestrogen receptor signalling in atherosclerosis［J］．Cardiovasc Res，2009，83(4):605-610．

［11］陳瑛，藺莉，金華．絕經(jīng)早期和絕經(jīng)晚期小鼠主動脈病理改變及雌激素受體表達(dá)的對比研究［J］．中國全科醫(yī)學(xué)，2010，13(30):3397-3399．

［12］Antoniades C，Bakogiannis C，Tousoulis D，et al．The CD40/CD40 ligand system:linking inflammation with atherothrombosis［J］．J Am Coll Cardiol，2009，54(8):669-677．

［13］Hausding M，Jurk K，Daub S，et al．CD40L contributes to angiotensin Ⅱ-induced pro-thrombotic state，vascular inflammation，oxidative stress and endothelial dysfunction［J］．Basic Res Cardiol，2013，108(6):386．

［14］Ding S，Zhang M，Zhao Y，et al．The role of carotid plaque vulnerability and inflammation in the pathogenesis of acute ischemic stroke［J］．Am J Med Sci，2008，336(1):27-31．

［15］Wu M，Li YG．The expression of CD40-CD40L and activities of matrix metalloproteinases in atherosclerotic rats［J］．Mol Cell Biochem，2006，282(1/2):141-146．

［16］Leroyer AS，Rautou PE，Silvestre JS，et al．CD40 ligand+microparticles from human atherosclerotic plaques stimulate endothelial proliferation and angiogenesis a potential mechanism for intraplaque neovascularization［J］．J Am Coll Cardiol，2008，52(16):1302-1311．