實(shí)驗(yàn)性腦震蕩大鼠腦皮質(zhì)腫瘤壞死因子－α的表達(dá)

嚴(yán)琦敏，張排旗，趙 波，張新宇，付學(xué)鋒(解放軍第醫(yī)院普通外科，西安 70054;第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院消化內(nèi)科;蘭州軍區(qū)蘭州總醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科;共同第作者;通訊作者，E-mail:lkyyfxf@6．com)

顱腦損傷發(fā)病率的急劇上升已成為發(fā)展中國(guó)家醫(yī)學(xué)關(guān)注重點(diǎn)。WHO分析認(rèn)為，作為神經(jīng)外科常見急重癥的創(chuàng)傷性腦損傷(traumatic brain injury，TBI)在不久將可能位居全球疾病第3位，而交通事故則是最主要的致病原因［1-3］。TBI的輕型損傷是腦震蕩(cerebral concussion)，其發(fā)生率很高且機(jī)制不明［2-4］。TBI患者繼發(fā)性腦損傷所致的病理生理改變決定疾病的轉(zhuǎn)歸和預(yù)后，與繼發(fā)性腦損傷相關(guān)的因素有鈣超載、炎癥反應(yīng)、缺血缺氧、興奮性氨基酸和某些自由基等［1］。

在哺乳動(dòng)物大腦的免疫反應(yīng)和炎癥活動(dòng)中，腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)發(fā)揮著重要作用，它作為腦內(nèi)重要的細(xì)胞因子，也是機(jī)體炎癥或組織損傷的介質(zhì)。TNF-α在激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞和促進(jìn)膠質(zhì)細(xì)胞增生，以及組織的瘢痕形成等炎癥發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用［1，4］。我們通過(guò)實(shí)驗(yàn)方法，在建立大鼠單純性腦震蕩(pure cerebral concussion，PCC)模型后應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)損傷后不同時(shí)間點(diǎn)TNF-α在大腦前額葉皮質(zhì)、顳葉皮質(zhì)和梨狀皮質(zhì)的表達(dá)變化，從而探討TNF-α與腦損傷病理生理變化的關(guān)系。

1 材料與方法

1．1 主要試劑與儀器

過(guò)氧化物酶阻斷劑和非免疫羊血清為北京中衫金橋公司廠品;多克隆兔抗TNF-α抗體為上海橋星貿(mào)易有限公司提供;辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記羊抗鼠IgG為北京康為世紀(jì)生物科技有限公司提供;圖文分析系統(tǒng)Image-Pro Plus6．0軟件為美國(guó) Media Cybernetics公司提供;光學(xué)顯微鏡用Olympus BX51TPHD-J11型(日本)。

1．2 建立大鼠單純性腦震蕩(PCC)模型

健康雄性SD大鼠42只，體重(280．4±12．2)g(第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心)，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)2周。大鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組6只，損傷組36只。參照文獻(xiàn)［5，6］方法建立損傷組大鼠模型，于大鼠額頂部用“金屬單擺閉合腦損傷打擊裝置”進(jìn)行鈍性一次性打擊，然后用類回歸方程分析腦震蕩昏迷和恢復(fù)過(guò)程相關(guān)指標(biāo)和時(shí)間參數(shù)變化，將大鼠隨機(jī)分為1，12，24，48，72 h 和7 d 共6 個(gè)損傷組，每組6只。

1．3 標(biāo)本采集與組織切片

用10%水合氯醛鈉(2．5 ml/kg)腹腔注射麻醉大鼠，仰臥位固定于冰袋上降低氧耗，然后用含多聚甲醛(4%)的磷酸鹽緩沖液(PBS，pH 7．2-7．4)腹腔灌注，取出腦組織再以含多聚甲醛(4%)的PBS固定液在4℃恒溫條件下固定48 h，將標(biāo)本進(jìn)行石蠟包埋，冠狀斷面進(jìn)行連續(xù)切片(片厚為10-15 μm)，用于免疫組織化學(xué)。

1．4 免疫組織化學(xué)(SP法)檢測(cè)TNF-α

將腦組織石蠟切片脫蠟至水、抗原熱修復(fù)和PBS漂洗，加入內(nèi)源性過(guò)氧化物酶阻斷劑(1∶150)室溫孵育10 min，PBS漂洗。滴加非免疫羊血清室溫封閉10 min。去除血清后直接滴加一抗為多克隆兔抗 TNF-α(1∶100)，4 ℃孵育24 h。室溫下 PBS 漂洗，滴加生物素標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶50)，室溫孵育15 min。辣根酶標(biāo)記鏈霉菌抗生物素蛋白-過(guò)氧化物酶溶液(1∶150)在室溫下孵育15 min，再以0．1%PBS triton 緩沖液(pH=7．4)漂洗，用 DAB 顯色3-10 min終止反應(yīng)?？瞻讓?duì)照用 PBS(0．01 mol/L)替代一抗，操作步驟同上。

1．5 圖像采集分析

根據(jù)選定的部位(圖1)進(jìn)行圖像采集。選取大鼠腦組織的前額葉皮質(zhì)(PC)的一區(qū)(PC1)和二區(qū)(PC2)、顳葉皮質(zhì)區(qū)(TC)和梨狀皮質(zhì)區(qū)(Pir)進(jìn)行檢測(cè)。圖文分析系統(tǒng)用Image-Pro Plus 6．0軟件，以TNF-α陽(yáng)性棕色反應(yīng)細(xì)胞作為分析區(qū)(area of interest，AOI)進(jìn)行光密度值(optical density，OD)測(cè)定，每個(gè)部位連續(xù)選取5個(gè)高倍顯微鏡視野(×400)測(cè)出陽(yáng)性反應(yīng)物，最后計(jì)算出平均光密度值(AOD)，同時(shí)對(duì)同一時(shí)間點(diǎn)大鼠腦組織陽(yáng)性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

圖1 大鼠腦分區(qū)示意圖Figure 1 Brain areas diagram of rat

1．6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞AOD值和陽(yáng)性細(xì)胞計(jì)數(shù)通過(guò)圖像確定，數(shù)據(jù)用±s表示。單因素方差分析(One-Way，ANOVA)用 SPSS 13．0 統(tǒng)計(jì)軟件，P ＜0．05即認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

在PC1、PC2、TC和Pir 4個(gè)腦分區(qū) TNF-α陽(yáng)性表達(dá)和TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞變化基本相似，未見明顯差異，故用PC1和TC進(jìn)行結(jié)果分析。

PCC大鼠腦組織細(xì)胞中TNF-α強(qiáng)弱和陽(yáng)性細(xì)胞多少與著色相關(guān)，表達(dá)明顯染色越深，陽(yáng)性細(xì)胞輪廓就越清晰可見，典型TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞輪廓清晰，細(xì)胞質(zhì)呈棕褐色，細(xì)胞核不著色。PCC大鼠PC1(圖2A-G)和TC(圖2H-N)兩個(gè)腦區(qū)各時(shí)間點(diǎn)免疫組化染色表明，正常對(duì)照組 PC1(圖2A)和TC(圖2H)腦區(qū)有少量散在的TNF-α表達(dá)較弱的陽(yáng)性細(xì)胞且輪廓不清晰。PCC大鼠PC1(圖2B-E)和TC(圖2I-L)腦區(qū)TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞染色和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均依時(shí)間延長(zhǎng)(1，12，24，48 h)染色逐漸變深至棕褐色且細(xì)胞數(shù)量增多，72 h(圖2F，M)達(dá)到高峰，7 d(圖2G，N)陽(yáng)性細(xì)胞染色減弱且數(shù)量減少，但仍未達(dá)到正常對(duì)照水平。與正常對(duì)照組比較，PCC大鼠不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞 TNF-α表達(dá)(DOI)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均有顯著差異(P ＜0．05，見圖3)。

圖2 PCC大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PC1和TC區(qū)免疫組化染色TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)Figure 2 The positive cells of TNF-α immunoreactivity expression in the cortex of PCC rats

圖3 PCC大鼠不同時(shí)間點(diǎn)PC1和TC區(qū)TNF-α陽(yáng)性表達(dá)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)Figure 3 The immunoreactivity expression and number of TNF-α positive cell at different time points in PC1 and TC of the rats after PCC

3 討論

本實(shí)驗(yàn)研究表明，TNF-α陽(yáng)性表達(dá)和TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞變化在 PC1、PC2、TC和Pir腦分區(qū)基本相似，正常對(duì)照組大鼠前額葉皮質(zhì)(PC)、顳葉皮質(zhì)(TC)和梨狀皮質(zhì)(Pir)腦區(qū)均可見少量散在的TNF-α弱陽(yáng)性的表達(dá)。PCC大鼠TNF-α免疫陽(yáng)性表達(dá)隨著造模時(shí)間推移逐漸增強(qiáng)，同時(shí)陽(yáng)性細(xì)胞染色后輪廓變?yōu)榍逦?，且?yáng)性細(xì)胞的計(jì)數(shù)變化相同。72 h的PCC大鼠，TNF-α陽(yáng)性表達(dá)和TNF-α陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)均達(dá)到峰值，并于7 d呈現(xiàn)下降趨勢(shì)，但仍未達(dá)到正常對(duì)照水平。我們研究提示，實(shí)驗(yàn)性大鼠PCC損傷大腦PC區(qū)和TC區(qū)TNF-α表達(dá)出現(xiàn)明顯改變，表明TNF-α可能參與PCC所致傷損后的病理生理變化過(guò)程。

研究表明，腦震蕩早期缺血缺氧損傷的病理過(guò)程中有多種炎癥因子參與，包括TNF-α、白細(xì)胞介素和神經(jīng)肽類等，而TNF-α含量變化與腦血流變化呈正相關(guān)［10-13］，TNF-α的表達(dá)水平可以間接表明腦組織損傷的程度［14-16］。監(jiān)測(cè)腦震蕩患者血清中TNF-α水平的變化可作為治療效果評(píng)定和預(yù)后分析的依據(jù)之一［17-19］。用自由落體撞擊裝置復(fù)制腦震蕩大鼠模型，通過(guò)免疫組織化學(xué)等方法研究認(rèn)為，TNF-α表達(dá)陽(yáng)性主要見于大腦皮質(zhì)和海馬區(qū)的神經(jīng)細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)，傷后即可出現(xiàn)表達(dá)并緩慢增強(qiáng)，數(shù)日內(nèi)達(dá)到高峰，大多數(shù)于 1周出現(xiàn)下降，2周基本恢復(fù)正常［4-6］。本研究結(jié)果與既往報(bào)道相類似［17-19］，細(xì)胞中TNF-α表達(dá)和陽(yáng)性細(xì)胞于3 d達(dá)高峰，7 d接近正常水平。多數(shù)研究表明［20-24］，大腦缺血缺氧性損傷后TNF-α均可呈現(xiàn)表達(dá)上調(diào)的反應(yīng)，通過(guò)測(cè)定可以間接證實(shí)TNF-α參與了腦損傷發(fā)生早期病理過(guò)程的炎癥反應(yīng)。研究腦損傷過(guò)程中TNF-α在表達(dá)時(shí)間上的報(bào)道有一定的差異，這種現(xiàn)象可能與研究的對(duì)象、動(dòng)物模型構(gòu)建和研究所采用的方法等因素相關(guān)［12-15］。TNF-α介導(dǎo)腦損傷炎癥反應(yīng)的機(jī)制比較復(fù)雜，目前研究認(rèn)為，其機(jī)制可能與下列因素有關(guān):①外力因素致使大腦微循環(huán)功能障礙，出現(xiàn)血管通透性增高和血-腦屏障被破壞，形成腦水腫或腦水腫加重，TNF-α與腦損傷后病理改變互為因果［6］。②活化炎癥反應(yīng)細(xì)胞，對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)的相關(guān)黏附分子-1(ICAM-1)、白介素(IL)發(fā)揮激活作用，同時(shí)加強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞間黏附促使炎細(xì)胞向外浸潤(rùn)血管［20-22］。③影響星形膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子的表達(dá)，促進(jìn)腦膠質(zhì)細(xì)胞增生和修復(fù)［1，22］。④具有抗炎和促炎雙向作用。外傷性腦血管功能紊亂或腦水腫時(shí)表現(xiàn)為抑制免疫反應(yīng)，當(dāng)病變恢復(fù)時(shí)則具有促進(jìn)炎癥消退作用，這一過(guò)程可能通過(guò)腦損傷時(shí)細(xì)胞間信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)級(jí)聯(lián)反應(yīng)來(lái)實(shí)現(xiàn)［20］。TNF-α作為炎性介質(zhì)所發(fā)揮的功能效應(yīng)受其濃度、作用時(shí)間和所針對(duì)受體，以及作用的時(shí)機(jī)等因素的影響［4，11-13］。

腦震蕩(cerebral concussion)是暫時(shí)性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能障礙，大多數(shù)是輕度暴力作用于頭部致使短暫性意識(shí)喪失和近事忘卻，屬于一過(guò)性神經(jīng)功能改變而無(wú)器質(zhì)性損害［1，22］。已有研究發(fā)現(xiàn)，受暴力直接作用部位的神經(jīng)元線粒體可出現(xiàn)腫脹和神經(jīng)軸突損傷，特別是反復(fù)或持久的腦震蕩患者，腦組織的軸突變性明顯，并伴代謝紊亂，這或許是引起后遺癥的重要因素［23-25］。在腦損傷中，PCC屬于最輕型，特別是作為聯(lián)合皮質(zhì)重要部分的前額葉皮質(zhì)受力后，大多數(shù)患者在學(xué)習(xí)、注意力和判斷力等方面都可能出現(xiàn)障礙［23-26］，因?yàn)槭軅课皇菍W(xué)習(xí)記憶功能的關(guān)鍵部位［17］。研究認(rèn)為，大鼠海馬、顳葉皮質(zhì)和梨狀皮質(zhì)是空間學(xué)習(xí)和記憶中樞，而梨狀皮質(zhì)還與嗅覺(jué)和情緒等功能有關(guān)［22］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，PCC致傷后PC、TC和Pir腦區(qū)均有TNF-α表達(dá)增強(qiáng)的改變，已有研究證實(shí)這可能影響大鼠的學(xué)習(xí)和記憶等功能［1，24-26］。PCC 后 TNF-α 表達(dá)水平與大腦損傷程度和中樞神經(jīng)系統(tǒng)的認(rèn)知障礙密切相關(guān)，對(duì)大腦損傷患者檢測(cè)TNF-α表達(dá)水平是反應(yīng)損害嚴(yán)重程度的一個(gè)側(cè)面［27-29］。

由于認(rèn)知功能障礙與TNF-α之間存在一定的相關(guān)性，因此，本實(shí)驗(yàn)從PCC模型大鼠的PC、TC和Pir腦區(qū)測(cè)定神經(jīng)元TNF-α表達(dá)和陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量角度進(jìn)行分析，從而證實(shí)PCC與學(xué)習(xí)記憶存在一定的相關(guān)性［28-30］。我們推斷，顱腦損傷導(dǎo)致的 TNF-α上調(diào)對(duì)組織細(xì)胞損傷可能有明顯促進(jìn)作用，臨床上通過(guò)人為方法抑制TNF-α表達(dá)可能有助于延緩或減輕損傷后的病理生理反應(yīng)。進(jìn)一步研究TNF-α在腦損傷病理過(guò)程中作用機(jī)制并找出抑制策略，這對(duì)減輕患者腦損傷后遺癥有一定指導(dǎo)作用［31］。

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