CAC1基因在人胃癌細胞和組織中的表達

鄭 琪，徐玉喬，張 茜，趙凌宇，廖子君，南克俊(西安交通大學醫(yī)學院附屬陜西省腫瘤醫(yī)院內(nèi)一科，西安 7006;第四軍醫(yī)大學附屬西京醫(yī)院病理科;西安交通大學醫(yī)學院遺傳學教研室;西安交通大學第一附屬醫(yī)院腫瘤內(nèi)科)

世界范圍內(nèi)胃癌的年發(fā)病人數(shù)在所有惡性腫瘤排第四位，年死亡人數(shù)排第二位［1］。全球胃癌的發(fā)病率和死亡率在過去幾十年中已經(jīng)出現(xiàn)了明顯下降［2］，但它仍然是威脅人類健康和生命最常見的惡性腫瘤之一。晚期轉(zhuǎn)移性胃癌患者的中位生存期僅僅8-10個月，其5年生存率不到7%［3］。研究胃癌相關基因，有助于深入了解胃癌的發(fā)病機制，提高其診斷和治療水平。

泛素-蛋白酶體系統(tǒng)所介導的蛋白質(zhì)水解，在維持細胞的正常生長和失控增殖的平衡方面起著重要的作用。Cullin家族的泛素連接酶是其中最大的一類RING型E3泛素連接酶，與細胞增殖、分化和凋亡密切相關，cullin活性的失調(diào)可能引起細胞的惡性轉(zhuǎn)化和癌變［5，6］。CAC1(CDK-associated cullin 1)是從結(jié)直腸癌中分離和鑒定出來的一個cullin家族新基因。它在人體多種正常組織中均有表達，在正常細胞中的表達水平低于腫瘤細胞，在腫瘤細胞中表達水平隨著惡性程度的增高而增高。體外實驗發(fā)現(xiàn)，CAC1與細胞周期G1/S轉(zhuǎn)換的調(diào)控有關。而且，它可與細胞周期蛋白依賴性激酶2(CDK2)結(jié)合并提高其活性［7］。由于目前有關CAC1的研究結(jié)果主要來源于結(jié)直腸癌，因而對它在胃癌中的表達和生物學特性所知甚少。本研究選擇與結(jié)直腸癌組織學起源類似的胃癌作為研究對象，研究CAC1在胃癌組織和細胞中的表達情況，為進一步研究其生物學功能奠定基礎。

1 材料與方法

1．1 細胞系與組織標本

人胃黏膜細胞系GES-1購自上海艾研生物科技有限公司;人胃癌細胞系AGS購自中科院上海細胞庫;人胃癌細胞系MGC803、BGC823由西安交通大學醫(yī)學院生物醫(yī)學研究實驗中心保存。

組織標本:選用35例胃腺癌組織(臨床分期為Ⅰ-Ⅳ期)及相應正常組織(距癌組織邊緣大于10 cm的正常組織)標本，來自西安交通大學第一附屬醫(yī)院，所有樣本臨床病理資料齊備，病理診斷明確。

1．2 試劑及溶液

10%新生小牛血清購自美國Gibico公司，RPMI 1640培養(yǎng)基購自美國Gibico公司，胰蛋白酶購自中國寶信生物，Trizol購自美國Invitogen公司，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自日本TaKaRa公司，cDNA第一鏈合成試劑盒購自美國Invitogen公司，原位雜交專用蓋玻片，多聚賴氨酸(POLY-L-LYSINE)，焦碳酸二乙酯(DEPC)，敏感性加強型原位雜交檢測試劑盒Ⅰ購自武漢博士德生物工程有限公司，DAB Kit(20×)購自北京鼎國生物工程有限公司。

1．3 實時定量PCR檢測胃癌中CAC1的表達

細胞培養(yǎng):常規(guī)貼壁法將人胃黏膜細胞系GES-1、人胃癌細胞系 AGS、MGC803、BGC823 培養(yǎng)于10%小牛血清的RPMI 1640培養(yǎng)基中。取對數(shù)生長期的細胞備用。

RNA的提取和逆轉(zhuǎn)錄:Trizol法提取培養(yǎng)細胞的總RNA，進行RNA定量分析和RNA電泳，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。逆轉(zhuǎn)錄反應條件:42℃ 15 min;滅活逆轉(zhuǎn)錄酶:95℃ 2 min，經(jīng)過上述反應得到逆轉(zhuǎn)錄反應液，可加入RT-PCR反應體系。所得反應液置于-20℃保存?zhèn)溆?分光光度計檢測A260/A280值，估計DNA的濃度。

實時定量PCR:依據(jù)CAC1的cDNA和管家基因β-actin的cDNA序列，利用Primer Premier 5軟件設計實時熒光定量PCR寡核苷酸引物。序列通過BLAST進行比對具有特異性。引物序列由TaKaRa公司設計合成，具體如下。CAC1-forward:5＇-CAT TTA CAG CCT AAT GCC TTT ACT-3＇，CAC1-reverse:5＇-GCA GCA TAT TCA GAA AGT TCA GA-3＇;β-actin forward:5＇-TGG CAC CCA GCA CAA TGA A-3＇，β-actin reverse:5＇-CTA AGT CAT AGT CCG CCT AGA AGC A-3＇。實時定量PCR擴增，加樣如下，每組設3個重復檢測管，各樣品混勻后，離心，上機檢測，熒光定量PCR儀進行擴增，實時獲取擴增曲線;反應過程:95℃預變性5 min→95℃變性15 s→58℃退火15 s→72℃延伸40 s;總計40個循環(huán)。實時熒光定量PCR儀相應軟件程序記錄、分析檢測數(shù)據(jù)，輸出結(jié)果。根據(jù)公式Folds=2-ΔΔCt計算各檢測目的基因的相對表達量，比較各實驗組與對照組之間目的基因擴增的變化情況。

公 式:ΔΔCt=(Ct目的基因-Ctβ-actin)實驗組-(Ct目的基因-Ctβ-actin)對照組。

1．4 原位雜交法檢測胃癌組織中CAC1的表達

探針的合成:CAC1基因的原位雜交探針序列，依據(jù)CAC1編碼框序列設計，全長為46 bp，由上海生工生物工程有限公司負責合成。探針序列:5＇-TTC ATT AAG AAC TTG GAG G(U)GGA GGT GTT GAT GTT GAT GGT GGA GC-3＇dig;3＇端地高辛標記，中部2F-RNA修飾“(U)”中堿基。采用多聚賴氨酸對玻片進行處理，癌組織和癌周圍正常組織石蠟塊各切片5張，每張切片厚度5 μm。

實驗步驟:切片脫蠟、暴露核酸片段、預雜交、雜交、雜交后洗滌、滴加封閉液、滴加生物素化鼠抗地高辛、滴加SABC、滴加生物素過氧化物酶、DAB顯色、蘇木素復染、脫水封片，鏡檢。結(jié)果觀察:陽性細胞的胞質(zhì)著色呈棕黃色。

1．5 統(tǒng)計學分析

所有數(shù)據(jù)經(jīng)過整理后輸入SPSS19．0軟件進行統(tǒng)計分析，實時定量PCR結(jié)果使用±s的形式，單向方差分析法(One-way ANOVA)比較不同組間均數(shù)的差異，P＜0．05視為差異具有統(tǒng)計學意義;原位雜交實驗的臨床資料和結(jié)果，使用四格表卡方檢驗法(Chi-square test four-fold table)，P ＜0．05視為差異具有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2．1 CAC1在胃黏膜和胃癌細胞系中的表達

應用實時定量PCR法檢測了不同胃癌細胞系和胃黏膜細胞系中CAC1 mRNA表達量，獲取目的基因擴增曲線(圖 1A)，按照公式:Folds=2-ΔΔCt計算。基因的溶解曲線可反映擴增產(chǎn)物的特異性，如曲線為單峰且峰值高，則表示擴增產(chǎn)物為特異性的靶片段。本研究結(jié)果中的溶解曲線均為單峰(圖1B、C)，表明獲得了特異的擴增產(chǎn)物。

結(jié)果顯示，無論在胃癌細胞系還是在胃黏膜細胞系中，均可以檢測出CAC1 mRNA的表達，但其表達水平有所不同(見圖2)。統(tǒng)計學分析顯示，胃癌細胞系中，AGS或MGC803細胞系的CAC1 mRNA表達水平均高于 BGC823細胞系(1．000 0±0．000 0 or 0．950 7 ±0．017 6 vs 0．434 0 ±0．041 4，P ＜0．05)，但AGS與MGC803之間CAC1 mRNA表達水平無明顯差異(P＞0．05)。另一方面，上述胃癌細胞系(AGS or MGC803 or BGC823)的CAC1 mRNA水平都顯著高于胃黏膜細胞系 GES-1(0．201 7 ±0．008 2，P ＜0．05)。

圖1 實時定量PCR的CAC1的擴增曲線和溶解曲線Figure 1 Amplification and melt curves of CAC1 by real-time PCR

圖2 各細胞系中CAC1-mRNA的表達水平Figure 2 CAC1 mRNA expression in different cell lines

2．2 CAC1在胃癌組織和癌周正常組織中的表達

原位雜交結(jié)果顯示，CAC1在胃癌組織中表達水平較高，主要表達于腫瘤細胞的胞質(zhì)，在癌周正常組織中表達水平很低，僅在間質(zhì)中存在少量非特異性表達(見圖3)。統(tǒng)計學分析提示，CAC1在胃癌組織中的陽性表達率明顯高于胃癌周圍正常組織，兩者的差異具有統(tǒng)計學意義;CAC1在癌組織中的陽性表達率與患者年齡、細胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關，與胃癌的臨床分期有關，分期越晚，陽性率越高(見表1)。

圖3 CAC1在胃癌組織和胃正常組織中的表達(ISH，×400)Figure 3 CAC1 expression in gastric cancer and normal tissues(ISH，×400)

表1 CAC1在胃癌組織和胃周圍正常組織中的表達Table 1 CAC1 expression in gastric cancer and surrounding normal tissues by in situ hybridization

3 討論

文獻報道［7］，對人組織的cDNA文庫進行RTPCR法檢測，CAC1在結(jié)腸、小腸、肝臟、胃、肺、腎、肌肉、心臟、乳腺、腦、脾臟、淋巴結(jié)等多種組織中均有不同程度的表達，其中結(jié)腸和乳腺組織中的表達水平較高，而在胃組織中僅有微弱的表達;Western blot法發(fā)現(xiàn)CAC1在多個正常細胞系和腫瘤細胞系中均有表達，而且CAC1在正常細胞系中的表達水平低于腫瘤細胞，在腫瘤細胞中的表達水平隨著惡性程度的增高而增高［7］。

本研究經(jīng)過實時定量PCR法檢測后發(fā)現(xiàn)，CAC1的mRNA在胃癌細胞系AGS和MGC803中的表達水平較高，在BGC823細胞系中表達水平相對較低。值得注意的是，3個胃癌細胞系中CAC1的mRNA表達水平均明顯高于胃黏膜細胞系GES-1。由此我們推測，CAC1在胃癌細胞中表達水平高于胃正常細胞，可能在胃癌的形成過程中發(fā)揮一定作用。

有趣的是，胃癌細胞不同的P53狀態(tài)可能對CAC1表達無明顯影響。本研究所涉及的三個胃癌細胞系中，AGS為P53野生型，MGC803和BGC823均為P53突變型。雖然 AGS和 MGC803細胞的CAC1水平高于BGC823，但前兩者之間的CAC1表達水平無明顯差異。

此前的研究中檢測了66例結(jié)直腸癌組織及相應的遠端正常結(jié)直腸組織中CAC1的表達情況:CAC1主要表達于腫瘤細胞，在間質(zhì)細胞也有少量表達;正常結(jié)直腸組織中CAC1主要表達于黏膜上皮細胞，間質(zhì)細胞也有少量表達;統(tǒng)計學分析提示，CAC1的表達與結(jié)直腸癌的病理類型及臨床分期有關，與患者年齡、腫瘤部位及轉(zhuǎn)移等因素無關［7］。

本研究采用原位雜交法，檢測了35例胃癌患者的癌組織及相應的胃正常組織中CAC1的mRNA表達情況。結(jié)果顯示，CAC1在胃癌組織中主要表達于腫瘤細胞的胞質(zhì)，在相應的胃正常組織中表達水平較癌組織中顯著降低。統(tǒng)計學分析發(fā)現(xiàn):CAC1在胃癌組織中的表達高于胃正常組織;CAC1在胃癌組織中的陽性表達率與胃癌的臨床分期有關，隨著臨床分期的升高而增高，而與患者年齡、細胞分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等因素無關。以上結(jié)果與文獻報道的結(jié)直腸癌組織中CAC1表達特點非常相似。

原位雜交是本研究采用的主要技術之一，它雖與免疫組化技術有許多相似之處，但在組織切片的處理、探針制備、顯色方法等方面卻有其特殊之處。首先，組織的固定，應盡可能保存組織中的靶核酸成分和原有的組織結(jié)構。需要將內(nèi)源性核酸酶失活，避免其對靶核酸的降解，同時在原位雜交整個過程中避免外源性核酸酶的污染。其次，本實驗選用人工合成的單鏈寡核苷酸探針，特異性較高，分子量小，與相同量的雙鏈DNA探針相比，具有更高的摩爾濃度;用地高辛標記探針后，再用相應的原位雜交檢測試劑盒檢測與靶分子結(jié)合后的地高辛標記。再次，建立合適的雜交條件，注意雜交液及切片變性時的實際溫度能否達到所要求的溫度，變性后要馬上進行雜交反應，不然解鏈的DNA又會重新復性。最后，原位雜交結(jié)果的顯示應體現(xiàn)特異性和敏感性。除探針的選擇應通過鑒定外，必須在每一次試驗中選擇陽性或陰性對照。陽性對照可選擇Northern/Southern印記雜交或用不同互補探針與靶核酸雜交。陰性對照可選擇雜交前用RNA酶或DNA酶消化處理切片。

由于目前難以獲得商品化的高度純化的特異性CAC1抗體，故研究中沒有用免疫組化技術去驗證原位雜交實驗的結(jié)果。不過，之前有關結(jié)直腸癌的研究中對比了原位雜交法和免疫組化法檢測CAC1的表達結(jié)果，二者具有良好的一致性［7］。

根據(jù)實時定量PCR對不同胃癌細胞系和胃黏膜細胞系中CAC1表達水平的檢測，結(jié)合組織原位雜交的結(jié)果，可以看出，CAC1在胃癌組織和胃癌細胞系中的表達水平均明顯高于相應的胃正常組織和胃黏膜細胞系。因此，我們推測，CAC1對胃癌的某些生物學特性可能有一定影響，其表達升高可能有助于胃癌的形成和發(fā)展。

［1］Jemal A，Bray F，Center MM，et al．Global cancer statistics［J］．CA Cancer J Clin，2011，61(2):69-90．

［2］Bertuccio P，Chatenoud L，Levi F，et al．Recent patterns in gastric cancer:a global overview［J］．Int J Cancer，2009，125(3):666-673．

［3］Power DG，Kelsen DP，Shah MA．Advanced gastric cancer-slow but steady progress［J］．Cancer Treat Rev，2010，36(5):384-392．

［4］Panani AD．Cytogenetic and molecular aspects of gastric cancer:clinical implications［J］．Cancer Lett，2008，266(2):99-115．

［5］Cardozo T，Pagano M．The SCF ubiquitin ligase:insights into a molecular machine［J］．Nat Rev Mol Cell Biol，2004，5(9):739-751．

［6］Lee J，Zhou P．Cullins and cancer［J］．Genes Cancer，2010，1(7):690-699．

［7］Kong Y，Nan K，Yin Y．Identification and characterization of CAC1 as a novel CDK2-associated cullin［J］．Cell Cycle，2009，8(21):3544-3553．