HBx和c-Src對(duì)肝癌細(xì)胞HepG2上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的介導(dǎo)作用及其分子機(jī)制

呂高波，趙 陽(yáng)(寶雞市中心醫(yī)院肛腸外科，寶雞 7000;西安交通大學(xué)第二附屬醫(yī)院腫瘤科;通訊作者，E-mail:bluejackie@stu．xjtu．edu．cn)

最近幾年，越來(lái)越多的研究結(jié)果表明乙肝病毒的感染與肝細(xì)胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［1］，但是乙肝病毒促進(jìn)HCC的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移機(jī)制目前研究尚不清楚。乙肝病毒基因組有四種不同的開(kāi)放閱讀框架，X基因所編碼的蛋白HBx與HCC發(fā)生和發(fā)展關(guān)系最為密切，HBx蛋白在HCC組織中的陽(yáng)性率高達(dá)71．8%［2］。HBx本身是一種多功能蛋白，它具有促進(jìn)正常肝細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化的作用，探明HBx對(duì)HCC侵襲轉(zhuǎn)移功能的影響機(jī)制具有十分重要的臨床及科學(xué)價(jià)值。伴隨著研究的深入，越來(lái)越多的HBx相關(guān)信號(hào)分子被發(fā)現(xiàn)，癌基因c-Src也被證明能夠被HBx所活化，而c-Src是重要的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)調(diào)控因子［3］。針對(duì) HBx的促侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，本研究通過(guò)干預(yù)HBx的表達(dá)以及應(yīng)用c-Src抑制劑觀察其對(duì)肝癌細(xì)胞EMT的影響。

1 材料與方法

1．1 抗體和試劑

小鼠抗HBx單克隆抗體購(gòu)自US Biological Biotechnology，小鼠抗 Vimentin，E-cadherin 和 β-catenin單克隆抗體均購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology，小鼠抗N-cadherin單克隆抗體購(gòu)自Sigma公司，兔抗c-Src多克隆抗體購(gòu)自 Calbiochem Biotechnology。C-Src特異性抑制劑PP2及其陰性對(duì)照PP3購(gòu)自Calbiochem Biotechnology。

1．2 細(xì)胞系和細(xì)胞培養(yǎng)

HepG2—人類HCC細(xì)胞系(人乙肝病毒基因陰性)購(gòu)自北京細(xì)胞中心(北京大學(xué)生物醫(yī)學(xué)中心)，HepG2細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基中，培養(yǎng)基包含100 ml/L的胎牛血清(Sigma)、100 U/ml青霉素和100 μg/ml鏈霉素，培養(yǎng)箱內(nèi)溫度維持在37℃，CO2含量為50 ml/L。

1．3 腺病毒載體的構(gòu)建

腺病毒包裝試劑盒購(gòu)自Bioscience公司，依據(jù)試劑盒操作指南，我們構(gòu)建了表達(dá)HBx的腺病毒載體。HBx基因首先被插入到腺病毒包裝質(zhì)粒pAdTrack-CMV上，從而構(gòu)建了重組腺病毒質(zhì)粒pAdTrack-CMVHBx，PmeI公司對(duì) pAdTrack-CMV-HBx質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序，證實(shí)質(zhì)粒重組成功。pAdTrack-CMV-HBx轉(zhuǎn)染進(jìn)入BJ5183細(xì)胞，在BJ5183細(xì)胞中，pAdTrack-CMVHBx與pAdEasy-1進(jìn)行同源重組，重組后再次測(cè)序，證實(shí)重組成功。將重組的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染進(jìn)入293N細(xì)胞，包裝成腺病毒，腺病毒經(jīng)過(guò)純化后，收集并保存于-80℃待用。對(duì)照腺病毒載體(Mock)的合成方式與HBx腺病毒載體合成方式相同。

1．4 轉(zhuǎn)染及細(xì)胞處理

HepG2細(xì)胞置于6孔板中培養(yǎng)，孵育24 h，使用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋純化的腺病毒，將不同稀釋濃度的腺病毒與細(xì)胞共孵育2 h，使用含血清培養(yǎng)基替換無(wú)血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)HepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后的HepG2細(xì)胞在37℃，50 ml/L CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7 d，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)目標(biāo)蛋白的表達(dá)。為了探索c-Src對(duì)EMT的影響，我們選擇 c-Src特異性抑制劑PP210 μg/ml處理 HepG2細(xì)胞24 h，觀察細(xì)胞內(nèi)EMT相關(guān)信號(hào)分子的表達(dá)變化，應(yīng)用PP3 10 μg/ml作為陰性對(duì)照。

1．5 免疫組化

將HepG2細(xì)胞置于蓋玻片上，爬片生長(zhǎng)24 h，用100%丙酮或者100%乙醇和100%丙酮1:1混合液20 ℃固定細(xì)胞 20 min，應(yīng)用抗 HBx(1∶100)，E-cadherin(1∶100)、β-catenin(1∶100)、N-cadherin(1∶100)和vimentin(1∶100)一抗，于4℃孵育細(xì)胞過(guò)夜，PBS沖洗蓋玻片5 min×3次，應(yīng)用生物素標(biāo)記的二抗于37℃孵育30 min，PBS沖洗蓋玻片5 min×3次，顯色劑DAB顯色20 min，自來(lái)水沖洗終止反應(yīng)，之后，蘇木素復(fù)染1 min，自來(lái)水沖洗30 s，封片保存并拍照。

圖1 HBx對(duì)HepG2細(xì)胞形態(tài)的影響Figure 1 Effect of HBx on the morphology of HepG2 cells

1．6 Western blot檢測(cè)

HepG2細(xì)胞應(yīng)用含100 ml/L胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至90%融合，細(xì)胞裂解液裂解細(xì)胞，收集細(xì)胞裂解液，應(yīng)用BCA試劑盒(購(gòu)自Pierce Chemical公司)檢測(cè)蛋白濃度，記錄不同蛋白濃度，蛋白樣本煮沸15 min，使其變性，于-20℃保存。根據(jù)蛋白濃度調(diào)整上樣量，保證上樣蛋白量一致，經(jīng)過(guò)SDS-PAGE電泳，蛋白印跡轉(zhuǎn)至NC膜(Millipore公司)上。NC膜于50 g/L脫脂牛奶中4℃孵育過(guò)夜，特異性一抗(anti-E-cadherin 1∶1 000，124 kD;anti-βcatenin 1∶1 000，92 kD;anti-N-cadherin 1∶1 000，130 kD;anti-vimentin 1∶1 000 58 kD;1∶1 000;anti-HBx 1∶1 000，17 kD)室溫孵育 NC 膜 2 h，TBST 洗膜 5 min×3次，室溫孵育辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗2 h，TBST洗膜 5 min×3次，顯色液(購(gòu)自 Pierce Chemical公司)顯色，壓片定影后拍照，計(jì)算灰度值。

1．7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2．1 HBx可以改變HepG2細(xì)胞的形態(tài)

HBx腺病毒載體的轉(zhuǎn)染提高了HepG2細(xì)胞中的HBx表達(dá)水平，相比較轉(zhuǎn)染對(duì)照腺病毒的HepG2細(xì)胞，外源性HBx轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，細(xì)胞展現(xiàn)出了成纖維細(xì)胞樣形態(tài)變化，細(xì)胞呈梭形，軸向伸展延長(zhǎng)，與周圍細(xì)胞松散分布(見(jiàn)圖1)。

2．2 HBx對(duì)HepG2細(xì)胞EMT標(biāo)志物的影響

為了探索HBx與EMT之間的相關(guān)性，我們觀察了上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin和β-catenin，間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志N-cadherin和Vimentin的表達(dá)。外源性HBx蛋白表達(dá)上調(diào)，顯著上調(diào)了上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)了間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志N-cadherin和Vimentin的表達(dá)(圖2)，這些結(jié)果符合EMT改變。

圖2 HBx介導(dǎo)HepG2細(xì)胞EMT標(biāo)志物的表達(dá)Figure 2 HBx induces epithelial and mesenchymal markers expression in HepG2 cells

我們進(jìn)一步應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法觀察了上皮細(xì)胞及間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物在HepG2細(xì)胞中的表達(dá)特點(diǎn)，E-cadherin呈現(xiàn)為近膜分布，N-cadherin和Vimentin為細(xì)胞質(zhì)分布，β-catenin在HBx轉(zhuǎn)染的細(xì)胞胞質(zhì)和胞核中均有分布，在對(duì)照細(xì)胞中β-catenin集中分布在細(xì)胞質(zhì)中。HBx顯著改變了HepG2細(xì)胞的形態(tài)，呈現(xiàn)出了松散分布和梭形改變的特點(diǎn)，下調(diào)了上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin表達(dá)，上調(diào)了間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin(見(jiàn)圖3)。

圖3 免疫組化檢測(cè)HBx對(duì)HepG2細(xì)胞EMT標(biāo)志物的表達(dá)Figure 3 EMT markers expression in HepG2 cells by immunohistochemistry

2．3 c-Src抑制劑阻斷HBx介導(dǎo)的HepG2細(xì)胞形態(tài)改變

為進(jìn)一步探索c-Src活性對(duì)HBx介導(dǎo)的EMT改變的影響，我們應(yīng)用c-Src特異性抑制劑PP2處理HBx轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞，應(yīng)用PP3作為PP2的陰性對(duì)照。PP2處理的HBx轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞失去了梭形形態(tài)，細(xì)胞間的連接緊密，而PP3處理的HBx轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞未見(jiàn)明顯的細(xì)胞形態(tài)改變(見(jiàn)圖4)，c-Src特異性抑制劑逆轉(zhuǎn)了HBx介導(dǎo)的HepG2細(xì)胞的EMT改變。

圖4 PP2抑制HBx介導(dǎo)的HepG2細(xì)胞形態(tài)改變Figure 4 PP2 inhibits the HBx-induced morphologic changes of HepG2 cells

2．4 c-Src抑制劑阻斷 HBx介導(dǎo)的 HepG2細(xì)胞EMT標(biāo)志分子表達(dá)改變

基于以上的形態(tài)觀察，我們更進(jìn)一步探索了PP2對(duì)HBx轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中EMT標(biāo)志物的表達(dá)情況。與之前的觀察結(jié)果類似，在HBx轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞中，PP2恢復(fù)了上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin的表達(dá)，下調(diào)了間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志N-cadherin和Vimentin的表達(dá)，而PP3并未對(duì)E-cadherin，N-cadherin和Vimentin的表達(dá)產(chǎn)生影響(見(jiàn)圖5)。免疫組化的觀察也支持PP2對(duì)HBx介導(dǎo)的EMT信號(hào)通路的阻斷作用，同時(shí)PP2的應(yīng)用顯著破壞了β-catenin的胞核分布(見(jiàn)圖6)。

圖5 PP2抑制HBx轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞EMTFigure 5 PP2 inhibits HBx-induced EMT in HepG2 cells

圖6 免疫組化檢測(cè)PP2和PP3對(duì)HBx轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞EMT標(biāo)志物表達(dá)Figure 6 EMT markers expression in HepG2 cells treated by PP2 or PP3 by immunohistochemistry

3 討論

在眾多惡性腫瘤促侵襲轉(zhuǎn)移的機(jī)制當(dāng)中，EMT是近期的研究熱點(diǎn)。EMT主要的功能特點(diǎn)是使惡性腫瘤細(xì)胞失去上皮細(xì)胞功能，而展現(xiàn)間質(zhì)細(xì)胞的功能，功能改變導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞間連接趨于松散，細(xì)胞骨架進(jìn)行重組，細(xì)胞形態(tài)呈現(xiàn)出成纖維細(xì)胞樣改變，這一系列改變導(dǎo)致惡性腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力增強(qiáng)［3，4］。在分子水平上，EMT的主要特征是上皮細(xì)胞標(biāo)志物—E-cadherin等表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物—N-cadherin，Vimentin等表達(dá)上調(diào)［3，4］。

在我們的研究當(dāng)中，肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞展現(xiàn)出了典型的上皮細(xì)胞形態(tài)特點(diǎn)，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx基因的HepG2細(xì)胞形態(tài)發(fā)生了明顯的改變，呈現(xiàn)出了梭形改變，類似成纖維細(xì)胞，細(xì)胞與細(xì)胞之間的連接松散，這些觀察表明外源性HBx基因轉(zhuǎn)染介導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生EMT形態(tài)改變。進(jìn)一步Western blot和免疫組化結(jié)果表明:HBx基因轉(zhuǎn)染導(dǎo)致上皮細(xì)胞標(biāo)志E-cadherin表達(dá)下調(diào)，而間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志N-cadherin和Vimentin表達(dá)上調(diào)，這些結(jié)果進(jìn)一步支持了HBx具有介導(dǎo)HepG2細(xì)胞EMT改變的重要作用。EMT標(biāo)志物表達(dá)的改變也被稱為“cadherin開(kāi)關(guān)效應(yīng)”，這種cadherin開(kāi)關(guān)效應(yīng)最初被Tomita等在前列腺癌中觀察到，E-cadherin下調(diào)是EMT的標(biāo)志改變［5］。

E-cadherin在維持上皮細(xì)胞表型和同源細(xì)胞間的黏附功能至關(guān)重要，在多種惡性腫瘤細(xì)胞系中，E-cadherin表達(dá)下調(diào)有效地上調(diào)了細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力［6］，另一方面，E-cadherin表達(dá)下調(diào)間接促進(jìn)了其他類型 cadherin表達(dá)，如 N-cadherin，N-cadherin表達(dá)上調(diào)增加了細(xì)胞的遷移能力，促進(jìn)了細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞、細(xì)胞與細(xì)胞外基質(zhì)間的新黏附結(jié)構(gòu)形成，從E-cadherin到N-cadherin改變有效促進(jìn)了惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移和血管侵犯［7，8］。

我們的免疫組化結(jié)果表明，HBx基因轉(zhuǎn)染的HepG2細(xì)胞呈現(xiàn)了EMT改變，同時(shí)，β-catenin在其胞質(zhì)和胞核中均有較高水平的表達(dá)，對(duì)照細(xì)胞中，βcatenin主要分布在近細(xì)胞膜處。這些結(jié)果與之前的報(bào)道類似［9］，說(shuō)明β-catenin在EMT中發(fā)揮了轉(zhuǎn)錄因子作用。在Wnt信號(hào)通路中，已經(jīng)證實(shí)伴隨E-cadherin表達(dá)下調(diào)，β-catenin發(fā)生細(xì)胞質(zhì)到細(xì)胞核的定位改變，在細(xì)胞核中，β-catenin發(fā)揮了轉(zhuǎn)錄因子的作用，上調(diào)了N-cadherin和vimentin表達(dá)，導(dǎo)致EMT 的發(fā)生［9，10］。

c-Src是細(xì)胞內(nèi)具有重要功能的一個(gè)非受體酪氨酸激酶，c-Src活性升高能夠顯著增強(qiáng)多種惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移，其促侵襲轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制十分復(fù)雜［11］。c-Src能夠通過(guò)活化 Ras/Raf-1/MAPK信號(hào)通路減弱細(xì)胞間的黏附作用，促進(jìn)惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移［12］，另一方面，c-Src可以在近細(xì)胞膜處活化小分子GTP酶，導(dǎo)致細(xì)胞骨架重組，增強(qiáng)了惡性腫瘤細(xì)胞的遷移能力［13］。近期的研究結(jié)果表明，c-Src可以磷酸化E-cadherin，導(dǎo)致 E-cadherin泛素化降解，介導(dǎo)EMT改變發(fā)生［14］。我們的研究結(jié)果進(jìn)一步支持了c-Src對(duì)肝癌HepG2細(xì)胞EMT具有重要的促進(jìn)作用。

本研究結(jié)果表明，HBx基因轉(zhuǎn)染顯著提高了HepG2細(xì)胞的c-Src活性，在應(yīng)用c-Src特異性抑制劑PP2作用于轉(zhuǎn)染HBx基因的HepG2細(xì)胞后，EMT改變被有效的逆轉(zhuǎn)，細(xì)胞形態(tài)恢復(fù)上皮樣改變，E-cadherin表達(dá)恢復(fù)，N-cadherin和Vimentin表達(dá)下調(diào)，β-catenin細(xì)胞核表達(dá)顯著減少，這些結(jié)果表明c-Src在惡性腫瘤細(xì)胞EMT中發(fā)揮了重要的作用。由于c-Src相關(guān)信號(hào)分子十分復(fù)雜，由此推測(cè)不同信號(hào)分子間可能存在cross-talk，最終介導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞的EMT發(fā)生。

4 結(jié)論

HBx基因的轉(zhuǎn)染導(dǎo)致肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞發(fā)生EMT改變，c-Src分子在HBx介導(dǎo)的EMT改變中發(fā)揮了至關(guān)重要的作用，更進(jìn)一步的分子機(jī)制的探索對(duì)于揭示更深層的EMT改變是必要的，EMT分子機(jī)制的明確將為控制惡性腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移提供新的思考。

［1］Kubo S，Takemura S，Tanaka S，et al．Management of hepatitis B virus infection during treatment for hepatitis B virus-related hepatocellular carcinoma［J］．World J Gastroenterol，2015，21(27):8249-8255．

［2］Chan CF，Yau TO，Jin DY，et al．Hepatitis B virus X protein(HBx)is responsible for resistance to targeted therapies in hepatocellular carcinoma:ex vivo culture evidence［J］．Clin Cancer Res，2015，21(5):8140-8149．

［3］Zheng H，Kang Y．Multilayer control of the EMT master regulators［J］．Oncogene，2014，33(14):1755-1763．

［4］Puisieux A，Brabletz T，Caramel J．Oncogenic roles of EMT-inducing transcription factors［J］．Nat Cell Biol，2014，16(8):488-494．

［5］van Roy F．Beyond E-cadherin:roles of other cadherin superfamily members in cancer［J］．Nat Rev Cancer，2014，14(2):121-134．

［6］Lecuit T，Yap AS．E-cadherin junctions as active mechanical integrators in tissue dynamics［J］．Nat Cell Biol，2015，17(5):533-539．

［7］Radice GL．N-cadherin-mediated adhesion and signaling from development to disease:lessons from mice［J］．Prog Mol Biol Transl Sci，2013，116:263-289．

［8］Wang F，Li XK，Xu HY，et al．N-cadherin participated in invasion and metastasis of human esophageal squamous cell carcinoma via taking part in the formation of vasculogenic mimicry［J］．Med Oncol，2015，32(2):480．

［9］Liu J，Lian Z，Han S，et al．Downregulation of E-cadherin by hepatitis B virus X antigen in hepatocellular carcinoma［J］．Oncogene，2006，25(7)1008-1017．

［10］Fernandez-Sanchez ME，Barbier S，Whitehead J，et al．Mechanical induction of the tumorigenic beta-catenin pathway by tumour growth pressure［J］．Nature，2015，523(7558):92-95．

［11］Bordoli MR，Yum J，Breitkopf SB，et al．A secreted tyrosine kinase acts in the extracellular environment［J］．Cell，2014，158(5):1033-1044．

［12］McLachlan RW，Kraemer A，Helwani FM，et al．E-cadherin adhesion activates c-Src signaling at cell-cell contacts［J］．Mol Biol Cell，2007，18(8):3214-3223．

［13］Frame MC．V-SRC informs integrin signaling［J］．Nat Rev Mol Cell Biol，2013，14(9):548．

［14］Wilson C，Nicholes K，Bustos D，et al．Overcoming EMT-associated resistance to anti-cancer drugs via Src/FAK pathway inhibition［J］．Oncotarget，2015，5(17):7328-7341．