不同放牧強(qiáng)度下溫性草甸草原土壤微生物群落結(jié)構(gòu)PLFAs分析

譚紅妍，閆瑞瑞，閆玉春，陳寶瑞，辛?xí)云剑?/p>

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院資源區(qū)劃所，北京100081；2.呼倫貝爾草原生態(tài)系統(tǒng)國(guó)家野外科學(xué)觀測(cè)研究站，北京100081）

土壤微生物群落是草地地下生態(tài)系統(tǒng)的重要組成成分，其不僅是土壤養(yǎng)分重要的“源”和“庫(kù)”，而且介導(dǎo)許多控制碳氮循環(huán)的關(guān)鍵過(guò)程，在草地生態(tài)系統(tǒng)過(guò)程和功能的維持中扮演著至關(guān)重要的角色［1－2］。微生物生命周期短，對(duì)生存的微環(huán)境十分敏感，土壤微生物群落成為判別干擾條件下土壤生態(tài)系統(tǒng)狀態(tài)的重要生物學(xué)指標(biāo)。脂類物質(zhì)是構(gòu)成活體微生物細(xì)胞膜的主要成分，它在細(xì)胞中含量穩(wěn)定約占細(xì)胞干重的5%，PLFA即為甲基化土壤中提取磷脂成分后得到的脂肪酸產(chǎn)物［3］。不同的微生物通過(guò)不同的代謝途徑形成不同的PLFA，可以作為一種生物標(biāo)記來(lái)鑒定土壤中微生物的種類和豐富度。近年來(lái)，PLFA技術(shù)以其快速、準(zhǔn)確、重現(xiàn)性好、對(duì)試驗(yàn)條件要求較低等優(yōu)點(diǎn)［4］，被廣泛用于土壤中微生物群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

放牧是草地的主要利用方式之一，對(duì)土壤微生物乃至整個(gè)土壤生態(tài)系統(tǒng)都有深遠(yuǎn)影響。適度放牧有助于土壤微生物數(shù)量的增加，過(guò)度放牧?xí)?dǎo)致微生物數(shù)量明顯減少；真菌和細(xì)菌對(duì)放牧強(qiáng)度的響應(yīng)比放線菌更為敏感［5－6］，隨著放牧強(qiáng)度的增加，真菌、細(xì)菌數(shù)量顯著下降，放線菌數(shù)量升高。趙帥等［7］發(fā)現(xiàn)放牧干擾下土壤微生物的PLFAs種類發(fā)生改變，細(xì)菌與真菌PLFAs比值顯著升高，革蘭氏陽(yáng)性菌與陰性菌PLFAs含量比值顯著下降。Clegg［8］對(duì)英格蘭西南一草地研究發(fā)現(xiàn)，放牧可以顯著提高革蘭氏陽(yáng)性菌和陰性菌的PLFAs含量，放線菌與真菌的指示性PLFAs變化不顯著。而Ingram等［9］在美國(guó)懷俄明州北部的一個(gè)半干旱混合草地研究不同放牧強(qiáng)度對(duì)微生物群落結(jié)構(gòu)的影響時(shí)發(fā)現(xiàn)，不同處理并沒(méi)有使表征各微生物類群 的PLFAs含量發(fā)生顯著變化，在輕度放牧區(qū)總PLFAs含量略高。

放牧對(duì)地上植被的影響研究的報(bào)道較多，對(duì)土壤性狀影響的研究也有一些報(bào)道，但大多數(shù)的研究?jī)?nèi)容都局限在土壤三大類群微生物（細(xì)菌、真菌、放線菌）的數(shù)量、土壤酶活性等研究上。本研究立足于呼倫貝爾草原連續(xù)5年的肉牛控制放牧樣地，采用磷脂脂肪酸技術(shù)研究不同放牧強(qiáng)度對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響，旨在揭示長(zhǎng)期放牧下土壤微生物多樣性及群落結(jié)構(gòu)的演變狀況，為深入了解放牧系統(tǒng)地下生態(tài)學(xué)過(guò)程、合理利用草地資源提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)概況

本研究在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院呼倫貝爾草地生態(tài)系統(tǒng)試驗(yàn)站的肉?？刂品拍翗拥刂羞M(jìn)行。研究點(diǎn)位于呼倫貝爾市謝爾塔拉牧場(chǎng)場(chǎng)部東3km，屬于大興安嶺西麓丘陵向內(nèi)蒙古高原的過(guò)渡區(qū)，地理位置為49°32′－49°34′N(xiāo)，119°94′－119°96′E，海拔670～677m。研究區(qū)屬于溫帶半干旱大陸性氣候，年均溫－3～1℃，≥10℃年積溫1580～1800℃，無(wú)霜期110d左右，年平均降水量350～400mm，降水期多集中在7－9月。土壤為暗栗鈣土。植被類型為羊草＋雜草類，主要物種有羊草（Leymuschinensis）、裂葉蒿（Artemisiaincise）、苔草（Carextristachva）、貝加爾針茅（Stipabaicalensis）、展枝唐松草（Thalictrumsquarrosum）、日蔭菅（Carexpediformis）、蓬子菜（Galiumverum）、麻花頭（Serratulacentauroides）等，伴生種有狹葉柴胡（Bupleurumscorzonerifolium）、斜莖黃芪（Astragalusadsuigens）、山野豌豆（Viciaamoena）、草地早熟禾（Poapratensis）等。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

放牧樣地共存在6個(gè)水平的放牧梯度處理，載畜率分別為 G0.00：0.00Au／hm2、G0.23：0.23Au／hm2、G0.34：0.34Au／hm2、G0.46：0.46Au／hm2、G0.69：0.69Au／hm2、G0.92：0.92Au／hm2。其中以500kg肉牛為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)家畜肉牛單位，用250～300kg的放牧肉牛頭數(shù)來(lái)控制不同的放牧強(qiáng)度，6個(gè)放牧梯度肉牛頭數(shù)分別為0，2，3，4，6，8頭，共用69頭肉牛。每種處理3個(gè)重復(fù)，共包括15個(gè)放牧區(qū)和3個(gè)對(duì)照封育區(qū)。各處理的分布遵循隨機(jī)區(qū)組試驗(yàn)設(shè)計(jì)原則，每個(gè)小區(qū)為300m×160m，試驗(yàn)區(qū)總面積90hm2（包括牧道），具體設(shè)計(jì)見(jiàn)圖1。從2009年開(kāi)始，每年6月中旬開(kāi)始放牧，10月中旬結(jié)束，為期120d。整個(gè)放牧期肉牛日夜均在放牧區(qū)，肉牛飲水通過(guò)拉水供應(yīng)。

本項(xiàng)研究中選取了4個(gè)放牧強(qiáng)度：對(duì)照區(qū)G0.00、輕度放牧 G0.23、中度放牧 G0.46、重度放牧 G0.92，野外采樣時(shí)間為2013年08月15日至19日。每個(gè)試驗(yàn)小區(qū)隨機(jī)設(shè)置3個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)用直徑5cm的土鉆取0～20cm土壤（3點(diǎn)混合），剔除石塊和土壤中的動(dòng)植物殘?bào)w后，采用“四分法”保留約500g土樣。一部分土樣帶回實(shí)驗(yàn)室后立即過(guò)2mm篩保存于－80℃超低溫冰箱；另一部分土樣自然風(fēng)干，用于測(cè)定土壤基本養(yǎng)分。

圖1 肉牛不同放牧強(qiáng)度試驗(yàn)平面圖Fig.1 Design diagram of cattle different grazing gradients

表1 估算微生物生物量的脂肪酸Table 1 PLFA for calculating soil microbial biomass

1.3 分析指標(biāo)與方法

1.3.1 土壤磷脂脂肪酸提取與分析 將置于超低溫冰箱中的土樣放入超低溫冷凍干燥機(jī)中處理后，取3.00g左右的凍干土，利用Blight／Dyer法通過(guò)氯仿－甲醇－檸檬酸緩沖液震蕩提取總脂，經(jīng)SPE柱層析分離得到磷脂脂肪酸；將得到的磷脂脂肪酸甲酯化。PLFA的定性與定量分析用HP6890氣相色譜和Sherlock軟件，以正十九烷脂肪酸甲酯為內(nèi)標(biāo)物。各類群微生物標(biāo)記如表1所示。命名法采用X：YωZ，其中X是指主鏈碳原子個(gè)數(shù)；Y為雙鍵個(gè)數(shù)；Z為甲基鏈離雙鍵的位置。i，a，Me分別表示異構(gòu)、反異構(gòu)、甲基支鏈，cy表示環(huán)丙基。

1.3.2 土壤基本養(yǎng)分分析 土壤有機(jī)質(zhì)用重鉻酸鉀容量法—外加熱法進(jìn)行測(cè)定；全磷采用NaOH熔融－鉬銻抗比色法；全氮采用半微量凱氏定氮法；土壤pH采用電位法；速效磷采用0.5mol／L NaHCO3浸提－鉬銻抗比色法；速效鉀采用NH4OAC浸提－火焰光度法；堿解氮采用1.0mol／L NaOH堿解擴(kuò)散法［16］。

1.4 數(shù)據(jù)分析

微生物群落結(jié)構(gòu)用CANOCO 4.5中的除趨對(duì)應(yīng)分析（detrended correspondence analysis，DCA）并作圖。其余數(shù)據(jù)用SPSS 20.0分析，Excel作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同放牧強(qiáng)度下溫性草甸草原土壤中所含PLFA的特征

本實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)出44種磷脂脂肪酸生物標(biāo)記，其中G0.23處理下PLFA種類最多，G0.92處理下最少。不同放牧強(qiáng)度下土壤的PLFA種類存在明顯差異，比如15：0iso 3OH 與18：1 2OH 為 G0.23放牧處理所特有，16：1ω9c為G0.46放牧處理所特有。但4個(gè)放牧梯度下優(yōu)勢(shì)類群并未發(fā)生改變，均為16：00、16：0 10－methyl、18：1ω7c、19：0 cycloω8c，它們含量之和所占比例分別為36.06%，35.00%，36.84%，34.80%。表明不同放牧強(qiáng)度下磷脂脂肪酸組成改變，即放牧改變了土壤微生物的區(qū)系組成和豐富度，卻不會(huì)影響優(yōu)勢(shì)菌的地位（表2）。

2.2 不同放牧強(qiáng)度對(duì)土壤微生物各菌群生物量的影響

微生物區(qū)系組成中，細(xì)菌比例最高，其次為放線菌、真菌、AMF。不同放牧強(qiáng)度下，各大類微生物的特征標(biāo)記PLFAs含量發(fā)生了改變（圖2）。土壤總微生物量隨著放牧強(qiáng)度的增加表現(xiàn)為先減少后增加的趨勢(shì)，即為對(duì)照區(qū)最高，中度放牧G0.46最低，重度放牧G0.92出現(xiàn)小幅度的回升；細(xì)菌、革蘭氏陰性菌、腐生真菌、AMF生物量也呈現(xiàn)相同變化。革蘭氏陽(yáng)性菌、放線菌生物量則隨著放牧強(qiáng)度的增加而增加（表3）。此外，AMF對(duì)于放牧干擾最為敏感（各放牧強(qiáng)度下極顯著差異P＜0.01）。

表2 不同放牧強(qiáng)度下土壤微生物主要磷脂脂肪酸構(gòu)成特征（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）Table 2 The profiles of main PLFAs of microbes in soils from different grazed degrees（Mean±SE）nmol／g

2.3 不同放牧強(qiáng)度對(duì)土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

為了更直觀了解不同放牧強(qiáng)度下土壤微生物群落的分布格局，對(duì)36個(gè)土樣和主要的磷脂脂肪酸進(jìn)行排序，其中前兩個(gè)排序軸的特征值分別為0.526和0.167，累積貢獻(xiàn)率之和為78.3%。排序圖基本上能將4個(gè)放牧輕度的樣方區(qū)分開(kāi)，輕度放牧G0.23同對(duì)照區(qū)G0.00群落結(jié)構(gòu)較為相似，中度放牧G0.46同重度放牧G0.92群落結(jié)構(gòu)較為相似。表明當(dāng)放牧干擾超過(guò)某一強(qiáng)度時(shí)，會(huì)引起土壤微生物群落結(jié)構(gòu)大幅度的變化。

表3 不同放牧強(qiáng)度下土壤各微生物類群生物量（平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤）Table 3 The microbial groups PLFAs content from different grazed degrees（Mean±SE）nmol／g

圖3為主要磷脂脂肪酸在除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析中的因子載荷分析結(jié)果。第一排序軸上的載荷值較高的脂肪酸可以分為兩類，表征真菌的脂肪酸（18：2ω6、16：1ω5）和表征革蘭氏陰性菌的脂肪酸（17：1ω8、18：1ω9、18：1ω7），它們隨著放牧強(qiáng)度的增加而減少。表征革蘭氏陽(yáng)性菌的脂肪酸（a17：0、a15：0、i14：0、i15：0、i16：0）和表征放線菌的脂肪酸（10Me18：0、10Me17：0、10Me16：0）在兩排序軸載荷值都較低，說(shuō)明這幾種脂肪酸在中度放牧 G0.46含量最低。

2.4 各菌群PLFAs含量與土壤基本養(yǎng)分相關(guān)性分析

通過(guò)對(duì)各菌群PLFAs含量與土壤養(yǎng)分相關(guān)性分析表明（表4），土壤總PLFAs含量和細(xì)菌、真菌、革蘭氏陰性菌、叢枝菌根真菌的PLFAs含量均同有機(jī)質(zhì)、全磷、速效磷、速效鉀呈顯著正相關(guān)（P＜0.05），尤其是腐生真菌、叢枝菌根真菌的PLFAs與有機(jī)質(zhì)、速效磷相關(guān)水平達(dá)到了極顯著程度（P＜0.01）。由此說(shuō)明真菌和AMF可用作評(píng)價(jià)土壤肥力與健康的生物指標(biāo)，同時(shí)有機(jī)質(zhì)、速效磷是影響微生物數(shù)量和種類的重要養(yǎng)分因素。相關(guān)分析結(jié)果還顯示，革蘭氏陽(yáng)性菌、放線菌PLFAs含量同大多數(shù)養(yǎng)分指標(biāo)成負(fù)相關(guān)，各菌群PLFAs含量與全氮、堿解氮、pH間無(wú)顯著相關(guān)性。

圖2 不同放牧梯度下土壤微生物群落PLFA的除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析Fig.2 Detrended correspondence analysis of PLFA profiles from soil microbialcommunities of different grazed degrees

圖3 不同放牧梯度下土壤微生物群落PLFA載荷因子貢獻(xiàn)Fig.3 Eigenvector loadings of PLFA contributing to soil communities ordination pattern of different grazed degrees

表4 PLFAs與土壤養(yǎng)分相關(guān)性分析Table 4 Correlation between soil PLFAs content and soil nutrients

3 討論

放牧干擾既引起植物生產(chǎn)力的下降，也降低了植物多樣性。生產(chǎn)力下降導(dǎo)致地上的葉凋落物、地下死亡根系的凋落物和根系分泌物的減少，使得微生物可利用營(yíng)養(yǎng)物減少［17］，最終引起微生物數(shù)量的下降。物種多樣性降低會(huì)引起植物產(chǎn)物的改變和凋落物有機(jī)組分的變化［18－22］，從而影響微生物群落的組成和功能。與王啟蘭等［20］、Raiesi和Asadi［22］研究結(jié)果一致：隨著放牧壓力的增大，土壤總微生物顯著下降。放牧顯著降低了地上生物量和活根生物量，微生物分解底物減少。此外，植被蓋度的下降以及牲畜的過(guò)度踐踏，引起土壤的含水量、透水性和透氣性的下降［20］，土壤微環(huán)境遭到破壞，也會(huì)降低微生物的繁殖速率。

不同菌群微生物因自身生長(zhǎng)繁殖特性不同，對(duì)放牧干擾存在不同的響應(yīng)。革蘭氏陰性菌與腐生真菌生物量的下降，干擾的機(jī)制可能是：通過(guò)改變土壤環(huán)境來(lái)直接影響微生物生長(zhǎng)，比如有機(jī)質(zhì)含量、養(yǎng)分的有效性［2］，并且家畜活動(dòng)會(huì)嚴(yán)重破壞腐生真菌的菌絲。而在重度放牧G0.92中，革蘭氏陰性菌、真菌、AMF和總微生物量都出現(xiàn)小幅回升，原因可能在于不穩(wěn)定基質(zhì)（尿液與糞便）的輸入為微生物提供易利用的營(yíng)養(yǎng)元素，適當(dāng)?shù)卮龠M(jìn)微生物生長(zhǎng)［21］。此外，本研究中 AMF生物量在4個(gè)放牧強(qiáng)度下極顯著差異（P＜0.01）。Jansa等［23］和Schnoor等［24］曾采用PLFA技術(shù)研究不同微生物菌群對(duì)外界干擾響應(yīng)時(shí)也發(fā)現(xiàn)：AMF對(duì)干擾反映最為敏感。AMF與植物是共生關(guān)系，植物物種的變化對(duì)其影響最為顯著。羊草為該研究區(qū)的主要優(yōu)勢(shì)種，也是牲畜較為喜歡的牧草之一。牧壓的增加必然會(huì)引起羊草優(yōu)勢(shì)度的顯著下降，那么與羊草存在共生關(guān)系的AMF因菌絲結(jié)構(gòu)的破壞，其生物量定會(huì)顯著下降。有研究指出［24］，放牧干擾引起活根生物量的變化是影響微生物群落改變的主要原因，其中AMF為典型代表。隨放牧強(qiáng)度的增加，革蘭氏陽(yáng)性菌和放線菌生物量呈現(xiàn)出增加的趨勢(shì)，同多數(shù)文獻(xiàn)研究結(jié)果不太一致，有待于進(jìn)一步驗(yàn)證。Klumpp等［25］在尋找高強(qiáng)度放牧導(dǎo)致土壤碳丟失的原因時(shí)，指出高強(qiáng)度的干擾通過(guò)影響植物根系及由它們控制的微生物，加快了土壤中營(yíng)養(yǎng)元素的循環(huán)。是不是可以有這樣一種猜測(cè)：高強(qiáng)度放牧使得營(yíng)養(yǎng)循環(huán)效率提高的原因在于，革蘭氏陽(yáng)性菌和放線菌生物量的增加？

DCA分析結(jié)果表明，過(guò)度放牧?xí)鹜寥牢⑸锶郝浣Y(jié)構(gòu)的顯著改變。本研究中取土深度為0～20cm，微生物大部分屬于根際微生物［19］。微生物群落能夠利用的能源物質(zhì)主要為根際沉積物（根系分泌物、脫落根細(xì)胞、根殘?bào)w），不同植物根系沉積物元素組成差異很大［26］，最終引起異養(yǎng)微生物群落結(jié)構(gòu)和功能的變化。當(dāng)存在外部干擾時(shí)，植物將更多的營(yíng)養(yǎng)元素分配給地下部分，根系各種元素的相對(duì)含量也會(huì)發(fā)生變化［27］。有機(jī)質(zhì)、速效磷與微生物菌群極顯著正相關(guān)，是微生物生長(zhǎng)和活性的主要營(yíng)養(yǎng)因子，可能植物本身碳、磷含量是影響微生物種類和數(shù)量的生物因素。

4 結(jié)論

放牧改變了土壤微生物的組成，但不影響功能菌的優(yōu)勢(shì)地位。土壤總微生物量隨著放牧強(qiáng)度的增加表現(xiàn)為先減少后增加的趨勢(shì)，即為對(duì)照區(qū)最高，中度放牧最低，重度放牧出現(xiàn)小幅度的回升；細(xì)菌、革蘭氏陰性菌、腐生真菌、AMF生物量也呈現(xiàn)相同變化。革蘭氏陽(yáng)性菌、放線菌生物量則隨著放牧強(qiáng)度的增加而增加。此外，AMF對(duì)于放牧干擾最為敏感（各放牧強(qiáng)度下極顯著差異P＜0.01）。除趨勢(shì)對(duì)應(yīng)分析結(jié)果表明，對(duì)照區(qū)和輕度放牧處理下土壤的微生物群落結(jié)構(gòu)較為相似，中度放牧和重度放牧處理導(dǎo)致微生物群落結(jié)構(gòu)發(fā)生大幅度改變。有機(jī)質(zhì)、速效磷是影響微生物種類和數(shù)量的重要養(yǎng)分因素。

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