外源H2O2對沙打旺抗黃矮根腐病的影響

黃貝梅，南志標(biāo)，張志新

（草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點實驗室，蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，甘肅 蘭州730020）

沙打旺（Astragalusadsurgens）為多年生豆科牧草，主要分布于我國北方，其產(chǎn)量高、營養(yǎng)豐富、適應(yīng)性廣、抗逆性強，在畜牧業(yè)生產(chǎn)中具有重要地位［1］。病害是造成沙打旺衰退的主要原因之一，其引致牧草產(chǎn)量減少、品質(zhì)下降，草地壽命與利用年限縮短［2－3］。Li和Nan［4］首次報道了沙打旺黃矮根腐病，其病原物為埃里磚格孢（Embellisiaastragalisp.），該病菌可以引起植物矮化，莖稈變黃，根部腐爛，極大地降低了沙打旺的產(chǎn)量、縮短了其利用年限。俞斌華［5］以采集于6個省市的10個沙打旺品種為研究對象，研究了其對黃矮根腐病的抗性評價，并將陜西榆林、中沙一號劃分為抗病品種，內(nèi)蒙早熟、寧夏彭陽劃分為感病品種。

H2O2是生物體內(nèi)重要的活性氧分子和信號分子，通過超氧化物在電子傳遞過程中產(chǎn)生或在外界因素激發(fā)下產(chǎn)生，參與植物的基因表達、防御反應(yīng)和細(xì)胞凋亡等生理過程［6－9］。有研究表明，植物受到逆境脅迫時會通過信號轉(zhuǎn)導(dǎo)過程促進自身防衛(wèi)基因的表達，形成防御酶系，從而提高植物的抗性［10－15］。目前，關(guān)于H2O2是否能夠提高沙打旺抵抗黃矮根腐病的能力，其作用機理如何等問題尚未見報道。Patykowski和Urbanek［10］發(fā)現(xiàn)2個抗病性不同的番茄（Lycopersiconesculentum）品種在受到灰霉病菌（Botrytiscinerea）侵染后均能檢測到 H2O2含量升高，并且抗病品種較感病品種出現(xiàn)的早、生成量更高。外源H2O2處理能夠誘導(dǎo)抗病和防御相關(guān)基因的表達，提高植物的抗病性［11］。外源H2O2能降低葡萄霜霉病造成的危害，而H2O2清除劑AsA（抗壞血酸）增加了其危害［16］。

目前，關(guān)于H2O2是否能夠提高沙打旺抵抗黃矮根腐病的能力，其作用機理如何等問題尚未見報道。因此，本試驗以抗病品種陜西榆林和感病品種寧夏彭陽為研究材料，接種埃里磚格孢，檢測受到病原菌侵染后沙打旺葉片H2O2含量的變化，并測定外源H2O2對發(fā)病率、病情指數(shù)和病程相關(guān)蛋白酶活性影響。以期闡明H2O2對沙打旺黃矮根腐病的作用機理，為外源H2O2應(yīng)用于提高植物抗病性研究提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試的沙打旺為抗病品種陜西榆林和感病品種寧夏彭陽，種子由俞斌華提供，保存在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院種子庫中（4℃）。供試菌株為黃矮根腐病菌（Embellisiaastragali），采自甘肅省環(huán)縣草地畜牧業(yè)綜合試驗場沙打旺發(fā)病莖稈。盆栽于蘭州大學(xué)榆中智能溫室。供試土壤為營養(yǎng)土與黃綿土1∶1混合，經(jīng)169℃滅菌6h［17］后裝入經(jīng)0.2%高錳酸鉀消毒塑料盆內(nèi)，每盆2kg，塑料盆規(guī)格為15cm×15cm（直徑×高）。

1.2 試驗處理

2012年4月20日播種，出苗后選擇長勢一致的壯苗，每盆定苗4株，每處理6盆。于定苗后90d，用噴霧法將埃里磚格孢懸浮液（1×105個／mL）接種在沙打旺植株上，以無菌水為對照，然后用經(jīng)實驗室中測定對孢子萌發(fā)沒有影響的 H2O2（0.1%）和 AsA（0.2mmol／L）處理，每個處理重復(fù)4次。分別于處理后0，1，3，5，7，9d取植株中間部位葉片帶回實驗室以檢測酶活性，1個月后統(tǒng)計發(fā)病率，計算病情指數(shù)。

其他試驗條件保持一致（溫度白天25℃，夜間20℃，14h光照10h黑暗交替、光照8000～10000lx，相對濕度65%）。每隔1周重新排列各試驗盆的位置，以消除不同位置光照條件、通風(fēng)條件存在的差異。

1.3 試驗方法

1.3.1 孢子懸浮液的制備 將采自甘肅省慶陽感有黃矮根腐病的沙打旺帶菌莖稈用70%酒精表面消毒30 s，再用1%的次氯酸鈉消毒3min，無菌水沖洗4次，接種在PDA培養(yǎng)基中，25℃下黑暗培養(yǎng)1～3個月，獲得埃里磚格孢純培養(yǎng)病原菌，制成1×105個／mL的孢子懸浮液備用。

1.3.2 H2O2含量測定 用噴霧法將埃里磚格孢懸浮液接種在沙打旺全株上，未接種沙打旺植株為對照，取沙打旺葉片組織0.3g，加入丙酮研磨成漿；3000r／min離心10min，取上清液，依次加入硫酸鈦和濃氨水；5000 r／min離心10min后棄上清，洗滌5次，用硫酸溶解沉淀在450nm波長下測定吸光度值，計算組織中H2O2含量［18］。

1.3.3 發(fā)病率和病情指數(shù) 沙打旺黃矮根腐病發(fā)病率和病情指數(shù)統(tǒng)計采用李彥忠［19］的方法。病情指數(shù)分級標(biāo)準(zhǔn)：每株選擇5個枝條（不足5個枝條以實有枝條統(tǒng)計），每個枝條從基部向上選擇5個復(fù)葉，根據(jù)復(fù)葉上發(fā)病小葉（葉片基部或邊緣變黃，有病斑）占小葉總數(shù)的比例設(shè)定病情指數(shù)，0級：無小葉發(fā)??；1級：0%～25%；2級：25%～50%；3級：50%～75%；4級：＞75%的小葉有病斑。

1.3.4 酶活性測定 過氧化物酶（POD）活性采用李合生［20］的愈創(chuàng)木酚法，超氧化物歧化酶（SOD）采用氮藍(lán)四唑（NBT）光還原法［20］，過氧化氫酶（CAT）采用紫外吸收法［21］，多酚氧化酶（PPO）采用 Anderson和 Morris［22］的方法，β－1，3－葡聚糖酶（Glu）采用 Dygert等［23］的方法，幾丁質(zhì)酶（Cht）參照Boller等［24］的方法。

POD活性測定，用愈創(chuàng)木酚法測定［20］。取酶液0.1mL，加入0.5mL愈創(chuàng)木酚、100mL 0.1mol／L（pH 8.0）磷酸緩沖液、50μL H2O2，在470nm波長下每隔30s記錄（共3min）吸光度的變化值。

SOD活性測定，取0.1mL酶液，加入反應(yīng)液（1.5mL濃度為0.05mmol／L的磷酸緩沖液，0.5mL蒸餾水，以及130mmol／L甲硫氨酸、750μmol／L氮藍(lán)四唑、100μmol／L EDTA－Na2和20μmol／L核黃素各0.3mL）。20min后以不照光對照為空白，560nm波長下測定吸光值。以抑制NBT光化還原50%作為1個酶活力單位［20］。

CAT活性測定，取10mL試管4支，其中1支為對照管，另外3支各加入0.1mL粗酶液，1.5mL磷酸緩沖液（pH 7.8），4mL蒸餾水，于30℃保溫10min，隨后加入0.1mol／L的 H2O20.2mL，記錄240nm波長下每隔1min吸光值，1個酶活力單位為每min吸光值減少0.1［21］。

PPO活性測定，取0.2mL酶液，加入1mL兒茶酚（0.1mol／L），3.9mL磷酸緩沖液（pH 6.0），在波長410 nm下共記錄3min（每隔30s記錄1次）吸光值變化。1個酶活力單位定義每min每g組織吸光值變化0.01［22］。

Glu活性測定，取沙打旺葉片組織0.3g，加入5倍量乙酸鈉緩沖液（0.05mol／L，pH 5.0）研磨為勻漿，離心15min（15000r／min），4℃下透析，上清液為粗酶液，測定Glu活性，反應(yīng)底物為昆布多糖，1個酶活力單位定義為每g樣品每min產(chǎn)生1μg還原糖的酶量［23］。

Cht活性測定，－15℃下將沙打旺葉片組織0.5g冷凍加固，并加入3.0mL磷酸緩沖液（pH 6.4），研磨為勻漿，冷提2h，離心10min（10000r／min），得粗酶液，量取0.5mL粗酶液，加入0.1mL緩沖液，0.5mL膠狀幾丁質(zhì)（5mg／mL），40℃下保濕1h，冷卻后繼續(xù)離心，取0.5mL上清液，加0.1mL四硼酸鉀（0.8mol／L），沸水浴3min，待冷卻后加對二甲氨基苯甲醛試劑3mL，混勻，37℃下保濕20min，冷卻后在585nm波長下測定吸光值。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算Cht含量，1個酶活性單位定義為每h每g樣品從膠狀幾丁質(zhì)中釋放1μg N－乙酰葡萄糖胺［24］。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

用Microsoft Excel 2003整理試驗數(shù)據(jù)、作圖，用SPSS 17.0進行顯著性分析，平均值用Duncan新復(fù)極差分析進行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 接種埃里磚格孢后沙打旺葉片中內(nèi)源H2O2含量

接種埃里磚格孢后抗病與感病沙打旺品種H2O2含量變化不同。寧夏感病沙打旺接種病菌后H2O2含量隨著時間的延長呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢，且在整個處理期間均高于未接種，最高值出現(xiàn)在36h，H2O2含量為929 μmol／g，對照H2O2含量比較穩(wěn)定。陜西抗病沙打旺接菌后H2O2含量變化趨勢與感病品種相似，而最高值出現(xiàn)時間較早，為24h，達到986μmol／g，對照含量變化不大（圖1）。

2.2 發(fā)病率與病情指數(shù)

感病品種寧夏沙打旺在AsA處理下發(fā)病率最高，達43%，且與對照相比，H2O2處理下感病沙打旺發(fā)病率與病情指數(shù)分別降低了13%和12%。而抗病品種陜西沙打旺發(fā)病率最高值同樣為AsA處理，僅達到33%，與對照相比，H2O2處理下抗病沙打旺發(fā)病率與病情指數(shù)分別降低了8%和9%（圖2，圖3）。

2.3 施加H2O2與AsA處理對沙打旺葉片酶活性影響

2.3.1 過氧化物酶（POD）活性變化 由圖4可知，接種埃里磚格孢后感病沙打旺植株P(guān)OD活性總體呈雙峰曲線，分別于第3天和第7天出現(xiàn)峰值，且H2O2處理下POD活性最高，與對照和AsA差異顯著?？共∩炒蛲仓旮魈幚鞵OD活性隨時間變化呈先增加后降低，隨后又升高趨勢，接種埃里磚格孢1d后達到峰值，且H2O2處理下最高，相比對照和AsA差異顯著。整體上看，未接種各處理POD活性低于接種，且變幅較小。

2.3.2 多酚氧化酶（PPO）活性變化 感病與抗病沙打旺植株在埃里磚格孢侵染后各處理PPO活性均呈先增加后降低的趨勢，且明顯高于未接菌處理，H2O2處理顯著高于對照和AsA處理，感病品種PPO活性在7d后達到最大，抗病品種在則在第5天出現(xiàn)峰值，且抗病沙打旺PPO活性高于感病品種。未接種各處理在整個處理期間變化較小，處理間差異不大（圖5）。

2.3.3 β－1，3－葡聚糖酶（Glu）活性變化 感病品種接種后各處理Glu活性呈逐漸上升趨勢，在第9天達最高值，抗病品種接種后最高值出現(xiàn)在第5天，H2O2處理下活性最高（圖6），顯著高于感病品種。接種各處理Glu活性高于未接種，且H2O2處理要高于對照和AsA處理，AsA處理較對照低，抑制了接種沙打旺葉片Glu活性的升高。未接種沙打旺Glu活性比較穩(wěn)定，處理間差異不大。

圖1 接種埃里磚格孢后抗病與感病沙打旺葉片H2O2含量變化Fig.1 Leaf H2O2content change of disease－resistant and susceptible varieties of A.adsurgens inoculated with E.astragali

圖2 H2O2與AsA處理對沙打旺黃矮根腐病發(fā)病率的影響Fig.2 Effect of H2O2and AsA on incedence of yellow stunt and root rot disease of A.adsurgens

圖3 H2O2與AsA處理對沙打旺黃矮根腐病病情指數(shù)的影響Fig.3 Effect of H2O2and AsA on disease index of yellow stunt and root rot disease of A.adsurgens

2.3.4 幾丁質(zhì)酶（Cht）活性變化 埃里磚格孢侵染沙打旺后，Cht活性變化在測定時間內(nèi)呈單峰曲線，并高于未接種處理。其中，施加外源H2O2后提高了Cht活性，高于對照和AsA處理。AsA處理較對照低，對接種沙打旺葉片Glu活性的升高有抑制作用。感病品種最高值出現(xiàn)在第7天，為H2O2處理，抗病品種在第5天出現(xiàn)最高值。未接種處理Cht活性變化幅度較小，處理間差異不大（圖7）。

2.3.5 超氧化物歧化酶（SOD）活性變化 H2O2和AsA處理后，接種的感病與抗病沙打旺SOD活性均有不同程度的升高，呈先增高后降低的趨勢，且接種后各處理高于未接種處理，H2O2處理顯著高于對照和AsA處理。感病沙打旺SOD峰值出現(xiàn)在第7天，H2O2處理最高?？共∩炒蛲鶶OD活性最高值在第5天，H2O2處理最高。未接種沙打旺各處理間無明顯差異（圖8）。

圖4 H2O2與AsA處理對接種埃里磚格孢沙打旺POD的影響Fig.4 Effect of H2O2and AsA on POD activity of A.adsurgensinoculated with E.astragal

圖5 H2O2與AsA處理對接種埃里磚格孢沙打旺PPO的影響Fig.5 Effect of H2O2and AsA on PPO activity of A.adsurgensinoculated with E.astragal

圖6 H2O2與AsA處理對接種埃里磚格孢沙打旺Glu的影響Fig.6 Effect of H2O2and AsA on Glu activity of A.adsurgensinoculated with E.astragal

圖7 H2O2與AsA處理對接種埃里磚格孢沙打旺Cht的影響Fig.7 Effect of H2O2and AsA on Cht activity of A.adsurgensinoculated with E.astragal

圖8 H2O2與AsA處理對接種埃里磚格孢沙打旺SOD的影響Fig.8 Effect of H2O2and AsA on SOD activity of A.adsurgensinoculated with E.astragal

2.3.6 過氧化氫酶（CAT）活性變化 從圖9可以看出，接種的感病和抗病沙打旺品種在H2O2和AsA處理后，CAT活性均呈先增高后降低的趨勢，H2O2處理均不同程度提高了CAT活性，并高于對照和AsA處理，AsA處理較對照低，且抗病品種差異較大。感病品種CAT活性最高值出現(xiàn)在第7天，為接種H2O2處理?？共∑贩N接種各處理CAT活性最高值出現(xiàn)在第5天，H2O2處理最高。未接種沙打旺各處理間變化幅度較小。

3 討論

通過對接菌后沙打旺H2O2含量的動態(tài)變化研究，發(fā)現(xiàn)無論抗病還是感病沙打旺植株，其H2O2含量均高于未被埃里磚格孢侵染的植株，而未被埃里磚格孢侵染的植株H2O2含量相對穩(wěn)定。表明H2O2與植物抗病性緊密相關(guān)，在受到病原菌侵染時參與了植物體自身的防御反應(yīng)［25－26］。抗病植株H2O2含量最大值出現(xiàn)較早，說明其在受到病原菌入侵時比感病品種能在更短的時間內(nèi)進行調(diào)節(jié)對病害做出反應(yīng)。

施加外源H2O2后，感病沙打旺發(fā)病率和病情指數(shù)低于對照，并達到顯著差異（P＜0.05），H2O2清除劑AsA處理相對于對照顯著增加了發(fā)病率和病情指數(shù)。林志強等［16］的研究發(fā)現(xiàn)施加外源H2O2能減緩葡萄霜霉病菌侵染過程，降低發(fā)病率和病情指數(shù)。根據(jù)本研究的結(jié)果，推測其可能原因是埃里磚格孢的侵染一定程度上破壞植物體內(nèi)活性氧代謝平衡，而外源H2O2的加入補償并緩解了這種失衡，所以有外源H2O2加入時，植物自身保護系統(tǒng)得以加強，使其病情指數(shù)和發(fā)病率降低，同時，表明H2O2在埃里磚格孢侵染過程中作為信號分子可以調(diào)節(jié)酶系統(tǒng)代謝，增強植株抗病性。而抗病植株的發(fā)病率和病情指數(shù)均與對照無顯著差異，但AsA處理時，其發(fā)病率和病情指數(shù)均顯著高于施加外源H2O2處理，可以看出，當(dāng)清除抗病沙打旺體內(nèi)H2O2時，即使抗病品種，其發(fā)病率與有外源H2O2補償時相比，差異顯著（P＜0.05），表明H2O2在抵御黃矮根腐病發(fā)生方面具有重要作用，雖然植物體內(nèi)本身具有H2O2，但當(dāng)植物受到病原菌入侵時，外源H2O2的施加可以顯著改善其抗病性。

抗氧化酶在寄主植物抵抗病原菌方面扮演著不同的角色，主要通過破壞病原菌結(jié)構(gòu)或強化寄主植物細(xì)胞結(jié)構(gòu)來抵御病害的發(fā)生和發(fā)展［27］。酶活性的分析，發(fā)現(xiàn)在外源施加H2O2時接種埃里磚格孢的感病與抗病植株的各種酶活性高于對照，而AsA處理低于對照。林志強等［16］的研究也得出施加H2O2時能不同程度的提高酶活性。邱宗波等［28］研究表明，外源H2O2能夠緩解水分脅迫對小麥（Triticumaestivum）幼苗生長的抑制效應(yīng)，并提高受旱小麥葉片SOD、POD和CAT的活性及谷胱甘肽的含量。表明病原菌入侵植物后，自身酶反應(yīng)體系調(diào)控能力在一定程度上增強，而外源H2O2處理下，進一步誘導(dǎo)并產(chǎn)生更多的抗氧化酶，強化了寄主的病害防御體系，從而增加了對埃里磚格孢的抗性；當(dāng)用AsA處理時，其調(diào)控體系因缺乏H2O2，破壞了體內(nèi)信號通路的動態(tài)平衡，從而無法發(fā)揮有效作用。袁慶華等［29］對苜蓿褐斑病POD、SOD、PPO等酶活性研究后得出接種病原菌后，抗病與感病苜蓿（Medicagosativa）酶活性升高，且抗病苜蓿品種酶活性高于感病品種。俞斌華［5］對沙打旺抗病機理的研究中檢測到接種后酶活性升高，且抗病品種酶活性高于感病品種。本研究中我們發(fā)現(xiàn)，抗病和感病沙打旺植株在埃里磚格孢侵染后其各種酶活性均高于各處理下未接種的植株，而未接種沙打旺各種酶活性變化較小，說明外源H2O2及其清除劑不會對沙打旺酶調(diào)節(jié)體系產(chǎn)生影響，而在病原菌入侵時能夠有效得提高酶體系的抗病性。以上酶活性變化情況表明，感病與抗病沙打旺植株在受到埃里磚格孢侵染時，Cht、POD、PPO、CAT、SOD和Glu均不同程度的參與了抗病調(diào)節(jié)過程，且施加外源H2O2可以有效提高其調(diào)節(jié)作用。

綜上所述，外源H2O2一定程度上可以降低埃里磚格孢對感病和抗病沙打旺品種的侵染，降低發(fā)病率和病情指數(shù)，提高其酶調(diào)控體系，從而緩解沙打旺黃矮根腐病的危害，而關(guān)于被侵染時沙打旺的具體調(diào)控路徑和信號通道仍需進一步研究。

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