短柄五加果實多糖對果蠅非特異性刺激下生存函數(shù)的影響

李東波，周天林，肖朝霞，張博

（隴東學(xué)院甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級重點實驗室，甘肅慶陽745000）

短柄五加果實多糖對果蠅非特異性刺激下生存函數(shù)的影響

李東波，周天林，肖朝霞，張博

（隴東學(xué)院甘肅省高校隴東生物資源保護(hù)與利用省級重點實驗室，甘肅慶陽745000）

目的研究短柄五加果實多糖對果蠅非特異性刺激（冷、熱和重金屬）下生存函數(shù)的影響。方法用短柄五加果實多糖（0.00%、0.01%、0.05%、0.20%、1.00%）飼喂果蠅，然后分別置于冷（3℃）、熱（35℃）和重金屬（Cd、Cu、Pb）脅迫下，統(tǒng)計其不同時段死亡數(shù)。用Kaplan-meier模型建立對數(shù)生存函數(shù)并求得果蠅的平均生存時間、中位生存時間和最長生存時間。結(jié)果0.05%的短柄五加果實多糖使果蠅在高溫脅迫下生存能力提高27.3%、在低溫脅迫下生存能力提高18.6%，在鎘脅迫環(huán)境下生存能力提高91.7%，且不受果蠅身體素質(zhì)影響。結(jié)論短柄五加果實多糖可能具有提高動物冷、熱適應(yīng)能力及解重金屬毒害的作用，為短柄五加進(jìn)一步的藥物和功能食品開發(fā)提供理論依據(jù)。

短柄五加多糖；果蠅；非特異性刺激；生存函數(shù)

短柄五加（Acanthopanax brachypus）是五加科五加屬藥食兩用植物。世界上僅我國西北部黃土高原區(qū)有少量分布，屬我國特有瀕危珍稀灌木[1]。五加科植物多具有重要的藥理活性，《本草綱目》記載“寧要五加一握，不要金玉滿車”。短柄五加根及莖皮具有益氣健脾、寧心安神、開郁活血等功效[2]。其根、莖等常用于治療神經(jīng)衰弱、男子性功能障礙、婦女更年期綜合征等疾病[3]。目前對短柄五加的研究主要集中在根莖化學(xué)成分[4，5]、生殖生物學(xué)和生態(tài)學(xué)方面[6]，而對其有效成分的藥理學(xué)研究相對不足。

五加科植物多糖常具有重要而明顯的生物活性，如抗衰老、抗腫瘤、增強對非特異性刺激的耐受性、免疫調(diào)節(jié)等，且低毒甚至無毒，是目前藥學(xué)研究的熱門之一[7]。通過文獻(xiàn)查新可知，由于短柄五加珍貴稀少，其果實多糖藥理活性目前尚未見相關(guān)報道。

果蠅是目前被研究透徹的模式生物之一，將其作為疾病模型進(jìn)行藥理活性研究和新藥開發(fā)已被國際認(rèn)可[8]。目前，果蠅已廣泛用于藥物抗衰老[7]、抗非特異性刺激等方面[9，10]。本研究以黑腹果蠅為動物模型，研究短柄五加果實多糖對果蠅非特異性刺激下（高、低溫和重金屬）生存函數(shù)的影響，旨在為高效、合理開發(fā)短柄五加和新藥研發(fā)提供科學(xué)依據(jù)及數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料

短柄五加果實多糖（本實驗室自制）、w1118野生型果蠅（Drosophila melanogaster）（隴東學(xué)院生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院遺傳學(xué)教研室提供）、乙酸鉛、氧化鎘、氯化銅、丙酸、乙醚、玉米粉、酵母膏、瓊脂、食品級白砂糖。

1.2 儀器與設(shè)備

MGC-300A型智能光照培養(yǎng)箱（北京中科浩宇科技發(fā)展有限公司），DHG-9070A型電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒科技有限公司），BS-223S電子精密天平（北京塞多利斯儀器系統(tǒng)有限公司）。

1.3 果蠅實驗

1.3.1 基本培養(yǎng)基和多糖培養(yǎng)基配制基本培養(yǎng)基采用瓊脂玉米培養(yǎng)基[11]：玉米粉28 g、白砂糖22 g、水150 ml，混勻加熱至糊狀；瓊脂2.5 g加入100 ml水中，加熱溶解，倒入玉米糊中，攪勻冷卻至室溫，加酵母膏2.5 g，丙酸2 ml，攪拌混勻，分裝至果蠅管中備用。多糖培養(yǎng)基：在基本培養(yǎng)基中添加短柄五加果實多糖溶液，制成終濃度為0.01%、0.05%、0.20%、1.00%的4個多糖培養(yǎng)基[12]。

1.3.2 果蠅飼養(yǎng)w1118野生型果蠅，回交6代，以確保遺傳背景一致。在溫度25℃，相對濕度65%，光周期為12 h/d條件下培養(yǎng)果蠅，收集12 h內(nèi)羽化果蠅，乙醚麻醉，分雌雄，收集處女蠅以備實驗。

1.3.3 短柄五加果實多糖對高溫脅迫下果蠅死亡率的影響將處女蠅分別在基本培養(yǎng)基（0.00%）及多糖培養(yǎng)基（0.01%、0.05%、0.20%、1.00%）中培養(yǎng)7d，然后將不同處理組果蠅轉(zhuǎn)入相應(yīng)含1%瓊脂的果蠅管中，在溫度35℃，相對濕度65%，光周期為12 h/d的恒定條件下培養(yǎng)[13]，每隔12 h統(tǒng)計一次，直至果蠅全部死亡。每處理組50只果蠅（每管10只，共5個平行管），實驗重復(fù)3次。

1.3.4 短柄五加果實多糖對低溫脅迫下果蠅死亡率的影響將處女蠅分別在基本培養(yǎng)基（0.00%）及多糖培養(yǎng)基（0.01%、0．05%、0．20%、1．00%）中培養(yǎng)7 d，然后將不同處理組果蠅轉(zhuǎn)入相應(yīng)含1%瓊脂的果蠅管中，在溫度3℃（經(jīng)多次預(yù)實驗確定），相對濕度65%，光周期為12 h/d的恒定條件下培養(yǎng)，每隔12 h統(tǒng)計一次，直至果蠅全部死亡。每處理組50只果蠅（每管10只，共5個平行管），實驗重復(fù)3次。

1.3.5 短柄五加果實多糖對重金屬脅迫下果蠅存活率的影響通過半數(shù)致死率實驗求得重金屬對果蠅的半致死濃度（氧化鎘0．5%、氯化銅0．5%、乙酸鉛5%）。將處女蠅分別在多糖培養(yǎng)基（0．00%、0．05%）中培養(yǎng)7 d，分別轉(zhuǎn)入基本培養(yǎng)基和重金屬培養(yǎng)基（鎘、銅、鉛）中，在溫度25℃，相對濕度65%，光周期為12 h/d的恒定條件下培養(yǎng)，每隔12 h統(tǒng)計一次，直至果蠅全部死亡。每處理組50只果蠅（每管10只，共5個平行管），實驗重復(fù)3次。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

用SPSS 19．0軟件進(jìn)行分析和作圖，用Kaplan－meier模型做數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 短柄五加果實多糖對高溫脅迫下果蠅生存函數(shù)的影響（見圖1）

圖1 短柄五加果實多糖對高溫脅迫下果蠅生存函數(shù)的影響

由圖1可知：高溫脅迫下果蠅平均生存時間分別為55 h（0．00%）、60 h（0．01%）、70 h（0．05%）、56 h（0．20%）和63 h（1．00%）。經(jīng)Log－Rank比較分析可知，0．05%組與0．00%組生存時間差異顯著（P＜0．05），說明濃度為0．05%的短柄五加果實多糖對果蠅抗高溫脅迫效果最好（比0．00%組提高27．3%）。

高溫脅迫下果蠅中位生存時間分別為48 h（0．00%）、60 h（0．01%）、60 h（0．05%）、60 h（0．20%）和48 h（1．00%），說明0．01%～0．20%的短柄五加果實多糖對體弱果蠅的抗低溫脅迫效果均好，1．00%的短柄五加果實多糖效果不明顯。最長生存時間分別為120 h（0．00%）、132 h（0．01%）、156 h（0．05%）、120 h（0．20%）和132 h（1．00%），說明0．05%的短柄五加果實多糖對強壯果蠅的抗高溫脅迫效果也最好。

2.2 短柄五加果實多糖對低溫脅迫下果蠅生存函數(shù)的影響（見圖2）

由圖2可知：低溫脅迫下果蠅平均生存時間分別為102 h（0．00%）、115 h（0．01%）、121 h（0．05%）、105 h（0．20%）和103 h（1．00%）。經(jīng)Log－Rank比較分析可知，0．05%組和0．00%組結(jié)果差異顯著（P＞0．05），說明0．05%的短柄五加果實多糖對果蠅抗低溫脅迫效果最好（比0．00%組提高18．6%）。

低溫脅迫下果蠅中位生存時間分別為96 h（0．00%）、108 h（0．01%）、120 h（0．05%）、108 h（0．20%）和96 h（1．00%），最長生存時間分別為156 h（0．00%）、156 h（0．01%）、170 h（0．05%）、156 h（0．20%）和156 h（1．00%），說明0．05%的短柄五加果實多糖對體弱和強壯果蠅的抗低溫脅迫效果最好。

圖2 短柄五加果實多糖對低溫脅迫下果蠅生存函數(shù)的影響

2.3 0.5%氧化鎘脅迫下0.05%短柄五加果實多糖對果蠅生存函數(shù)的影響（見圖3）

圖3 0．5%氧化鎘脅迫下短柄五加果實多糖對果蠅生存函數(shù)的影響

由圖3可知：果蠅平均生存時間分別為36 h（0．00%）、69 h（0．05%）。經(jīng)Log－Rank比較分析可知，0．05%組和0．00%組差異顯著（P＜0．01），說明0．05%的短柄五加果實多糖對果蠅抗氧化鎘脅迫效果好（比0．00%組提高91．7%）。

0．5%氧化鎘脅迫下果蠅中位生存時間分別為36 h（0．00%）、60 h（0．05%），最長生存時間分別為60 h（0．00%）、108 h（0．05%），說明0．05%的短柄五加果實多糖對體弱和強壯果蠅的抗氧化鎘脅迫效果也好。

2.4 0.5%氯化銅脅迫下0.05%短柄五加果實多糖對果蠅生存函數(shù)的影響（見圖4）

由圖4可知：0．5%氯化銅脅迫下果蠅平均生存時間分別為68 h（0．00%）、59 h（0．05%）。經(jīng)Log－Rank比較分析可知，0．05%組和0．00%組差異無顯著性（P＞0．05），說明0．05%的短柄五加果實多糖對果蠅抗氯化銅脅迫效果不顯著。

圖4 0．5%氯化銅脅迫下短柄五加果實多糖對果蠅死亡函數(shù)的影響

0．5%氯化銅脅迫下果蠅中位生存時間分別為84 h（0．00%）、60 h（0．05%），最長生存時間分別為84 h（0．00%）、84 h（0．05%），說明0．05%的短柄五加果實多糖對體弱和強壯果蠅的抗氯化銅脅迫效果不顯著。

2.5 5%乙酸鉛脅迫下0.05%短柄五加果實多糖對果蠅生存函數(shù)的影響（見圖5）

圖5 5%乙酸鉛脅迫下短柄五加果實多糖對果蠅生存函數(shù)的影響

由圖5可知：5%乙酸鉛脅迫下果蠅平均生存時間分別為62 h（0．00%）、72 h（0．05%）。經(jīng)Log－Rank比較分析可知，0．05%組和0．00%組差異無顯著性（P＞0．05），說明0．05%的短柄五加果實多糖對果蠅抗乙酸鉛脅迫效果不顯著。

5%乙酸鉛脅迫下果蠅中位生存時間分別為60 h（0．00%）、60 h（0．05%），最長生存時間分別為84 h（0．00%）、84 h（0．05%），說明0．05%的短柄五加果實多糖對體弱和強壯果蠅的抗乙酸鉛脅迫效果不顯著。

3 討論

藥物篩選是一個成本高、時間長的艱苦工作，用小鼠或大鼠做藥物模型，常由于人道主義問題、成本高和飼養(yǎng)管理不便受到限制。果蠅遺傳背景清晰，飼養(yǎng)簡便，成本低，繁殖快，不存在倫理問題，而且其在生長發(fā)育、生理功能、代謝途徑等方面與哺乳動物基本相似，超過60%的人類疾病基因在果蠅中具有同源基因，這些優(yōu)勢使其成為很好的代替人的動物模型。郭俊生等[13]證明果蠅可以用做研究提高熱適應(yīng)能力物質(zhì)的動物模型，黃云鵬等[10]認(rèn)為果蠅可以作為研究金屬元素和疾病之間關(guān)系的動物模型。

果蠅生存試驗可以靈敏地反映環(huán)境、藥物等因素對壽命的影響，其中，平均生存時間是最重要的指標(biāo)，為綜合藥效的反映；中位生存時間反映藥物對體弱果蠅的延壽效果；最長生存時間反映藥物對強壯果蠅的延壽效果。本研究表明，0．05%的短柄五加果實多糖能增強果蠅耐高、低溫能力和抗重金屬鎘的毒害，且不受身體素質(zhì)的影響。這些結(jié)果提示短柄五加果實多糖可能具有提高動物冷、熱適應(yīng)能力及解重金屬毒害的作用，為短柄五加的藥物開發(fā)提供又一方向。

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G424.31

B

1671-1246（2015）05-0102-03

注：本文系甘肅省教育廳項目（1010-08）；慶陽市重大科技支撐項目（1003NKCM020）；隴東學(xué)院科研基金項目（lyzk1101）