HPLC法測定芪丹顆粒劑中黃芪甲苷的含量

關(guān) 欣，徐雅娟通信作者：徐雅娟，女，博士研究生導(dǎo)師，電話－3578953，電子信箱－045758849＠qq.com，解生旭，劉 悅，司云珊，劉云雪，張丁文（.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春307；.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春300）

HPLC法測定芪丹顆粒劑中黃芪甲苷的含量

關(guān) 欣1，徐雅娟2*通信作者：徐雅娟，女，博士研究生導(dǎo)師，電話－13578915311，電子信箱－1045758849＠qq.com，解生旭2，劉 悅2，司云珊2，劉云雪1，張丁文1
（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)，長春130117；2.吉林省中醫(yī)藥科學(xué)院，長春130021）

目的 建立芪丹顆粒劑中黃芪甲苷的HPLC含量測定方法。方法 通過HPLC法對芪丹顆粒劑中黃芪甲苷進行含量測定及方法學(xué)考察。結(jié)果 經(jīng)測定黃芪甲苷在芪丹顆粒劑中的含量為0.165 mg/g。標(biāo)準(zhǔn)品黃芪甲苷在0.28～3.36μg范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，精密度RSD＝0.43％（n＝5）；穩(wěn)定性良好，RSD＝0.31％；重現(xiàn)性RSD值為RSD＝1.44％（n＝5）。平均回收率為97.94％，RSD值為1.44％（n＝5）。結(jié)論 該方法簡單，精密，專屬性好，可為芪丹顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)。

HPLC；芪丹顆粒劑；黃芪甲苷；含量測定

芪丹顆粒劑主要由黃芪、黨參、黃精、丹參、郁金和赤芍6味藥組成。黃芪藥性溫和，味甘苦，歸肺、胃經(jīng)，是常用的補氣中藥，并具有排膿、補氣固表、利尿排毒、斂瘡生肌等功效［1］；黨參其性味甘平、無毒，具有補中益氣、活血化瘀、健脾生津之功效及抗腫瘤、耐疲勞、增強機體免疫力等多種作用［2-3］，在臨床上主要用于治療冠心病及缺血性腦血管病等心腦血管類疾??；黃精性平，味甘，具有補氣養(yǎng)陰，健脾，潤肺，益腎的功效［4-7］；丹參性微寒，味苦，入心、肝經(jīng)，有活血通絡(luò)、祛瘀止痛、涼血消癰、清心除煩之功，并具有活血化瘀等多方面的藥理活性，臨床上常被用于治療冠心病及缺血性腦血管病等［8］；郁金［9-11］有活血行氣止痛、清心解郁、利膽退黃、涼血止血之功效，常用于治療經(jīng)閉痛經(jīng)、胸腹脹痛、黃膽尿赤等；赤芍性微寒，味苦，歸肝經(jīng)，有散瘀止痛，清熱涼血之功效，常用于治療熱入營血，溫毒發(fā)斑，吐血衄血，目赤腫痛，肝郁脅痛，經(jīng)閉痛經(jīng)，癥瘕腹痛，跌撲損傷，癰腫瘡瘍［12］等。本文采用HPLC法測定芪丹顆粒劑中黃芪甲苷的含量，為芪丹顆粒劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究奠定基礎(chǔ)。

1 儀器與試藥

高效液相色譜儀：島津 LC-2010檢測器，ELSD 2000ES蒸發(fā)光散射檢測器，CLSS-VP色譜工作站。黃芪甲苷對照品（購于中國藥品生物制品檢定所，批號：781-9003，含量測定用）；甲醇（色譜純，北京化工廠）；乙腈（色譜純，北京化工廠）；水為雙蒸水；其他試劑為分析純。

2 黃芪甲苷含量測定

2.1 測定方法 供試品制備：取本品20 g，精密稱定，加甲醇150mL，加熱回流2 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水50 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次50 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌3次，每次50 mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。對照品制備：取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含0.5 mg的溶液，即得。測定法：分別精密吸取對照品溶液10，20μL，供試品溶液20μL，注入液相色譜儀，用外標(biāo)兩點法對數(shù)方程計算，即得。

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 提取方法考察 1）取本品20 g，精密稱定，加入甲醇150mL，超聲處理30 min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。2）取本品20 g，精密稱定，加甲醇150 mL，加熱回流2 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水50 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次50 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌3次，每次50mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水10mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm），以水100 mL洗脫，棄去水液，再用40％乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70％乙醇100mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。3）取本品 20 g，精密稱定，加甲醇150mL，加熱回流2 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水50 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次50 mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌3次，每次50mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。4）取本品20 g，精密稱定，置索氏提取器中，加甲醇40 mL，冷浸過夜，再加甲醇110 mL，加熱回流4 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水50mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次50mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌3次，每次50mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加水10mL使溶解，放冷，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm），以水100mL洗脫，棄去水液，再用40％乙醇50mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70％乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。5）取本品20 g，精密稱定，加入甲醇150mL，超聲處理30min，放冷，濾過，濾液蒸干，殘渣加水50 mL，微熱使溶解，用水飽和的正丁醇振搖提取5次，每次50mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌3次，每次50mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。6）取本品20 g，精密稱定，加甲醇150mL，加熱回流2 h，提取液回收溶劑并濃縮至干，殘渣加水50mL使溶解，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內(nèi)徑為1.5 cm，柱高為12 cm），以水100 mL洗脫，棄去水液，再用40％乙醇50mL洗脫，棄去洗脫液，繼用70％乙醇100mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉(zhuǎn)移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得。結(jié)果見表1。

表1 提取方法考察表

結(jié)果表明：上述6個方法提取的黃芪甲苷按峰面積比較，方法3提出的黃芪甲苷較其他5個方法都高，因此確定提取方法3作為供試品制備方法。

2.2.2 色譜條件的選擇［13］

2.2.2.1 色譜柱考察 1）Gracesmart RPC18柱（4.6mm×250 mm，5μm）；2）SHIMADZU VP-OSD柱（4.6mm×250mm，5μm）；3）Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）。結(jié)果表明：3個色譜柱分離效果都好，無干擾，但Agilent ZORBAX SB-C18柱黃芪甲苷出峰較早，保留時間在14 min，考慮節(jié)省實驗時間及試劑，故選用Agilent ZORBAX SB-C18柱為芪丹顆粒劑中黃芪甲苷含量測定色譜柱。

2.2.2.2 流動相考察 參照《中國藥典》黃芪甲苷的色譜條件為乙腈-水（32∶68）。結(jié)果表明，流動相色譜峰分離效果良好，無干擾，故選用此流動相作為黃芪中黃芪甲苷含量測定流動相。經(jīng)上述考察，選定色譜條件為：高效液相色譜儀：島津2010。色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（4.6mm×250mm，5μm）。流動相：以乙腈-水（32∶68）為流動相。流速：1.0 mL/min。檢測器：2000E蒸發(fā)光檢測器。蒸發(fā)管溫度：100℃。氣體流速：2.8mL/min。

2.2.3 線性關(guān)系考察 線性關(guān)系的考察和標(biāo)準(zhǔn)曲線：取黃芪甲苷對照品制成0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別精密吸取2，6，12，18，24μL，注入高效液相色譜儀，測定色譜峰峰面積，作濃度-積分面積的線性關(guān)系曲線，進樣量在1.0～12.0μg范圍內(nèi)呈線性關(guān)系，回歸方程 Y＝5.535 1＋1.753 3 X，r2＝0.999 1。

2.2.4 精密度試驗 精密吸取對照品溶液10μL，重復(fù)進樣5次，測定色譜峰峰面積，計算，黃芪甲苷峰面積平均值為5 534 189，RSD為1.61％。

2.2.5 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液20μL，每隔2 h進一次針，測定色譜峰峰面積，計算，結(jié)果黃芪甲苷峰面積平均值為6 259 999.2，RSD為3.40％。

2.2.6 重現(xiàn)性試驗 取同一樣品，均分5分，精密稱定，分別按本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項下操作，測定，計算，結(jié)果黃芪甲苷含量/（mg/g）X＝0.17，RSD＝4.35％。

2.2.7 回收率試驗 取已知黃芪甲苷含量的樣品（含量為0.17mg/g）10 g，共5分，精密稱定，分別精密加入黃芪甲苷約2.0mg，按本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)檢測測定項下操作測定，計算回收率，結(jié)果黃芪甲苷 X＝97.94％，RSD＝1.44％。

2.3 樣品含量測定數(shù)據(jù)及含量限度 按本品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)含量測定項下的操作方法，測定一批樣品，每批測定2次，取其均值，結(jié)果根據(jù)一批樣品測定結(jié)果，本品含量限度暫定每袋不少于1.3 mg。

3 小結(jié)

本文應(yīng)用高效液相色譜技術(shù)對芪丹顆粒劑中黃芪甲苷的含量進行了測定，同時對其進行方法學(xué)的考察，初步建立了芪丹顆粒劑中黃芪甲苷含量測定的方法和含量限度，以確保大工業(yè)生產(chǎn)得到合格、穩(wěn)定的制劑。

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Content determ ination of astragaloside in qidan granules by HPLC

GUAN Xin1，XU Yajuan2*< class="footnote_content" id="jz_0_31">通信作者：徐雅娟，女，博士研究生導(dǎo)師，電話－13578915311，電子信箱－1045758849＠qq.com

Objective To establish themethod of content determination of astragaloside in qidan granules by HPLC.Methods Content determination andmethodological study were conducted in astragaloside in qidan granules by HPLCmethod.Results Itwas determined that the content of astragaloside in qidan granuleswas 0.165 mg/g；the content of was 0.305 mg/g.Standard astragaloside within the range of 0.28～3.36μg presented good linear relationship，its precision RSD＝0.43％（n＝5）；its stabilitywas good，RSD＝0.31％；its reproducibility RSD valuewas RSD＝1.44％（n＝5）；its average recovery ratewas 97.94％and its RSD valuewas1.44％（n＝5）.Conclusion Themethod was simple and accuratewith good specificity，and laid foundation for the quality standard research of qidan granules.

HPLC；Qidan granules；astragaloside；content determination

book=245,ebook=31

R248.2

A

2095－6258（2015）02－0245－03

10.13463/j.cnki.cczyy.2015.02.009

2014－05－19）

科技部重大創(chuàng)制藥物專項（2009ZX09103-447）。

關(guān) 欣（1988－），男，碩士研究生，主要從事藥物活性物質(zhì)成分與結(jié)構(gòu)研究。

徐雅娟，女，博士研究生導(dǎo)師，電話－13578915311，電子信箱－1045758849＠qq.com，XIE Shengxu2，LIU Yue2，SIYunshan2，LIU Yunxue1，ZHANG Dingwen1
（1.Changchun University of Chinese Medicine，Changchun 130117，China；
2.Jilin Academy of Traditional Chinese Medicine Sciences，Changchun 130021，China）