FKN、PI3K及NF-κB對人外周血單個核細胞IL-6表達的的影響及纈沙坦的干預作用

（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院心血管內(nèi)科，沈陽 110032）

FKN、PI3K及NF-κB對人外周血單個核細胞IL-6表達的的影響及纈沙坦的干預作用

于霏，金元哲，雷明明，張學穎，張曉春，劉君

（中國醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院心血管內(nèi)科，沈陽 110032）

目的探討不規(guī)則趨化因子Fractalkine（FKN）、磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K）、核因子κB（NF-κB）對外周血單個核細胞（PBMC）IL-6表達的影響及纈沙坦的干預作用，研究FKN影響IL-6表達的信號轉(zhuǎn)導機制。方法利用密度梯度離心法分離健康人外周血單個核細胞，將提取的PBMC分為7組：空白對照組、FKN組、LY294002組（PI3K抑制劑）、PDTC組（NF-κB抑制劑）、FKN+纈沙坦組、FKN+LY294002組、FKN+PDTC組，后二組在FKN誘導PBMC細胞前分別由LY294002、PDTC預處理。各組PBMC分別在12 h和24 h后，用酶聯(lián)免疫吸附實驗（ELISA）法檢測各組細胞培養(yǎng)液中的IL-6表達。結(jié)果培養(yǎng)12 h后，與對照組比較，F(xiàn)KN組IL-6明顯降低（P＜0.05），LY294002組和PDTC組無明顯差異（P＞0.05）；與FKN組比較，F(xiàn)KN+纈沙坦組IL-6明顯降低（P＜0.05），F(xiàn)KN+LY294002組IL-6明顯升高（P＜0.05）、FKN+PDTC組IL-6明顯降低（P＜0.05）。培養(yǎng)24 h后，各組IL-6表達無明顯差異（P＞0.05）。結(jié)論FKN對人外周血單個核細胞IL-6的表達具有雙向調(diào)節(jié)作用，通過PI3K途徑抑制IL-6的表達，而通過NF-κB途徑促進IL-6的表達，總體上FKN可以抑制IL-6的表達。纈沙坦可增加FKN抑制IL-6表達的作用。

不規(guī)則趨化因子；磷脂酰肌醇-3激酶；核因子κB；IL-6；纈沙坦

Fractalkine（FKN）是最近新發(fā)現(xiàn)的一種趨化因子，存在于多種正常組織器官如心臟、腦、腎和肺，由活化內(nèi)皮細胞表達，分泌型FKN可與受體CX3CR1結(jié)合，增強自然殺傷細胞（NK）的殺傷力，導致血管內(nèi)皮細胞損傷［1］，同時介導白細胞黏附、趨化。關于FKN和IL-6之間的關系，目前國內(nèi)外鮮有報道。因此本文針對FKN如何影響IL-6表達進行深入研究，同時研究該過程纈沙坦的藥物作用，以及探討PI3K和NF-κB在IL-6表達過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人外周血濃縮白細胞、優(yōu)等胎牛血清（FBS）（Hyclone公司）、青霉素及鏈霉素（華北制藥廠）、淋巴細胞分離液（濃度1.077 g/mL）（天津，TBD公司）、乙二胺四乙酸（EDTA，Promega公司）、人IL-6 ELISA檢測試劑盒（武漢，USCN.Life Science Inc）、重組人Fractalkine（Sigma公司）、LY294002（Sigma公司）、PDTC（Sigma公司）、纈沙坦（Sigma公司）、RPMI1640培養(yǎng)基（Gibco公司），DMSO（Sigma公司）。

1.2 方法

1.2.1 人外周血單個核細胞（PBMC）的分離及分組：無菌條件下，先用密度梯度離心法從人外周血濃縮白細胞中分離PBMC，然后將1×106個單個核細胞（0.2 mL）孔鋪于96孔細胞培養(yǎng)板中，將細胞隨機分為7組，每組2個復孔。對照組將PBMC置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。FKN組在PBMC培養(yǎng)液中加FKN，終濃度 1 μ g/mL。LY294002組在PBMC培養(yǎng)液中加入LY294002（終濃度為250 μg/mL）。PDTC組在PBMC培養(yǎng)液中加入PDTC（終濃度為250 μg/mL）。FKN+纈沙坦組在PBMC培養(yǎng)液中加入纈沙坦（終濃度為250 μg/mL），作用2 h后，加入FKN（終濃度為1 μg/mL）。FKN+LY294002組在PBMC培養(yǎng)液中加入LY294002（終濃度為250 μ g/mL），作用2 h后，加入FKN（終濃度為 1 μg/mL）。FKN+PDTC組在PBMC培養(yǎng)液中加入PDTC（終濃度為250 μg/mL），作用2 h后，加入FKN（終濃度為1 μg/mL）。除對照組外，另6組FKN終濃度加至1 μg/mL后，均置于37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中孵育。

1.2.2 IL-6檢測：收集各組PBMC培養(yǎng)液，在FKN終濃度加至1 μg/mL后在12 h和24 h用ELISA法檢測其IL-6表達。嚴格按IL-6酶聯(lián)免疫吸附法試劑盒說明書操作。

1.3 統(tǒng)計學方法

本實驗數(shù)據(jù)以x±s表示，采用Bartlett法證明各組方差齊性后，采用方差分析和q檢驗進行組間兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

處理12 h后：與對照組比較，F(xiàn)KN組IL-6明顯降低（P＜0.05），LY294002組和PDTC組無明顯差異（P＞0.05）；與FKN組比較，F(xiàn)KN+纈沙坦組IL-6明顯降低（P＜0.05），F(xiàn)KN+LY294002組IL-6明顯升高（P＜0.05）、FKN+PDTC組IL-6明顯降低（P＜0.05）。

處理24 h后各組均無統(tǒng)計學差異（P＞0.05）見表1。

表1 培養(yǎng)12 h和24 h后各組細胞IL-6表達結(jié)果（n=3，x±s，pg/ mL）Tab.1 Results of the IL-6 expression in each group after 12hand 24 h of culture（n=3，x±s，pg/mL）

3 討論

FKN是動脈粥樣硬化的危險因素之一［2］。其機制可能為FKN是一種由促炎細胞因子激活、主要表達在內(nèi)皮和上皮細胞上的跨膜蛋白1，它能夠與單個核細胞上的受體CX3CR1結(jié)合后介導強烈的細胞黏附作用，這一作用不依賴于整合素。FKN兼具有趨化和黏附的雙重作用，參與多種免疫炎性疾病的病理生理過程。Rus等［3］報道IL-6在動脈粥樣硬化（AS）壁中的濃度為其血清的200倍，證明了IL-6在AS中的重要性。FKN和IL-6都可影響細胞內(nèi)炎癥因子的表達，但二者相互作用及引發(fā)的信號傳導機制尚不明確。

以往的研究發(fā)現(xiàn)［4］，F(xiàn)KN和IL-6在炎性反應過程中有共同的傳導通路ERK1/2，且有研究證實［5］CX3CR1缺失的NK細胞在TLR3激活polyIC時使IL-6增多，而FKN可與受體CX3CR1結(jié)合，但二者關系尚不清楚。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，12 h的培養(yǎng)結(jié)果顯示FKN組IL-6表達明顯低于對照組，這個結(jié)果與我們預期結(jié)果不一致，因為二者均可導致AS的發(fā)生及發(fā)展，但相互作用是拮抗的，產(chǎn)生這個結(jié)果的原因可能如下：其一，細胞因子在高等動物體內(nèi)的作用方式具有網(wǎng)絡調(diào)節(jié)特點，既可促進又可抑制，我們推測在FKN影響IL-6表達的過程中可能總的效應是抑制；其二，這種總的效應也許會受外界環(huán)境等因素的干擾，在一定條件下可能會轉(zhuǎn)換，本實驗只是針對健康人外周血單個核細胞，尚需要進一步的研究。

NF-κB是一種誘導性核轉(zhuǎn)錄因子，最近研究發(fā)現(xiàn)NF-κB的持續(xù)激活是有害的，NF-κB可通過調(diào)控炎性因子的產(chǎn)生，進而調(diào)節(jié)白細胞的聚集泡沫細胞形成以及硬化斑塊的穩(wěn)定性，參與AS的發(fā)生發(fā)展［6，7］。FKN是否可通過NF-κB抑制IL-6，尚不明確。根據(jù)12 h后的實驗結(jié)果顯示，NF-κB抑制劑本身對IL-6表達無影響，但NF-κB抑制劑在FKN誘導后，較FKN組IL-6表達明顯減少，證實FKN可能通過NF-κB途徑促進IL-6的表達。由此可推測，F(xiàn)KN可在某種情況下通過NF-κB途徑促進IL-6的表達而影響AS的進展。

P13K是一種胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶，已有研究表明P13K是許多炎性因子傳導的共同通路，且發(fā)現(xiàn)P13K可被FKN激活。FKN抑制IL-6表達，PI3K是否參與其中，尚不明確。12 h后的結(jié)果顯示：同樣，PI3K抑制劑本身對IL-6表達無明顯影響，但PI3K抑制劑在FKN誘導后，較FKN組IL-6表達明顯增多，證實FKN通過PI3K途徑可能起抑制IL-6表達作用，阻斷PI3K后，IL-6表達明顯增多，但較對照組還增高，推測原因可能是FKN還可以通過其他傳導通路促進IL-6表達，阻斷PI3K后，其他通路如NF-κB途徑被激活，F(xiàn)KN通過可通過NF-κB促進IL-6表達，進一步使其表達增加高于對照組。因此，F(xiàn)KN可在PI3K作用下使IL-6表達減少，在AS形成過程中起到拮抗平衡作用。

有研究證實纈沙坦可發(fā)揮獨立于降壓以外的抗炎作用［8］。根據(jù)本實驗結(jié)果，纈沙坦在FKN抑制IL-6表達過程中起協(xié)同抑制作用，機制可能是纈沙坦抑制炎性因子的表達，從而進一步使IL-6表達減少。由于本實驗樣本量較小，尚需要進一步研究證實。

本研究證實FKN可抑制人外周血單個核細胞IL-6的表達，PI3K和NF-κB信號分子可能參與該過程，纈沙坦增加FKN抑制IL-6表達的作用。探索FKN/CX3CR1在細胞內(nèi)如何影響炎性因子的表達、相互作用及FKN引發(fā)的信號傳導機制，有助于明確FKN/CX3CR1在一系列病理生理過程中所扮演的角色，提高對免疫炎性因子復雜的錯綜網(wǎng)絡關系的認識，并為治療相關疾病提供新的切入點。

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［2］姚康，陸浩，張春瑜，等.急性冠狀動脈綜合征患者Fractalkine水平的研究［J］.中國介入心臟病學雜志，2012，20（4）：181-184.

［3］Rus H，Niculescu F.Inflammatory response in unstable angina［J］. Circulation，1999，100（19）：e98-e98.

［4］雷明明，孫健，張學穎，等.FKN對外周血單個核細胞ERK1/2活化和TNF-α表達的影響及ERK1/2的臨床作用［J］.中國老年學雜志，2011，31（12）：2264-2266.

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［6］Cuhlmann S，Vander HK，Saliba D，et al.Disturbed blood flow induces RelA expression viac-JunN-terminal kinase1：anovel mode of NFBregulationthat promotes arterial inflammation［J］.Circ Res，2011，108（8）：950-959.

［7］Wang Y，Wang X，Sun M，et al.NF-Bactivity-dependent P-selectin involve in ox-LDL-induced foam cell formation in U937 cell［J］.Biochem Biophys Res Commun，2011，411（3）：543-548.

［8］牛力，孟欣穎，周長宏，等.纈沙坦對高血壓伴持續(xù)性房顫病人血清炎癥因子的影響［J］.中華臨床醫(yī)師雜志，2012，6（9）：6082-6083.

（編輯裘孝琦）

EffectofChemotatic Factor FKN，PI3K and NF-κBon IL-6 Expression in PeripheralBlood Monocytes and the EffectofValsartan Intervention

YUFei，JINYuan-zhe，LEIMing-ming，ZHANGXue-ying，ZHANGXiao-chun，LIUJun
（DepartmentofCardiovascular Medicine，The Fourth Affiliated Hospital，China MedicalUniversity，Shenyang 110032，China）

Objective To explore effectofirregularchemotatic factorfractalkine（FKN），phosphatidylinositol3 kinase and nuclearfactor-κB（NF-κB）on interleukin-6（IL-6）expression in peripheral blood monocytes and the effect of valsartan intervention，so as to research the signal conductive mechanism of FKN impacting on IL-6.MethodsPeripheral blood monocytes were isolated from fresh blood of healthy volunteers by the density gradient centrifugation.The extractive peripheral blood monocytes were divided into seven groups：the control group，the FKN group，the LY294002 group（PI3K inhibitors），the PDTC group（NF-κB inhibitors），the FKN+valsartan group，the FKN+LY294002 group，and the FKN+ PDTC group，the latter two were pretreated by LY294002 and PDTC respectively before FKN inducing PBMC cells.The IL-6 expression in cell medium was measured in each group by ELISA at 12 hours and 24 hours after PBMC treatment.ResultsAfter 12 hours of culture，compared with the control group，the expression of IL-6 in the FKN group was decreased（P＜0.05），while LY294002 and PDTC groups had no significant difference（P＞0.05）.Compared with the FKNgroup，the expression ofIL-6 was decreased in the FKN+valsartan group（P＜0.05），increased in the FKN+ LY294002 group（P＜0.05），and was decreased in the FKN+PDTC group（P＜0.05）.After 24 hours of culture，the IL-6 expression in each group had no significant difference（P＞0.05）.ConclusionFKN can adjust the expression of peripheral blood PBMC IL-6 in a two-way pattern，inhibiting the expression of IL-6 by PI3K pathway and promoting the expression of IL-6 by NF-κB pathway，overall，F(xiàn)KN can inhibit the expression ofIL-6.Valsartan can increase FKN to inhibitthe expression ofIL-6.

fractalkine；phosphatidyl inositol 3 kinase；nuclear factor-κB；interleukin-6；valsartan

R541.4

A

0258-4646（2015）03-0214-03

遼寧省科技廳資助項目（2011404013-6）

于霏（1988-），女，碩士研究生.

金元哲，E-mail：jyzzhj@hotmail.com

2014-11-17

網(wǎng)絡出版時間：