FAT10通過激活RhoA介導肝細胞性肝癌侵襲 轉移*

胡威 董忠誼 吳德華

肝細胞性肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，在我國HCC發(fā)病人數約占全球的55%，在腫瘤相關死亡中高居第2位［1］。研究表明：影響HCC患者生存最主要的因素為術后復發(fā)及遠處轉移［2］。因此尋找肝癌復發(fā)、轉移相關的風險因素及探討其促癌機制將有助于臨床診療策略的制定及抗腫瘤新藥的開發(fā)。近年研究發(fā)現泛素樣蛋白家族成員FAT10參與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展［3-5］，本課題組前期的研究也證實FAT10在乙肝相關肝癌中高表達，且促進肝癌細胞的侵襲、轉移［6］。Rho家族成員RhoA可直接影響細胞骨架蛋白（F-actin）重構，改變細胞的遷移、侵襲能力［7-8］，是否FAT10促進肝癌細胞侵襲、轉移通過RhoA介導尚不明確。本研究擬初步探討FAT10對細胞骨架蛋白F-actin的影響及可能的機制。

1 材料與方法

1.1 臨床資料

病例樣本來自于2003年3月至2006年10月南方醫(yī)科大學南方醫(yī)院行手術切除并經病理證實為原發(fā)性肝細胞癌患者108例（表1）。按照美國腫瘤聯合會（AJCC）2003年聯合制定的TNM分期法進行臨床分期，所有患者術前均未接受其他治療手段，術后腫瘤轉移及復發(fā)的診斷主要依據影像學和臨床病理活檢證實。

1.2 方法

1.2.1 組織標本免疫組織化學檢測 將肝癌標本組織切片置于65℃烤箱中烘烤2 h，二甲苯常規(guī)脫蠟，梯度乙醇水化后，PBS沖洗3次（5 min/次），再于3%H2O2室溫孵育10 min去除內源性過氧化物酶的影響；PBS沖洗3次（5 min/次），將組織切片完全浸泡在PH值為6.0的枸櫞酸酸溶液中，高壓修復3 min，室溫冷卻；PBS沖洗3次（5 min/次），其后分別滴加FAT10（美國Epitomics公司，1∶100）及active-RhoA（美國AB?cam公司，1∶100）一抗工作液，4℃過夜；復溫40 min防脫片，PBS沖洗3次（5 min/次），滴加二抗工作液（丹麥Dako公司），室溫孵育1.5 h；DAB（丹麥Dako公司）顯色，蘇木素復染，脫水，透明，封片，顯微鏡下觀察，評分及采圖。

1.2.2 免疫組織化學結果判定 由兩位高年資病理醫(yī)師分別對染色結果進行評判，每個點隨機選取10個高倍視野（×400），每野計數500～1 000個細胞。從兩方面進行計分，一方面據染色強度：無著色0分，淡黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分；另一方面據陽性細胞數計分：1%～10%為1分，11%～50%為2分，51%～75%為3分，76%及以上為4分。兩項評分相乘為最終結果：3分以下為陰性（-），3分為弱陽性（+），4分為中陽性（++），5分及以上為強陽性（+++）［8］。

1.2.3 細胞培養(yǎng) 本實驗4株肝癌細胞株7721、HepG2、Huh7及LM3均來源于南方醫(yī)科大學肝病研究中心。7721細胞株培養(yǎng)于含10%胎牛血清的RP?MI 1640培養(yǎng)液中，其余細胞株均培養(yǎng)于DMEM高糖培養(yǎng)基中（試劑及血清均來自于美國gibco公司），置于37℃、5%CO2的相對飽和的培養(yǎng)箱中（美國Thermo公司）傳代培養(yǎng)，實驗細胞均處于對數生長期。

1.2.4 質粒及siRNA轉染

1.2.4.1 質粒轉染 肝癌細胞接種于含10%胎牛的培養(yǎng)基中，置于37℃，含5%CO2飽和培養(yǎng)箱中培育。選取對數生長期細胞，制備密度為1×106/mL的單細胞懸液，接種于6孔培養(yǎng)板中，培養(yǎng)24 h后細胞長至80%融合時進行轉染，按照Lipo2000試劑盒說明操作轉染FAT10過表達及對照質粒，6 h后更換新鮮含胎牛血清的培養(yǎng)基（實驗前均經轉染后48 h Western blot驗證轉染效率）。

1.2.4.2 siRNA轉染 siRNA干擾 FAT10（NM_006398）基因表達，干擾序列為：sense 5'-GAGACUA AGACGGGUAUAATT-3'，antisense 5'-UUAUACCCG UCUUAGUCUCTT-3'（上海吉瑪基因公司），嚴格按試劑盒說明書用脂質體RNA-iMAX轉染肝癌細胞（In?vitrogen），肝癌細胞于轉染前12 h被鋪于6孔板，50 pmolsiRNA或對照序列及5 μL的脂質體RNAiMAX被混合于Opti-MEM培養(yǎng)基中，室溫孵育20 min，加入6孔板中培養(yǎng)48h備用（實驗前均經轉染后48 h Western blot驗證干擾效率）。

1.2.5 Western blot分析 用RIPA試劑裂解（含蛋白酶及磷酸酶抑制劑）以上4株細胞，BCA法測定蛋白質濃度。將等量（30μg）蛋白質的全細胞裂解液經SDS-PAGE凝膠電泳后，將分離出的蛋白電轉到PVDF膜上。印跡膜在含5%脫脂奶粉的TBST緩沖液內室溫封閉1 h各自加入兔抗人FAT10（美國AB?cam公司，1∶5 000稀釋）、total RhoA（美國ABcam公司，1：500稀釋）及active-RhoA（美國ABcam公司，1∶500稀釋），ROCK（美國ABcam公司，1：10 000稀釋）βactin單克隆抗體（美國ABcam公司，1∶7 500稀釋，作為內參），4℃過夜孵育，TBST洗膜3次，15 min/次，滴加HRP標記的抗兔二抗（美國ABcam公司，1∶15 000稀釋），室溫孵育1 h，TBST洗膜3次，ECL化學發(fā)光法檢測（美國Thermo公司）。實驗重復3次。

1.2.6 免疫熒光 細胞爬片于4%多聚甲醛固定10 min，PBS漂洗3次（5 min/次），0.25%Trixton通透5 min，PBS漂洗3次（5 min/次），5%BSA封閉50 min，F-action一抗（美國ABcam公司，1∶50），4℃孵育過夜，PBS漂洗3次，5 min/次，羊抗兔單克隆熒光二抗（江蘇碧云天生物技術公司，1∶100）孵育1.5 h，正置熒光顯微鏡觀察F-actin變化并采圖。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 16.0軟件進行數據處理。RhoA及FAT10與患者臨床特征間的相關性，及二者間的相關性采用χ2檢驗，不同分組資料的生存分析采用K-M生存分析法進行，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 active-RhoA及FAT10同HCC患者轉移及復發(fā)密切相關

免疫組織化學結果顯示active-RhoA蛋白表達水平同HCC轉移（P=0.036）及復發(fā)（P=0.026）密切相關，FAT10蛋白表達亦同HCC轉移（P=0.031）及復發(fā)（P=0.004）密切相關（表1）；FAT10高表達者預后明顯差于低表達者（P=0.026），active-RhoA高表達患者預后亦明顯差于低表達者（P=0.019，圖1）。

2.2 FAT10與active-RhoA相關性

免疫組織化學結果顯示FAT10同active-RhoA表達水平呈明顯的正相關（P＜0.001，表2）；且active-Ro?hA與FAT10存在共定位（圖2）。

2.3 FAT10促進活化型RhoA的表達

在FAT10過表達細胞株7721及HepG2中，active-RhoA及ROCK蛋白表達水平明顯高于對照組（圖3）；在FAT10干擾的細胞株Huh7、LM3中active-RhoA及ROCK蛋白表達水平明顯低于對照組（均P＜0.01）。

2.4 7721細胞過表達FAT10后細胞骨架蛋白FAT10的變化

對照組肝癌細胞株7721 F-actin表達較弱，細胞膜染色不連續(xù)，胞質中蛋白表達呈云絮狀，過表達FAT10后細胞漿內F-actin熒光表達較弱，膜熒光表達明顯增強，形態(tài)連續(xù)均勻（圖4）。

表1 108例肝癌患者臨床資料和active-RhoA及FAT10表達相關性分析Table 1 Clinical characteristics of 108 HCC patients and their correlation with active-RhoA and FAT protein expression level

圖1 108例來自于不同active-RohA和FAT10分組HCC患者的生存分析Figure 1 Survival analysis of 108 HCC patients from different active-RhoA and FAT10 groups

表2 FAT10同active-RhoA間相關性分析Table 2 Correlation between FAT10 and active-RhoA

圖2 FAT10與active-RhoA的免疫組化共定位（IHC×400）Figure 2 Co-location of FAT10 and active-RhoA by IHC（IHC×400）

圖3 Western blot檢測不同HCC細胞株過表達/干擾FAT10后RhoA/ROCK蛋白水平的變化（n=3）Figure 3 Western blot showed changes in RhoA and ROCK in different HCC cells after overexpression or interference of FAT10(n=3)

圖4 采用免疫熒光檢測過表達FAT10的7721細胞骨架蛋白F-actin（×400）Figure 4 F-actin of 7721 cells detected by immunofluoresence after FAT10 overexpression（×400）

3 討論

FAT10位于人Ⅰ類主要組織相容性復合體染色體位點中，屬泛素樣蛋白家族［5］，目前鑒定的泛素樣家族成員主要有：NEDD8、SUMO、ISG15、ATG8、ATG12和URM1，這一家族蛋白參與細胞分化、DNA損傷修復、自噬、信號轉導、胚胎發(fā)育等多種重要的細胞生命活動，無疑FAT10紊亂會導致惡性腫瘤的發(fā)生及發(fā)展。目前已證實，FAT10在直腸癌、胃癌和婦科腫瘤中明顯高表達［9-13］，在肝癌中的高表達率甚至達90%［14］；對藥物誘導性肝癌的研究表明FAT10參與肝臟癌前病變及腫瘤的形成［15-16］；分子機制探討則表明：FAT10是p53重要的下游靶基因，在p53缺陷細胞中FAT10的異常表達可能直接導致腫瘤發(fā)生，而且FAT10還可在有絲分裂期間非共價結合許多腫瘤中共有的紡錘體檢測點蛋白MAD2，導致染色體穩(wěn)定性下降，致惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展［17］；本研究及南昌大學 邵 江 華等闡明：FAT10 可通過 Akt/GSK3β/βcatenin通路或直接作用于β-catenin促進肝癌的侵襲及轉移［8，18］。本研究證實：FAT10同HCC患者侵襲、轉移密切相關，且FAT10高表達患者預后明顯差于FAT10低表達患者，進一步明確了FAT10在肝癌侵襲、轉移中的作用，也為其在肝癌預后預測及評估中的價值提供了新的依據。

RhoA屬于小G蛋白Rho家族的重要成員，在細胞骨架蛋白（F-actin）重構的調控中具有重要作用，參與細胞形態(tài)結構變化、黏附及遷移運動等多種生物學過程［3-4］。多種惡性腫瘤如肺癌、結腸癌、乳腺癌中存在RhoA的高表達［18］，且其表達水平與乳腺癌的組織病理分級和淋巴轉移呈正相關，可作為乳腺癌重要的預后預測指標［19］；靜息時，RhoA位于細胞質，腫瘤細胞受外因刺激時，RhoA被激活并轉位至細胞膜，活化的RhoA作用于下游效應蛋白Rho相關激酶（Rho associated kinase，ROCK）或inDia，進而調節(jié)細胞骨架重構，促腫瘤發(fā)生侵襲和轉移［20］，乳腺癌研究證實靶向RhoA的miRNA-133可抑制RhoA蛋白的表達并抑制癌細胞的侵襲及轉移［21］。上述研究均提示了RhoA在腫瘤侵襲、轉移中的重要作用，但是否FAT10促進肝癌侵襲、轉移由RhoA介導，尚不明確，本研究結果顯示：active-RhoA高表達患者預后明顯差于低表達者；且FAT10的表達同active-RhoA密切相關，二者存在一致的共定位。Western blot檢測的結果亦表明：過表達FAT10促進肝癌細胞株active-RhoA及其下游細胞骨架調控分子Rock的表達，干擾FAT10則抑制活化型RhoA及ROCK蛋白的表達。這提示FAT10影響肝癌細胞的侵襲、轉移可能通過其作用于RhoA并活化RhoA-ROCK通路介導F-actin是細胞骨架結構的物質基礎，在細胞侵襲遷移中起著重要的支架作用［4］。既往研究均缺乏FAT10作用于F-actin的直接證據，本研究免疫熒光的結果顯示：過表達FAT10促進肝癌細胞株7721 F-actin的表達，并且使F-actin連續(xù)表達于肝癌細胞膜，這為FAT10促進肝癌細胞的侵襲、遷移提供了物質可能。

綜合本課題組已發(fā)表的數據及上述試驗結果，FAT10可作為HCC預后預測較有潛力的指標；且FAT10影響HCC侵襲、轉移可能通過增加活化型RhoA，及其下游效應蛋白ROCK的表達，進而促進細胞骨架蛋白F-actin的表達和分布來實現。另外，本課題組及其他學者研究證實FAT10可直接作用于βcatenin介導肝癌細胞的侵襲及轉移，且有報道認為β-catenin對RhoA-ROCK通路亦存在一定的調控作用［22-23］，因此推測FAT促肝癌細胞侵襲轉移的作用可能通過直接作用于β-catenin進而活化RhoA-ROCK通路，但目前缺乏直接的證據，有待進一步研究。

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