隱匿性HBV感染在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病中的作用研究*

王琦俠 倪慶仁 戴進(jìn)前 郭亮 謝佳 任婧婧

近年來，多發(fā)性骨髓瘤（multiple myeloma，MM）的發(fā)病率逐年上升［1］。MM是發(fā)生于終末分化階段B細(xì)胞（漿細(xì)胞）的惡性淋巴瘤，以骨髓中大量漿細(xì)胞克隆性增生為顯著特征。到目前為止，其確切的發(fā)病危險(xiǎn)因素仍不清楚，但是既往研究表明，MM的發(fā)生與環(huán)境和遺傳因素均有關(guān)聯(lián)［2］。

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）感染和復(fù)制已被證實(shí)是肝癌主要病因之一。隱匿性HBV感染（occult hepatitis B virus infection，OBI）是指患者血清中HBsAg陰性卻可用敏感的技術(shù)在其外周血、肝臟等組織中檢測到HBV DNA的存在［3］。最近有一些臨床和流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染可能也是MM發(fā)病的重要危險(xiǎn)因素之一［4-6］。然而，既往有關(guān)MM發(fā)病危險(xiǎn)因素的研究尚未見有與HBV隱匿性感染相關(guān)的報(bào)道。本研究采用病例對(duì)照研究方法，通過OBI的檢測和分析，試圖探討HBV隱匿性感染在MM發(fā)病中的作用。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象

將2010年10月至2014年10月西安市中心醫(yī)院、陜西省人民醫(yī)院、西安市交通大學(xué)西北醫(yī)院等5所三級(jí)甲等醫(yī)院新發(fā)的MM患者連續(xù)納入病例組。所有患者均依照《中國多發(fā)性骨髓瘤診治指南（2008）》標(biāo)準(zhǔn)診斷，ISS（international staging system）分期按國際骨髓瘤工作組（IMWG）標(biāo)準(zhǔn)。收集患者完整的實(shí)驗(yàn)室檢查資料，主要包括骨髓穿刺結(jié)果、細(xì)胞遺傳學(xué)檢測結(jié)果、免疫表型、血常規(guī)、肝腎功能、β2-微球蛋白、血清輕鏈及影像學(xué)檢查結(jié)果等。在上述不同醫(yī)院隨機(jī)選擇對(duì)照組，要求與MM病例組在性別上一致、年齡相差±5歲的同期住院非腫瘤患者。所有研究對(duì)象均采集外周血5 mL，分離血清-80℃凍存?zhèn)錂z，并簽署知情同意書。本研究已通過西安市中心醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審批。

1.2 檢測方法

1.2.1 外周血HBsAg檢測 HbsAg檢測采用酶聯(lián)免疫法（北京萬泰生物技術(shù)有限公司），具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。HBsAg結(jié)果判斷：樣品OD值/陰性對(duì)照平均OD值≥2.1則判斷為陽性，否則為陰性。

1.2.2 外周血OBI檢測 1）磁珠法提取HBV DNA血清HBsAg陰性者的HBV DNA提取采用磁珠法（長春市志昂生物科技有限公司），具體操作按試劑盒說明書進(jìn)行。先加入樣本血清200 μL，在King Fisher DUO自動(dòng)提取儀（美國Thermo Fisher公司）中提取30 min，最終提取產(chǎn)物約45 μL。2）巢式PCR擴(kuò)增S區(qū)、C區(qū)采用多重巢式PCR法檢測外周血清中HBV DNA基因組中的S區(qū)（S1、S2、S3、S4）、C區(qū)（C1、C2、C3、C4）基因編碼區(qū)片段，擴(kuò)增引物見表1。巢式PCR分別擴(kuò)HBV DNA的PCR擴(kuò)增體系總體積50 μL，包括 23 μL 水，5 μL 10×PCR buffer（含 15 mmol/L Mg?Cl2），4 μL 10 mmol/L dNTP，1.5 μL上、下游引物（S1、S2/C1 和 C2），0.3 μL EX-Taq 酶，和 15 μL DNA 模板。擴(kuò)增條件為預(yù)變性94℃ 40 s；變性94℃30 s，55℃ 50 s，72℃ 60 s，循環(huán)35次；72℃ 5 min。取第1次PCR反應(yīng)產(chǎn)物5 μL進(jìn)行第2次擴(kuò)增，反應(yīng)條件與第1次反應(yīng)相同。產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳。采用HBV DNA陽性血漿和陰性血漿作為對(duì)照。判斷標(biāo)準(zhǔn)：S區(qū)和C區(qū)片段擴(kuò)增均為陽性者，判定為隱匿性HBV 感染［7］。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

所有數(shù)據(jù)使用EpiData軟件建立數(shù)據(jù)庫雙錄入，采用 SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件（SPSS Inc，Chicago，Illi?nois，USA）進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。組間率的比較用χ2檢驗(yàn)或Fisher精確概率法；HBV與MM發(fā)病的關(guān)系分析采用Logistic回歸分析。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 人口學(xué)特征

MM病例組（185例）和對(duì)照組（182例）人群在性別、年齡、受教育程度、婚姻狀況及其居住地方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＞0.05，表2）。

表1 巢式PCR檢測OBI的引物序列Table 1 Primer sequences of nested PCR for OBI detection

表1 巢式PCR檢測OBI的引物序列（續(xù)表1）Table 1 Primer sequences of nested PCR for OBI detection

2.2 HBV感染與MM發(fā)病的關(guān)聯(lián)分析

185例MM患者中HBsAg陽性者15例（8.1%），182例對(duì)照組8例（4.4%），兩組間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=2.58，P＞0.05）；OR 值 為 2.58（95%CI：0.84～4.49），P＜0.05；170例HBsAg陰性的MM患者中OBI感染者6例（3.5%），174例對(duì)照組中1例（0.6%），兩組間差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；OR值為6.44（95%CI：0.77～64.06），P＜0.05。

將HBsAg陽性者與OBI陽性者合并，MM組HBV感染率為11.35%（21/185），對(duì)照組為4.95%（9/182），兩組HBV總感染率存在顯著性差異（χ2=5.02，P＜0.05）。OR值為2.46（95%CI：1.10～5.53），P＜0.05，見表3。

2.3 MM患者感染HBV與否的臨床特征比較

在MM患者中，HBV感染者與未感染者之間在性別和年齡未見有明顯差異（均P＞0.05）；但在ISS分期中，HBV感染者Ⅲ期的比例明顯高于未感染HBV組（85.7%vs.60.4%，χ2=5.15，P＜0.05）。實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)中，血紅蛋白在兩組間未見明顯差異，白蛋白在感染者中較未感染者明顯減低（χ2=5.60，P＜0.05），κ/λ輕鏈比值在感染組也明顯低于未感染組（P＜0.05，表4）。

表2 MM病例組與對(duì)照組的均衡性檢驗(yàn) n（%）Table 2 Balance test of MM patients(185 cases)and control group(182 cases)

表3 HBV不同感染情況與MM患者發(fā)病的關(guān)系Table 3 Relationship between HBV infection and MM incidence

表4 MM患者中HBV感染的臨床特征 n（%）Table 4 Clinical characteristics of HBV infection in patients with MM

表4 MM患者中HBV感染的臨床特征（續(xù)表4）Table 4 Clinical characteristics of HBV infection in patients with MM

3 討論

MM的病因目前尚無定論。多年來流行病學(xué)與臨床研究均表明，MM的發(fā)病和其他腫瘤一樣與諸多危險(xiǎn)因素有關(guān)，如腫瘤家族史、肥胖、特殊職業(yè)暴露史、飲食習(xí)慣、吸煙、飲酒及染發(fā)等［8-10］，是多病因交互作用所致。最近有一些臨床和流行病學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染可能也是MM發(fā)病重要的危險(xiǎn)因素之一［3-5］。但國內(nèi)外一些研究結(jié)果相互矛盾，2012年Becker報(bào)道了在歐洲6個(gè)國家進(jìn)行的淋巴瘤多中心病例對(duì)照研究，在187例MM患者中，通過檢測HBsAg、抗-HBc和抗-HBs來區(qū)分病例和對(duì)照組的HBV當(dāng)前或過去感染和免疫接種情況，發(fā)現(xiàn)過去曾有HBV感染與MM發(fā)病呈正相關(guān)（OR=1.97，95%CI：1.16～3.37）［5］；在我國2012年也有研究報(bào)道發(fā)現(xiàn)MM患者HBsAg陽性率明顯高于急性白血病患者（19.4%vs.12.0%，P=0.014）［11］，提示HBV感染可能在MM發(fā)病中發(fā)揮著重要作用。王立茹等［12］對(duì)363例MM患者進(jìn)行回顧性研究，血清檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)HBsAg陽性率顯著高于健康體檢者感染率（4.4%vs.2.4%，P=0.015）；但倪芳等［13］檢測了198例MM患者乙肝五項(xiàng)及HBV-DNA定量，HBsAg陽性率與對(duì)照組之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（2.6%vs.3.4%，P＞0.05）。本研究結(jié)果也顯示，MM患者與對(duì)照組HBsAg陽性率之間的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。但若將HBV隱匿性感染納入分析，結(jié)果則表明MM患者HBV的總感染率明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），而且感染HBV發(fā)生MM的風(fēng)險(xiǎn)是未感染者的2.46倍（OR=2.46）。

既往研究表明HBV整合于宿主細(xì)胞基因組是免疫逃避的機(jī)制之一，也是HBV在體內(nèi)長期存在的重要原因。HBV除了能整合于肝細(xì)胞，還能整合于外周血免疫細(xì)胞之中，并影響細(xì)胞功能［14］。有研究發(fā)現(xiàn)，盡管OBI病毒載量很低（≤100 IU/mL），但可導(dǎo)致細(xì)胞DNA損傷、氧化應(yīng)激和凋亡增加［15］。該研究認(rèn)為OBI的主要機(jī)制是由于HBV整合到宿主的基因組中并在外周血單核細(xì)胞（PBMC）中持續(xù)存在。OBI對(duì)MM發(fā)病的影響在既往的研究中未見報(bào)道，本研究結(jié)果提示對(duì)研究對(duì)象開展OBI檢測可以更加準(zhǔn)確地反應(yīng)其HBV感染情況。因此，綜合這些研究結(jié)果說明OBI可能在MM發(fā)病中起著一定的作用，值得深入開展研究。需要指出的是，由于本研究采用的是回顧性的病例對(duì)照研究設(shè)計(jì)，尚須進(jìn)一步采用前瞻性研究和實(shí)驗(yàn)研究以驗(yàn)證HBV隱匿性感染與MM之間的因果關(guān)聯(lián)性。

MM患者中有HBV感染者較未感染者伴有更多細(xì)胞遺傳學(xué)異常、肝功能異常和較差的生存期［16］。本研究也發(fā)現(xiàn)伴有HBV感染的Ⅲ期MM患者所占比例較高；與此同時(shí)，和ISS分期同樣有預(yù)后判斷價(jià)值的κ/λ輕鏈比值在HBV感染者較未感染者中減低，亦提示感染者預(yù)后較差［17］。本研究結(jié)果還顯示，伴有HBV感染的MM患者肝臟功能受損，其原因可能是MM的化療中一般都包括糖皮質(zhì)類固醇激素，這可能會(huì)導(dǎo)致HBV再激活，加重肝功能的損害，甚至爆發(fā)重癥肝炎而威脅生命。因此，對(duì)于已感染HBV的MM患者應(yīng)在化療前開始預(yù)防性應(yīng)用抗病毒復(fù)制的藥物，以有效地預(yù)防HBV再激活［18］，尤其是要對(duì)HBsAg陰性的MM患者在化療前也應(yīng)開展OBI的篩查，避免出現(xiàn)HBV再激活而影響生存期。

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