重慶一例豬源及雞源大腸桿菌的分離鑒定和藥敏試驗(yàn)

孫剛?cè)?，敖光?/p>

（1.重慶市北碚區(qū)畜牧獸醫(yī)局天府獸醫(yī)站，重慶 北碚 400700；2.重慶市北碚區(qū)畜牧獸醫(yī)局，重慶 北碚 400700）

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 參考菌株。大腸桿菌CQYB3CE001、金黃色葡萄球菌MRSA252、沙門氏菌YBCSA015，由西南大學(xué)丁紅雷副教授惠贈(zèng)。

1.1.2 主要試劑。麥康凱瓊脂培養(yǎng)基和麥康凱液體培養(yǎng)基購自杭州微生物試劑有限公司，DNA Marker III購自天根生化科技有限公司，2×Taq Master Mix購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.1.3 藥敏試紙。32種藥敏試紙購自杭州微生物試劑有限公司和杭州天和微生物試劑有限公司。

1.2 方法

1.2.1 樣品采集。在重慶市北碚區(qū)龍鳳橋鎮(zhèn)采集糞便標(biāo)本共計(jì)15份，包括某豬場(chǎng)豬糞5份和某雞場(chǎng)雞糞10份，每份樣品均保證來自一個(gè)單獨(dú)的動(dòng)物。采集樣品時(shí)用滅菌筷子挑取雞或豬的糞便0.5～1g置于5mL滅菌離心管中，迅速放入裝有冰袋的泡沫箱中，2h內(nèi)運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品處理。

1.2.2 細(xì)菌分離。將盛有糞便的每個(gè)離心管加入3 mL PBS液，振蕩，使糞便充分混勻，然后將其劃線于麥康凱平板上，37℃恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)24h。隨后在每個(gè)麥康凱平板上各挑取一個(gè)具有典型大腸桿菌菌落特征的菌落，再次在麥康凱平板上劃線進(jìn)行純培養(yǎng)。挑取純培養(yǎng)后的菌落，涂片，革蘭氏染色，然后于光學(xué)顯微鏡下觀察細(xì)菌形態(tài)。

1.2.3 分離菌株的PCR檢測(cè)

1.2.3.1 引物設(shè)計(jì)與合成。根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道的大腸桿菌特異性基因phoA，用引物設(shè)計(jì)軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)特異性引物。上游引物phoA-F：5′-CGATTC TGGAAATGGCAAAAG-3′，下游引物 phoA-R：5′-CGT GATCAGCGGTGACTATGAC-3′。引物由 Life Technologies公司合成。

1.2.3.2 模板制備。挑取經(jīng)純培養(yǎng)且有典型大腸桿菌菌落特征的菌落接種于麥康凱液體培養(yǎng)基，37℃下220r/min培養(yǎng)8h。將新鮮培養(yǎng)的菌液2mL 10000r/min離心1min，棄上清；加入1mL ddH2O，重懸，迅速以10000 r/min離心1min，棄上清；加入50μL ddH2O，100℃處理10min。保存于-20℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.3 PCR 反應(yīng)體系。2×Taq Master Mix 12 μL，phoA-F（10μM）2μL，phoA-R（10μM）2μL，模板 1μL，ddH2O 7μL，總反應(yīng)體系 24μL。

1.2.3.4 PCR反應(yīng)條件。94℃預(yù)變性5min；94℃變性20s，58℃退火 20s，72℃延伸 45s，共 30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸6min。反應(yīng)結(jié)束后取5μL反應(yīng)產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像系統(tǒng)儀上觀察結(jié)果。以大腸桿菌CQYB3CE001為陽性對(duì)照，金黃色葡萄球菌MRSA252和沙門氏菌YBCSA015作為陰性對(duì)照。

1.2.4 藥物敏感性試驗(yàn)。根據(jù)《抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)》進(jìn)行判定。37℃培養(yǎng)18h后觀察結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 菌株分離情況、菌落形態(tài)及染色特征 經(jīng)純培養(yǎng)的細(xì)菌在麥康凱平板上呈圓形、扁平、邊緣整齊、表面光滑、濕潤的鮮桃紅色菌落。將此15株細(xì)菌進(jìn)行革蘭氏染色后鏡檢，發(fā)現(xiàn)15株臨床分離菌均為散在排列的兩端鈍圓的革蘭氏陰性桿菌。無論菌落形態(tài)還是菌株形態(tài)，均提示這些細(xì)菌可能為大腸桿菌。

2.2 分離菌株的PCR鑒定 PCR檢測(cè)結(jié)果表明陽性對(duì)照和所有臨床分離株均能擴(kuò)增出720bp的預(yù)期條帶，陰性對(duì)照沒有擴(kuò)增出任何片段（見圖1）。因此，可判斷所有15株細(xì)菌均為大腸桿菌。

圖1 大腸桿菌PCR鑒定結(jié)果

2.3 藥物敏感性試驗(yàn) 試驗(yàn)結(jié)果表明：15株大腸桿菌均對(duì)青霉素G、氨芐西林、阿莫西林、羧芐青霉素、頭孢拉定、頭孢唑啉、四環(huán)素、林可霉素、羅紅霉素、甲氧芐氨嘧啶、磺胺甲基異惡唑、萬古霉素12種藥物耐藥，特別是對(duì)所有的青霉素類抗生素和磺胺類藥物耐藥。10株雞源性大腸桿菌對(duì)頭孢哌酮、卡那霉素、新霉素、恩諾沙星、乳酸環(huán)丙沙星、氟苯尼考完全耐藥或中度敏感，大部分菌株對(duì)妥布霉素、紅霉素、鏈霉素、呋喃唑酮、慶大霉素和氧氟沙星耐藥；而5株豬源性大腸桿菌僅對(duì)諾氟沙星、丁胺卡那霉素、妥布霉素、慶大霉素4種藥物敏感。15株細(xì)菌的耐藥率在43.75%～93.75%之間，14株細(xì)菌的耐藥率超過50%，超過2/3的菌株對(duì)23種藥物耐藥。通過表1可見，32種抗菌藥物的耐藥菌株比例從13.3%到100%不等，所有菌株均對(duì)其中12種藥物耐藥，占到所測(cè)試藥物的37.5%。

3 討論

本試驗(yàn)首先建立了一種用于大規(guī)模分離并快速鑒定畜禽糞便中大腸桿菌的方法。phoA基因存在于所有大腸桿菌中，而且在不同菌株間的序列有高度保守性，因此根據(jù)該基因在不同菌株間保守的核苷酸序列設(shè)計(jì)引物進(jìn)行PCR檢測(cè)，可以鑒定出是否是大腸桿菌。另外，本試驗(yàn)通過高溫水煮的方法獲得了PCR擴(kuò)增的DNA模板，省時(shí)省力，降低了實(shí)驗(yàn)成本，適合基層獸醫(yī)站應(yīng)用。用合成的特異性引物采用PCR法擴(kuò)增大腸桿菌、沙門氏菌、金黃色葡萄球菌中的phoA基因，結(jié)果大腸桿菌擴(kuò)增出720bp左右的條帶，沙門氏菌和金黃色葡萄球菌未擴(kuò)增出相應(yīng)條帶，證明phoA為大腸桿菌特有的基因。

表1 分離菌株對(duì)不同抗菌藥物的耐藥比例

本實(shí)驗(yàn)中所有分離菌株對(duì)12種抗菌藥物完全耐藥，超過2/3的菌株對(duì)超過23種藥物耐藥。如此之高的耐藥率大大超出了我們的預(yù)料，說明采樣地區(qū)的養(yǎng)殖場(chǎng)內(nèi)的大腸桿菌耐藥率相當(dāng)高。因此，在今后的工作中，基層獸醫(yī)站應(yīng)加強(qiáng)對(duì)本轄區(qū)內(nèi)養(yǎng)殖場(chǎng)抗生素使用的監(jiān)管，根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果指導(dǎo)養(yǎng)殖場(chǎng)制定合理的用藥方案，正確有效地使用抗菌藥物。

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