粒毛盤菌YM404黑色素發(fā)酵、純化及其染色效果

郭賡藝， 蔣 科， 李 蘭， 殷坤才， 葉 明

（1.合肥工業(yè)大學(xué) 生物與食品工程學(xué)院，安徽 合肥 230009；2.馬鞍山市安康菌業(yè)有限公司，安徽 馬鞍山 243000）

0 引 言

黑色素是通過多羥基酚氧化而成的構(gòu)造不規(guī)則的類多酚聚合體［1］，存在于動物、植物及微生物中，通常對溫度、pH 值、光照等較穩(wěn)定［2－3］。利用微生物發(fā)酵產(chǎn)黑色素，成本較低，易于工業(yè)化。目前人們提取黑色素常用的方法是堿提酸沉法，但難以獲得黑色素的單一組分，對其進行結(jié)構(gòu)解析比較困難［4］。研究表明，采用分級分離的方法可以獲得黑色素均一性組分［5］。

目前市場上銷售的染發(fā)劑多為氧化型染發(fā)劑，其主要原料對苯二胺及其衍生物具有一定的毒性、致敏性以及致癌性，長期使用可能導(dǎo)致癌癥［6］。有學(xué)者以五倍子、黑芝麻、兒茶等原料制備染發(fā)劑，但其提取液對天然白發(fā)的染發(fā)效果較差［7］。因此，研究與開發(fā)天然染料的無毒染發(fā)劑具有重要的應(yīng)用價值。

粒毛盤菌屬為腐生性真菌，深層發(fā)酵后可產(chǎn)生黑色素，但得率較低［8］。目前關(guān)于粒毛盤菌黑色素均一性組分的報道并不多。本文對粒毛盤菌YM404產(chǎn)黑色素的發(fā)酵條件進行研究，經(jīng)分級分離后獲得其胞外黑色的均一性組分，對其染色效果進行了評價，為粒毛盤菌黑色素資源的開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 菌株

粒毛盤菌Lachnum YM－404菌株，子實體采集自中國云南省，由合肥工業(yè)大學(xué)微生物資源與應(yīng)用研究室分離保藏。

1.2 培養(yǎng)基

固 體 培 養(yǎng) 基：ρ（葡 萄 糖）＝20g／L，ρ（酵母膏）＝5g／L，ρ（蛋 白 胨 ）＝ 5g／L，ρ（瓊脂）＝15g／L。

液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基：ρ（葡萄糖）＝20g／L，ρ（蛋白胨）＝5g／L，V（蒸餾水）＝1 000mL。

1.3 試劑與儀器

葡聚糖凝膠 Sephadex G－100，購自美國Pharmacia公司；海飛絲去屑洗發(fā)露，廣州寶潔有限公司；其他試劑均為分析純，購自合肥博美生物科技有限責(zé)任公司。

立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海申安醫(yī)療器械廠；ZHWY－2102氣浴搖床，蘇州凈化設(shè)備有限公司；冷凍干燥機，北京博醫(yī)康實驗儀器有限公司；752紫外可見分光光度計，上海菁華科技儀器有限公司；ACQUITY UPLC LUT液質(zhì)聯(lián)用儀，美國Waters公司。

1.4 黑色素發(fā)酵條件

用打孔器接種直徑6mm、菌齡一致的YM404菌塊于裝有150mL液體發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的250mL三角瓶中，26℃、160r／min培養(yǎng)10d。發(fā)酵液抽濾2～3次，收集發(fā)酵液，在520nm處測定其吸光度值，吸光度值越高，表明黑色素產(chǎn)量越高。菌絲體在50℃下烘干并且測定生物量（即菌絲體干質(zhì)量），生物量越大，表明YM404生長速度越快。以吸光度值和生物量為指標，考察不同碳源（葡萄糖、麥芽糖、可溶性淀粉）、氮源（蛋白胨、胰蛋白胨、酵母浸膏）以及不同濃度L－DOPA、谷胱甘肽對YM404生長及產(chǎn)黑色素的影響，確定最佳發(fā)酵條件［8］。

1.5 分級分離

［9］的方法，獲得粒毛盤菌 YM404黑色素（LEM404）。參考文獻［7］的方法，采用葡聚糖G－100凝膠柱，以0.5%NaCO3為洗脫液，LEM404的質(zhì)量濃度為20mg／mL，進樣量為1mL，控制流速為300μL／min，每管收集5mL，柱溫保持20℃。收集洗脫液于520nm下測定吸光度值，繪制其洗脫曲線。收集主要組分經(jīng)減壓濃縮后，于截留分子量為200Da的透析袋中透析48h，冷凍干燥后獲得LEM404的均一組分。

1.6 質(zhì)譜分析

采用質(zhì)譜聯(lián)用儀對LEM 404均一組分（LEM404－a）進行質(zhì)譜分析。分析條件［10］：電噴霧離子源，離子源溫度為110℃；掃描方式為正離子V模式；質(zhì)核比的掃描范圍為100～1 000；毛細管電壓為2 400kV；去溶劑溫度為350℃；去溶劑氣流量為600L／h；錐孔電壓為60V；錐孔氣流量為40L／h。

1.7 染色效果

參考文獻［11］的方法配制染發(fā)劑（A劑、B劑），其中配方I、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ以及Ⅴ的A劑水相中的LEM 404－a和對苯二胺的添加量見表1所列，其他成分與文獻［11］一致；配方Ⅵ只添加0.8%LEM 404－a。取同一人的白發(fā)分別浸入各配方的染發(fā)劑中，于35℃恒溫箱保溫30min，觀察染色結(jié)果。然后將染色后的頭發(fā)浸入洗發(fā)劑（2mL洗發(fā)露與50mL蒸餾水混合）中自然保溫24h，觀察其是否褪色［2］。

表1 各配方中LEM 404－a和對苯二胺的質(zhì)量分數(shù) %

2 結(jié)果與討論

2.1 YM404黑色素發(fā)酵條件研究

2.1.1 碳源對生物量及黑色素產(chǎn)量的影響

以麥芽糖作為碳源時，YM404菌株發(fā)酵液520nm處的吸光度值與生物量均最高，如圖1a所示，表明麥芽糖為YM404菌株生長及產(chǎn)黑色素的最適碳源。隨著麥芽糖質(zhì)量濃度的上升，發(fā)酵液吸光度值與生物量均呈上升趨勢，如圖1b所示，當麥芽糖質(zhì)量分數(shù)高于25g／L時，兩者均趨于穩(wěn)定，選取麥芽糖最佳質(zhì)量濃度為25g／L。

圖1 碳源和麥芽糖對YM404生物量及黑色素產(chǎn)量的影響

2.1.2 氮源對生物量及黑色素產(chǎn)量的影響

氮源對YM404菌株生物量及黑色素產(chǎn)量的影響如圖2所示。

從圖2可看出，以酵母膏作為氮源時，發(fā)酵液在520nm處吸光度值最高。而以蛋白胨作為氮源時YM404菌株生物量達最大，但吸光度值較低。由于實驗的主要目的在于提高黑色素的得率，因此以吸光度值為主要指標，選擇酵母膏作為最適氮源。隨著酵母膏質(zhì)量濃度上升，發(fā)酵液吸光度值與生物量均呈上升趨勢，當酵母膏的質(zhì)量濃度高于6g／L時，兩者均趨于穩(wěn)定，選取酵母膏最佳質(zhì)量濃度為6g／L。

圖2 氮源及酵母膏對YM404菌株生物量及黑色素產(chǎn)量的影響

2.1.3 L－DOPA與谷胱甘肽對YM404的影響

研究表明，二羥基苯丙氨酸（DOPA）和谷胱甘肽為黑色素合成途徑的中間產(chǎn)物［12］，在發(fā)酵液中添加L－DOPA與谷胱甘肽，可能對YM404黑色素產(chǎn)量有一定影響，如圖3所示。

從圖3a可以看出，不添加L－DOPA的空白對照組的吸光度值為0.327，生物量為0.927g。隨著L－DOPA濃度的增加，發(fā)酵液的吸光度與生物量均呈先上升后下降趨勢，當L－DOPA的濃度為1.25mmol／L時，發(fā)酵液吸光度值達到最大，為0.557，當濃度為0.75mmol／L時，生物量最大，為1.231g。這表明添加適量的L－DOPA有益于YM404菌株生長及黑色素的積累，過量時則起抑制作用。

圖3 L－DOPA與谷胱甘肽濃度對YM404生物量及黑色素產(chǎn)量的影響

由圖3b可看出，不添加谷胱甘肽的空白對照組的吸光度為0.351，生物量為0.827g。隨著谷胱甘肽濃度的增加，YM404發(fā)酵液吸光度值與生物量均呈先上升后下降趨勢，當濃度為0.75mmol／L時，吸光度和生物量都達到最大。當谷胱甘肽濃度繼續(xù)增大時，吸光度值與生物量下降，表明過量添加谷胱甘肽會抑制YM404菌株生長及黑色素積累。與L－DOPA對YM404菌株生長及產(chǎn)黑色素的影響相比，添加谷胱甘肽對其影響較不顯著，因此選擇在培養(yǎng)基中添加1.25mmol／L L－DOPA。

綜上所述，確定LEM404的最佳發(fā)酵條件如下：麥芽糖質(zhì)量濃度為30g／L，酵母膏質(zhì)量濃度為 6g／L，L－DOPA 濃 度 為 1.25mmol／L，160r／min，26℃恒溫振蕩培養(yǎng)10d。采用上述條件發(fā)酵粒毛盤菌YM404，可得LEM404的得率為3.45g／L。

2.2 LEM404的分級分離

LEM404經(jīng)葡聚糖G－100凝膠柱洗脫，在第1～20管內(nèi)出現(xiàn)1個吸收峰，如圖4所示，收集前20管洗脫液，經(jīng)透析、冷凍干燥后得均一性黑色素LEM404－a，其占LEM404總量的43.7%。

圖4 LEM404葡聚糖凝膠洗脫曲線

2.3 LEM404－a的質(zhì)譜分析

LEM404－a質(zhì)譜如圖5所示，圖5中，［M］＋、［M＋H］＋的準分子離子峰的質(zhì)核比分別為432.18和433.18，可確定LEM404－a的分子量為432.18。

圖5 LEM404－a質(zhì)譜圖

2.4 LEM404的染色效果

各配方染發(fā)劑的染色效果見表2所列。表2表明，添加LEM404－a有助于提高染發(fā)劑的染色效果，并可減少對苯二胺的使用量；當保持對苯二胺的質(zhì)量分數(shù)不變時，增加LEM404－a的量，可獲得最佳染色效果；而僅以LEM404－a溶液作為染發(fā)劑幾乎不著色，這是由于天然黑色素較難滲透到皮層，導(dǎo)致其牢固度不理想，因此需少量添加對苯二胺作為滲透劑輔助染色［6］。

本研究配方Ⅴ中對苯二胺的質(zhì)量分數(shù)僅為0.2%，遠低于行業(yè)標準（＜6%），也低于市場上現(xiàn)有的天然染發(fā)劑中對苯二胺的平均質(zhì)量分數(shù)（約為1%）［13］，表明以LEM404－a為原料制備的配方Ⅴ染發(fā)劑具有染色效果好且毒性低的優(yōu)點。

表2 LEM404－a的染色效果

3 結(jié) 論

粒毛盤菌YM404產(chǎn)胞外黑色素的發(fā)酵條件為：ρ（麥芽糖）＝30g／L，ρ（酵母膏）＝6g／L，c（L－DOPA）＝1.25mmol／L，得率為3.45g／L；LEM404經(jīng)分級分離后，獲得均一性黑色素LEM404－a，其占LEM404總量的43.7%，相對分子質(zhì)量為432.18，表明葡聚糖凝膠柱分級分離的方法可獲得黑色素均一性組分；LEM404－a本身染色效果差，但以其為原料，添加少量對苯二胺（0.2%）制備的染發(fā)劑染色效果好且毒性低，是一種安全有效的染發(fā)劑，具有廣闊的市場應(yīng)用前景。

［參考文獻］

［1］ Latocha M，Chodurek E，Kurkiewicz S，et al.Pyrolytic GCMS analysis of melanin from black，gray and yellow strains ofDrosophilamelanogaster［J］.Journal of Analytical and Applied Pyrolysis，2000，56：89－98.

［2］ Ye M，Wang Y，Qian M S，et al.Preparation and properties of the melanin fromLachnumsingerianum［J］.International Journal of Basic and Applied Sciences，2011，11（3）：51－58.

［3］ Dong C，Yao Y.Isolation，characterization of melanin derived fromOphiocordycepssinensis，an entomogenous fungus endemic to the Tibetan Plateau［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2012，113：474－479.

［4］ Pratibha J，Pranali B，Solimabi W，et al.The fungusGliocephalotrichumsimplexas a source of abundant，extracellular melanin for biotechnological applications［J］.World Journal of Microbiology and Biotechnology，2012，28：505－512.

［5］ Olennikov D N，Agafonova S V，Stolbikova A V，et al.Melanin ofLaetiporussulphureus（Bull.Fr.）Murr sterile form［J］.Applied Biochemistry and Microbiology，2011，47：298－303.

［6］ 王 璐，陳渭川，劉小煥，等.天然植物染發(fā)劑研究現(xiàn)狀［J］.衡陽師范學(xué)院學(xué)報，2009，30（6）：85－88.

［7］ 王奎堂，陳錦儀.用兒茶及其他中藥制備無毒不致癌染發(fā)劑［J］.香料香精化妝品，2012，13（1）：47－49.

［8］ 葉 明，許慶平，陳 曉，等.LachnumYM－223產(chǎn)黑色素發(fā)酵及其黑色素抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2009，30（17）：185－189.

［9］ Ye M，Chen X，Li G W，et al.Structural characteristics of pheomelanin－like pigment fromLachnumsingerianum［J］.Advanced Materials Research， 2011， 284／285／286：1742－1745.

［10］ Ye M，Wang Y，Guo G Y，et al.Physicochemical characteristics and antioxidant activity of arginine－modified melanin fromLachnumYM－346［J］.Food Chemistry，2012，135：2490－2497.

［11］ 葉 明，汪 燕，王于順.一種粒毛盤菌黑色素染發(fā)劑及其制備方法：中國，201110094762［P］.2012－09－26.

［12］ Magdalena Z，Ewa C，Barbara P.EPR studies of DOPA－melanin complexes with Fe（Ⅲ）［J］.Applied Magnetic Resonance，2011，40：113－123.

［13］ 肖 懷，崔勝男，白志英，等.天然染發(fā)劑中對苯二胺定量分析［J］.大理學(xué)院學(xué)報，2011，10（6）：1－3.