低氧誘導(dǎo)因子-1α 在潰瘍性結(jié)腸炎患者血清和結(jié)腸黏膜中的表達(dá)及意義

許春梅，劉 波，董衛(wèi)國(guó)

1.湖北省醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)醫(yī)院消化內(nèi)科，湖北 襄陽(yáng)441000;2.武漢大學(xué)人民醫(yī)院消化內(nèi)科

潰瘍性結(jié)腸炎(ulcerative colitis，UC)是一種病因未明的慢性非特異性結(jié)腸炎癥，其病因和發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前認(rèn)為是由多因素相互作用所致，主要包括環(huán)境、遺傳、免疫、感染和精神等因素［1-2］。此外對(duì)UC 病情活動(dòng)性、嚴(yán)重性的評(píng)估可以指導(dǎo)臨床治療，評(píng)價(jià)預(yù)后，具有重要臨床意義。

低氧誘導(dǎo)因子-1(hypoxia inducible factor-1，HIF-1)是由Semenza 和Wang 1992 年在低氧的肝細(xì)胞癌細(xì)胞株Hep3B 細(xì)胞核提取物中發(fā)現(xiàn)一種蛋白特異性地結(jié)合于紅細(xì)胞生成素(EPO)基因增強(qiáng)子的寡核苷酸序列，命名為HIF-1。在缺氧條件下廣泛存在于哺乳動(dòng)物和人體細(xì)胞中，由HIF-1α 和HIF-1β 亞單位構(gòu)成異二聚體，其中HIF-1α 是主要的氧調(diào)節(jié)亞基和活性單位。HIF-1α 可與缺氧適應(yīng)有關(guān)基因的啟動(dòng)子或增強(qiáng)子上的HIF-1 結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)這些基因的轉(zhuǎn)錄。HIF-1α 作為基因轉(zhuǎn)錄的核調(diào)節(jié)因子，是低氧適應(yīng)和病理反應(yīng)中的一個(gè)特異的中介因子。本研究旨在檢測(cè)UC 患者血清和結(jié)腸黏膜中HIF-1α 的含量，探討其在UC 發(fā)病機(jī)制中的調(diào)控作用及其與患者病情活動(dòng)性和嚴(yán)重性的關(guān)系。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集湖北省醫(yī)藥學(xué)院附屬襄陽(yáng)醫(yī)院2010 年1 月-2013 年9 月經(jīng)臨床確診的60 例UC 患者，診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)2007 年我國(guó)炎癥性腸病診斷共識(shí)意見［3］，疾病活動(dòng)性依據(jù)改良的Mayo 評(píng)分系統(tǒng)，UC 臨床嚴(yán)重程度分級(jí)根據(jù)Truelove-Witts 標(biāo)準(zhǔn)，內(nèi)鏡分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)Truelove 標(biāo)準(zhǔn)。其中活動(dòng)期UC 患者47 例，男28 例，女19 例，平均年齡(36.47 ±13.89)歲;緩解期UC 患者13 例，男9 例，女4 例，平均年齡(39. 54 ±15.47)歲;另選10 名健康體檢者為對(duì)照組，男6 例，女4 例，平均年齡(44.30 ±15.18)歲。三組患者的性別、年齡相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＜0. 05)，具有可比性。

1.2 試劑 酶聯(lián)免疫吸附劑(ELISA)試劑盒購(gòu)自武漢華美生物工程有限公司;兔抗人HIF-1α 多克隆抗體購(gòu)自武漢博士德生物工程公司，抗體工作濃度為1∶80，S-P 試劑盒為美國(guó)MAX1M 公司產(chǎn)品，購(gòu)自福州邁新公司。

1.3 研究方法 清晨空腹清醒時(shí)抽取靜脈血，每次抽取4 ml，分離血清，采用ELISA 法測(cè)定血清HIF-1α 水平;取受試者結(jié)腸黏膜組織，所有標(biāo)本均經(jīng)10%甲醛固定、常規(guī)石蠟包埋，4 μmol/L 切片，除作常規(guī)HE 染色外，余作免疫組化染色。采用免疫組化SP 方法，具體步驟是:4 μmol/L 石蠟切片脫蠟水化，與3%過氧化氫孵育10 min 以消除內(nèi)源性過氧化物酶活性，隨后在含5 mmol/L 枸櫞酸鈉緩沖液的蒸餾水(pH =6.0)中煮沸2 min 進(jìn)行抗原修復(fù)，室溫冷卻10 min 后與正常山羊血清在室溫下溫育15 min 以減少非特異性抗體的結(jié)合。滴加1∶100 稀釋的多克隆兔抗HIF-1α 抗體在冰箱(4 ℃)中過夜，用PBS 沖洗3 次后，切片滴加生物素標(biāo)記的IgG，室溫下溫育15 min。再用PBS 沖洗3次后與辣根酶標(biāo)記鏈酶卵白素工作液(S-A/HRP)室溫下共同溫育15 min，顯微鏡下控制DAB 顯色;蘇木精復(fù)染，封片。用PBS 替代多克隆羊抗HIF-1α 抗體作為陰性對(duì)照。

1.4 染色結(jié)果的判斷 HIF-1α 蛋白以細(xì)胞核或胞漿內(nèi)有棕黃色細(xì)顆粒為陽(yáng)性，每張切片在400 倍顯微鏡下隨機(jī)選定10 個(gè)視野，采用全自動(dòng)圖像分析儀，HPIAS-2000 圖像分析軟件，分別掃描記錄陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)百分?jǐn)?shù)，取其均數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 14.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)進(jìn)行正態(tài)檢驗(yàn)和方差齊性檢驗(yàn)，計(jì)量資料以x±s 表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間比較采用t 檢驗(yàn)，相關(guān)分析采用Pearson 線性及Spearman 等級(jí)相關(guān)，P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 HIF-1α 表達(dá)水平 活動(dòng)期UC 患者血清HIF-1α含量(73.21 ±28.65)ng/L 顯著高于緩解期(44.54 ±14.75)ng/L 和對(duì)照組(42. 83 ± 15. 49)ng/L(P ＜0.05)，緩解期與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);活動(dòng)期UC 患者結(jié)腸黏膜中HIF-1α 表達(dá)陽(yáng)性率(58. 05 ± 13. 83)% 顯著高于緩解期(3. 00 ±2.72)%和對(duì)照組(3.04 ±2.69)%(P ＜0.05)，緩解期與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P ＞0.05);HIF-1α在正常腸組織和緩解期的結(jié)腸黏膜中不表達(dá)或表達(dá)很低，而HIF-1α 在UC 患者中表達(dá)于腸腔和腺體的上皮細(xì)胞、血管的內(nèi)皮細(xì)胞、基質(zhì)的結(jié)締組織細(xì)胞、腸組織的炎性細(xì)胞，且隨活動(dòng)程度的加重而表達(dá)強(qiáng)度增加(見圖1 ～5)。

2.2 相關(guān)分析 在緩解期UC 組，血清HIF-1α 水平與Mayo 評(píng)分無相關(guān)性(r =0.139，P ＞0.05);在活動(dòng)期UC 組，血清HIF-1α 水平與Mayo 評(píng)分呈顯著相關(guān)性(r=0.699，P ＜0.01);活動(dòng)期UC 患者血清HIF-1α水平與臨床病情分型及內(nèi)鏡表現(xiàn)分級(jí)均呈顯著正相關(guān)(r=0.696，r=0.674，P ＜0.01，見表1);在緩解期UC組，結(jié)腸黏膜HIF-1α 表達(dá)陽(yáng)性率與Mayo 評(píng)分無相關(guān)性(r =0.108，P ＞0.05);在活動(dòng)期UC 組，結(jié)腸黏膜HIF-1α 表達(dá)陽(yáng)性率與Mayo 評(píng)分呈顯著相關(guān)性(r =0.743，P ＜0.01)，活動(dòng)期UC 患者結(jié)腸黏膜HIF-1α 水平與臨床病情分型及內(nèi)鏡表現(xiàn)分級(jí)均呈顯著正相關(guān)(r=0.699，r=0.677，P ＜0.01，見表2)。

圖1 HIF-1α 在正常腸組織中表達(dá)陰性(SP 400 ×);圖2 HIF-1α 在緩解期UC 組織中表達(dá)陰性(SP 400 ×);圖3 活動(dòng)期UC 結(jié)腸黏膜中HIF-1α 免疫組化染色陽(yáng)性(輕度，SP 400 ×);圖4 活動(dòng)期UC 結(jié)腸黏膜中HIF-1α 免疫組化染色陽(yáng)性(中度，SP 400×);圖5 活動(dòng)期UC 結(jié)腸黏膜中HIF-1α 免疫組化染色陽(yáng)性(重度，SP 400 ×)Fig 1 HIF-1α negative expression in normal intestinal tissue (SP 400 ×);Fig 2 HIF-1α expression in tissues of remission UC was negative (SP 400 ×);Fig 3 Active UC colonic mucosa HIF-1α immunohistochemical staining (mild，SP 400 ×);Fig 4 Active UC colonic mucosa HIF-1α immunohistochemical staining (moderate，SP 400 ×);Fig 5 Active UC colonic mucosa HIF-1α immunohistochemical staining (severe，SP 400 ×)

表1 活動(dòng)期UC 患者血清HIF-1α 含量與病情嚴(yán)重性、內(nèi)鏡表現(xiàn)分級(jí)的相關(guān)性(x±s，ng/L)Tab 1 Correlation of serum HIF-1α content and severity，endoscopic grading of active UC patients (x±s，ng/L)

表2 活動(dòng)期UC 患者結(jié)腸黏膜HIF-1α 含量與病情嚴(yán)重性、內(nèi)鏡表現(xiàn)分級(jí)的相關(guān)性(x±s)Tab 2 Correlation of colonic mucosa HIF-1α content and severity，endoscopic grading of active UC patients (x±s)

3 討論

氧對(duì)于細(xì)胞的代謝活動(dòng)及生存是必需的。在缺氧狀態(tài)下，細(xì)胞許多基因的轉(zhuǎn)錄、表達(dá)發(fā)生變化，對(duì)缺氧作出應(yīng)激反應(yīng)，同時(shí)也可導(dǎo)致代謝紊亂，功能失調(diào)，出現(xiàn)各種各樣的病理生理變化，導(dǎo)致疾病發(fā)生。

在UC 患者中，腸上皮細(xì)胞的凋亡和再生、血管增生、淋巴細(xì)胞的增生和細(xì)胞代謝的增加、血小板被大量激活影響腸黏膜微循環(huán)，這些都可能給組織造成一個(gè)整體和局部的低氧微環(huán)境;有研究證實(shí)在實(shí)驗(yàn)小鼠模型和人類炎癥性腸病患者的腸黏膜上均可見不同程度的缺氧，氧供給和氧消耗之間的平衡受到破壞，一些低氧誘導(dǎo)因子，如HIF-1α 能夠通過不同的調(diào)解機(jī)制調(diào)控不同的病理生理反應(yīng)［4-5］。HIF-1α 雖發(fā)現(xiàn)于腫瘤細(xì)胞，與機(jī)體許多重大缺血、缺氧性疾病及腫瘤的病理生理有關(guān)，并與腸黏膜屏障功能的修復(fù)和維持關(guān)系密切。HIF-1α 可調(diào)節(jié)多種靶基因如VEGF、EPO、GAPDH、iNOS、COX-2、IGF-2、ET-1、轉(zhuǎn)鐵HIF-1α 蛋白、糖酵解酶類等的表達(dá)，這些靶基因的產(chǎn)物涉及細(xì)胞的能量代謝、離子代謝、兒茶酚胺代謝、血管生成、細(xì)胞增殖和細(xì)胞存活等生理病理過程，它們或能增加缺氧組織的氧供應(yīng)，或能降低細(xì)胞耗氧量，從而緩解氧供求之間的矛盾，以維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，使機(jī)體組織對(duì)缺氧產(chǎn)生耐受與適應(yīng)，從而對(duì)組織形成一種保護(hù)作用;當(dāng)然在慢性缺氧的情況下，HIF-1α 及其某些靶基因產(chǎn)物如iNOS、COX-2、IL-6、IL-8［6］等也可能參與UC 的病理?yè)p傷過程如炎癥和免疫以及凋亡的調(diào)節(jié)等。我們?cè)谥暗难芯恐校?］已發(fā)現(xiàn)HIF-1α 及其調(diào)控的COX-2 及iNOS 在正常的腸道黏膜中不表達(dá)或表達(dá)很低，而在UC 患者病變組織中表達(dá)明顯增加，本研究中證實(shí)活動(dòng)期UC 血清及結(jié)腸黏膜中HIF-1α 含量顯著高于緩解期及對(duì)照組，而緩解期與對(duì)照組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，再次證明了UC 中存在著缺氧，并且HIF-1α 可能在UC 的發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。

研究顯示HIF-1α 表達(dá)的活化和炎癥之間有聯(lián)系，如細(xì)菌代謝產(chǎn)物脂多糖(LPS)能強(qiáng)烈的誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞中HIF-1α 的表達(dá)，從而在LPS 介導(dǎo)的炎癥中充當(dāng)重要的角色。炎癥模型中敲除表達(dá)HIF-1 的基因可以抑制嗜中性粒細(xì)胞和巨噬細(xì)胞在低氧環(huán)境下發(fā)揮引起炎癥反應(yīng)的能力，從而防止炎癥的發(fā)生［8］，這表明HIF-1可促使炎癥的發(fā)生。HIF-1α 在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、慢性支氣管炎、COPD、急性胰腺炎、牙周炎及牙周病、慢性肝炎、慢性腎炎、疣狀胃炎等疾病中均有研究并證實(shí)參與了炎癥反應(yīng)。HIF-1α 為調(diào)解氧穩(wěn)態(tài)的核心轉(zhuǎn)錄因子，已有大量研究表明，氧濃度并非調(diào)解HIF-1α 的唯一因素，在炎癥環(huán)境下某些炎性介質(zhì)、細(xì)胞因子等對(duì)HIF-1α 誘導(dǎo)、DNA 結(jié)合活性以及下游基因的表達(dá)有重要的調(diào)節(jié)作用，如炎癥相關(guān)細(xì)胞因子白介素-1β(IL-1β)、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、NO 對(duì)HIF-1α 的蛋白聚集、DNA 結(jié)合活性以及下游因子的表達(dá)有重要的調(diào)解作用［9］，而IL-1β、IL-6、TNF-α、NO 等炎癥相關(guān)細(xì)胞因子在UC 炎癥過程中起重要作用［10］。在正常牙髓中無HIF-1α 的表達(dá)，而在炎癥牙髓中陽(yáng)性表達(dá)，認(rèn)為在牙髓炎中，缺血、缺氧誘導(dǎo)HIF-1α 的產(chǎn)生，而炎癥因子激活HIF-1α，從而使得HIF-1α 在上游水平調(diào)控核因子-κB(nuclear factork B，NF-κB)、一氧化氮合酶(iNOS)、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)［11］。在缺氧條件下可能存在“炎癥-炎癥介質(zhì)-HIF-1α -炎癥介質(zhì)-炎癥”的正反饋環(huán)，HIF-1α 至少起著炎癥放大作用，使已存在的炎癥反應(yīng)放大和持久化。本研究中緩解期UC 患者血清及結(jié)腸黏膜中HIF-1α 水平與Mayo 評(píng)分無相關(guān)性，活動(dòng)期UC 患者血清和結(jié)腸黏膜HIF-1α 水平與Mayo 評(píng)分有顯著相關(guān)性，活動(dòng)期UC 患者血清和結(jié)腸黏膜HIF-1α 水平與臨床病情分型及內(nèi)鏡表現(xiàn)分級(jí)均呈顯著正相關(guān)，提示HIF-1α 有可能作為評(píng)價(jià)UC患者病情活動(dòng)性及嚴(yán)重程度的良好指標(biāo)。

總之，HIF-1α 與UC 有著多方面的聯(lián)系，但是其復(fù)雜的分子生物學(xué)機(jī)制還有待進(jìn)一步深究，這對(duì)進(jìn)一步闡明UC 的發(fā)病機(jī)制，尋找有效及新穎的治療理念具有重要意義。

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