斑點(diǎn)叉尾鮰巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）基因多態(tài)性及表達(dá)分析

高磊杜小溪李樂高祥剛鮑相渤赫崇波

（1. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院 遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023；2. 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116029）

斑點(diǎn)叉尾鮰巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）基因多態(tài)性及表達(dá)分析

高磊1杜小溪2李樂2高祥剛1鮑相渤1赫崇波1

（1. 遼寧省海洋水產(chǎn)科學(xué)研究院 遼寧省海洋水產(chǎn)分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，大連 116023；2. 遼寧師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，大連 116029）

巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）是一類主要由T細(xì)胞產(chǎn)生、負(fù)責(zé)機(jī)體在環(huán)境協(xié)迫和炎癥反應(yīng)中進(jìn)行免疫應(yīng)答的細(xì)胞因子。根據(jù)斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因EST序列，應(yīng)用RACE技術(shù)克隆了MIF 3' UTR和5' UTR序列，利用Genome Walking技術(shù)克隆了MIF啟動子序列，通過特異PCR克隆MIF內(nèi)含子序列，并對多個體MIF基因組序列進(jìn)行多態(tài)性分析，利用熒光定量PCR研究MIF的組織分布。結(jié)果顯示，斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因組序列共3 918 bp，其中編碼區(qū)348 bp，編碼115個氨基酸，5'UTR為70 bp，3'UTR為434 bp，啟動子為1 382 bp，共有2個內(nèi)含子，分別為243 bp和1 441 bp。MIF基因組序列中包含4個重復(fù)單元序列和60個多態(tài)性位點(diǎn)，其中共有6個SNP位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上。斑點(diǎn)叉尾鮰MIF mRNA在腸中表達(dá)量最高，肌肉中表達(dá)量最低。

斑點(diǎn)叉尾鮰 巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF） 基因組序列 多態(tài)性 組織表達(dá)

巨噬細(xì)胞移動抑制因子（MIF）是在1966年被發(fā)現(xiàn)的一類高度保守的細(xì)胞因子［1，2］。MIF主要由T細(xì)胞產(chǎn)生，負(fù)責(zé)機(jī)體在環(huán)境協(xié)迫和炎癥反應(yīng)中進(jìn)行免疫應(yīng)答反應(yīng)［3，4］。最近MIF被證實(shí)在免疫刺激、組織損傷以及細(xì)胞應(yīng)激等過程中具有特異目的細(xì)胞的多效性，同時在內(nèi)皮細(xì)胞、腦垂體細(xì)胞和特殊上皮細(xì)胞等非免疫細(xì)胞中分泌［5，6］。MIF不僅在急性和慢性炎癥、自身免疫性疾病、細(xì)胞增殖和腫瘤血

管形成過程中具有重要的調(diào)節(jié)作用，同時在生命周期調(diào)節(jié)、胚胎形成和發(fā)育以及神經(jīng)發(fā)育等過程中發(fā)揮重要功能［6-9］。

目前，關(guān)于MIF基因的研究主要集中在基因克隆和多態(tài)性分析中。除人、鼠和斑馬魚等主要模式生物外，MIF已在多種魚類中有序列報道，如大黃魚、鱸魚、綠河鲀和紅鰭東方鲀等［10-16］。MIF的基因多態(tài)性以及啟動子多態(tài)與疾病抗性的關(guān)聯(lián)在人類中已有較多報道。王春平等［17］發(fā)現(xiàn)MIF基因啟動子區(qū)-794 CATT微衛(wèi)星多態(tài)性與廣東漢族人群子宮內(nèi)膜異位癥的遺傳易感性相關(guān)，CATT（5/5）基因型及CATT（5）等位基因型為其易感基因型。李艷林等［18］認(rèn)為MIF -794 CATT重復(fù)序列數(shù)為7/7和7/8可能與結(jié)核易感性相關(guān)。然而，MIF的基因多態(tài)性在魚類中還鮮有報道。

斑點(diǎn)叉尾鮰（Ictalurus punctatus），亦稱溝鯰，屬于鯰形目，鮰科，是美國主要的淡水養(yǎng)殖種類之一，1984年引入我國進(jìn)行馴化，于1989年繁育成功，目前已在我國30個?。▍^(qū)、市）開展了規(guī)模養(yǎng)殖，出口總量也不斷增大［19］。本研究利用已報道的斑點(diǎn)叉尾鮰外顯子序列，對啟動子、內(nèi)含子和3'、5'UTR序列進(jìn)行克隆、測序，并通過多個體序列對多態(tài)性進(jìn)行分析，利用熒光定量PCR研究MIF的組織分布，旨在為進(jìn)一步研究啟動子多態(tài)性與疾病的關(guān)聯(lián)提供線索。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)用斑點(diǎn)叉尾鮰采自湖北省嘉魚某養(yǎng)殖場，暫養(yǎng)1周后選取30尾活體解剖，將腸、頭腎、脾、肌、肝、鰓和腦組織用RNA Locker固定后帶回實(shí)驗(yàn)室于-80℃保存。使用RNAprep pure Tissue Kit（北京天根）提取總RNA，利用核酸分析儀檢測RNA濃度與質(zhì)量。取30尾斑點(diǎn)叉尾鮰肌肉組織50-100 mg，按照常規(guī)酚-氯仿方法抽提基因組DNA。

1.2 方法

1.2.1 斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因克隆 根據(jù)斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因已知的外顯子序列（GenBank登錄號：DQ639947），利用Primer Premier 5軟件設(shè)計(jì)引物3-OF、3-IF和5F（表1），利用3'-Full RACE Core Set（TaKaRa）和BD SMARTTMRACE cDNA Amplification Kit（Clontech）進(jìn)行3'和5'UTR的擴(kuò)增。設(shè)計(jì)巢式PCR引物GWR1、GWR2和GWR3，以基因組DNA為模板，按Genome Walking Kit（TaKaRa）說明步驟進(jìn)行PCR擴(kuò)增。為了獲取斑點(diǎn)叉尾鮰的內(nèi)含子序列，參考近緣物種MIF外顯子和內(nèi)含子的結(jié)構(gòu)特征，研究設(shè)計(jì)了2對引物，PCR反應(yīng)條件：94℃5 min；94℃ 30 s，退火30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃保溫10 min。所得PCR 產(chǎn)物經(jīng)純化后連接到pMD19-T 載體上（TaKaRa），轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，PCR 檢測陽性克隆后由TaKaRa公司進(jìn)行雙向測序。

表1 PCR擴(kuò)增引物序列

1.2.2 斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因多態(tài)性分析 根據(jù)獲得的MIF基因組序列設(shè)計(jì)特異性引物PolymF和PolymR（表1），以30尾斑點(diǎn)叉尾鮰基因組DNA為模板，擴(kuò)增包括完整啟動子、外顯子和內(nèi)含子的DNA片段，對MIF基因進(jìn)行多態(tài)性分析。PCR體系為25 μL，包括2.5 μL 10×PCR buffer，2.0 μL dNTP（2.5 mmol/L），正反引物（10 μmol/L）各1.0 μL，模板1 μL，0.4 μL Pfu DNA polymerase（2.5 U/μL，北京天根）和17.1 μL滅菌水。PCR反應(yīng)條件：94℃ 5

min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 1 min，共35個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物送TaKaRa公司直接進(jìn)行雙向測序。

1.2.3 MIF組織特異性表達(dá) 利用熒光定量PCR技術(shù)分析30尾1齡斑點(diǎn)叉尾鮰中MIF在腸、頭腎、脾、肌、肝、鰓和腦7種組織中的分布。使用PrimeScriptTMRT reagent Kit（TaKaRa）合成cDNA，以此為模板使用SYBR?Premix DimerEraserTM（TaKaRa）進(jìn)行Realtime PCR。PCR體系為20 μL，其中包括2×SYBR?Premix DimerEraser 10 μL，ROX II 0.4 μL，引物（表1）各0.6 μL，模板2 μL和滅菌水6.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)椋旱?步95℃ 30 s；第2步95℃ 5 s，59℃20 s，72℃ 20 s，共40個循環(huán)；反應(yīng)結(jié)束后進(jìn)行溶解曲線分析。對于任意一個樣品，目標(biāo)基因（MIF）和內(nèi)參基因（18S rRNA，GenBank ID：AF021880）擴(kuò)增時加入等量模板，計(jì)算△CT值后進(jìn)行2-△△CT計(jì)算［20］。

1.2.4 統(tǒng)計(jì)分析 利用MEGA5.1和BioEdit7.0軟件進(jìn)行多態(tài)性位點(diǎn)的統(tǒng)計(jì)確認(rèn)。通過TFSEARCH程 序（http：//www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH. html）進(jìn)行轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的預(yù)測。利用RepeatMasker程序（http：//www.repeatmasker.org/cgibin/WEBRepeatMasker）進(jìn)行重復(fù)序列的統(tǒng)計(jì)和分析。

采用SPSS 13.0 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)以平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。組間差異采用單因素方差（one way ANOVA）分析，兩組比較采用Student t-test 進(jìn)行分析，P＜0.05 代表差異顯著。

2 結(jié)果

2.1 斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因組序列特征

根據(jù)斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因外顯子序列設(shè)計(jì)特異性引物獲得其基因組序列，共包含3 918 bp，其中編碼區(qū)為348 bp，編碼115個氨基酸，5'UTR為70 bp，3'UTR為434 bp（圖1）。MIF基因組序列共有2個內(nèi)含子，分別為243 bp和1 441 bp，所有外顯子-內(nèi)含子邊界符合GT-AG規(guī)則（圖2）。試驗(yàn)擴(kuò)增出啟動子為1 382 bp，經(jīng)過序列分析發(fā)現(xiàn)一個CAAT-box。

圖2 斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因組結(jié)構(gòu)示意圖

序列分析發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因組序列中包含4個重復(fù)單元序列，其中一個位于啟動子，3個位于內(nèi)含子，具體情況見表2。

表2 斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因組序列重復(fù)單元

2.2 斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因組多態(tài)性分析

斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因組序列共包含60個多態(tài)性位點(diǎn)，其中29個位于啟動子，1個位于5' UTR，7個位于3' UTR，1個位于外顯子，22個位于內(nèi)含子。60個SNP中轉(zhuǎn)換占55%，包括A/G 14個，T/C 19個；顛換占45%，包括A/T 9個，A/C 6個，T/G 4個，C/G 8個（表3）。其中外顯子上為G-C同義突變（Val-Val）。

2.3 轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)多態(tài)性分析

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)共6個SNP位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上（score＞90），具體情況見圖3。在-761和-758位點(diǎn)，于A-A單體型中發(fā)現(xiàn)Pbx-1和SRY兩個轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，在T-A單體型中發(fā)現(xiàn)SRY轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)，在A-T單體型中發(fā)現(xiàn)CdxA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在-723位點(diǎn)，于T等位基因上發(fā)現(xiàn)HSF2轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在-278位點(diǎn)，于T等位基因上發(fā)現(xiàn)CdxA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。在-249和-246位點(diǎn)，于A-T單體型中發(fā)現(xiàn)CdxA轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。

圖1 斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因組序列

表3 斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因組序列多態(tài)性

2.4 斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因在不同組織中的表達(dá)分析利用實(shí)時熒光定量PCR檢測MIF mRNA在健康

斑點(diǎn)叉尾鮰腸、頭腎、脾、肌、肝、鰓和腦7種正常組織中的表達(dá)情況，結(jié)果顯示MIF mRNA在7種組織中均可見不同豐度的表達(dá)。以相應(yīng)組織中18S rRNA基因標(biāo)準(zhǔn)化后的表達(dá)量為內(nèi)參，比較發(fā)現(xiàn)，MIF基因在腸中表達(dá)量最高，肌肉中表達(dá)量最低，脾、鰓的表達(dá)量明顯高于頭腎、肝和腦（圖4）。

圖3 不同等位基因和單體型所形成的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)

圖4 斑點(diǎn)叉尾鮰MIF組織表達(dá)Realtime PCR分析

3 討論

MIF是一類在脊椎動物中廣泛研究的用于調(diào)節(jié)適應(yīng)性免疫反應(yīng)的先天性免疫催化劑類細(xì)胞因子［4］。目前已在大黃魚、鱸魚、櫛孔扇貝和中華絨螯蟹等水產(chǎn)經(jīng)濟(jì)動物中實(shí)現(xiàn)了基因克隆，并對其在病菌感染的免疫反應(yīng)中所起的作用進(jìn)行了研究［13，14，21，22］。然而，MIF在斑點(diǎn)叉尾鮰中卻少有研究。本研究采用RACE、Genome Walking等方法獲得了斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因組序列，共3 918 bp；通過對MIF多態(tài)性分析發(fā)現(xiàn)60個多態(tài)性位點(diǎn)；利用熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)MIF mRNA在腸中表達(dá)量最高，肌肉中表達(dá)量最低。

本研究利用特異PCR方法獲得的斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因組序列共包含3個外顯子與2個內(nèi)含子，內(nèi)含子的兩側(cè)都具有正確的RNA剪接識別位點(diǎn)（GT/AG），符合外顯子和內(nèi)含子連接區(qū)域的GT-AG剪切原則。斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因結(jié)構(gòu)與其它已報道的硬骨魚基本相同，但其內(nèi)含子序列及長度變化較大。MIF內(nèi)含子2的序列長度為1 441 bp，明顯長于大黃魚的112 bp和綠河鲀的84 bp［13，15］。斑點(diǎn)叉尾鮰的內(nèi)含子序列長度變化較大是因?yàn)閮?nèi)含子承擔(dān)的進(jìn)化壓力小，故序列相似度較低，雖然在某些特定情況下能夠反應(yīng)不同物種間的親緣關(guān)系，但內(nèi)含子的長度和數(shù)量是可變的，同源性明顯低于外顯子。研究還發(fā)現(xiàn)斑點(diǎn)叉尾鮰MIF缺少信號肽和N-或O-糖基化位點(diǎn)，這個發(fā)現(xiàn)與其它物種MIF序列相似，說明魚類與哺乳動物相似，MIF分子在表達(dá)后先在細(xì)胞內(nèi)部進(jìn)行儲存，再通過非常規(guī)蛋白分泌途徑由細(xì)胞進(jìn)行釋放［23］。

在人類和其它高等動物中，MIF基因組多態(tài)性的研究已十分廣泛。本研究通過PCR產(chǎn)物直接測序的方法對斑點(diǎn)叉尾鮰基因組序列多態(tài)性進(jìn)行了分析，在發(fā)現(xiàn)的60個多態(tài)性位點(diǎn)中共有6個SNP位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上，不僅證明了MIF基因的多態(tài)性水平較高，同時預(yù)示著序列多態(tài)性對基因表達(dá)起到重要的調(diào)節(jié)作用，這與前人的研究結(jié)果基本一致。目前已發(fā)現(xiàn)的人類MIF基因4個主要多態(tài)性位點(diǎn)依次是：-173 nt（G/C），+254 nt（T/C），+656 nt（C/G）和-794 nt（CATT重復(fù)）［24］。Donn［25］于2001年首次報道了MIF-173位點(diǎn)多態(tài)性與青少年先天性關(guān)節(jié)

炎的關(guān)系，Barton等也證實(shí)MIF-173位點(diǎn)為關(guān)節(jié)炎易感性的相關(guān)位點(diǎn)［26］。此外研究顯示，MIF啟動子-794位點(diǎn)CATT重復(fù)序列的拷貝數(shù)量與啟動子活性有顯著的相關(guān)性，啟動子活性隨CATT重復(fù)序列拷貝數(shù)量的增加而增強(qiáng)，MIF mRNA的表達(dá)水平也相應(yīng)提高［24］。

在哺乳動物中，MIF在肺、皮膚、胃腸道和內(nèi)分泌系統(tǒng)中廣泛表達(dá)，表達(dá)水平受LPS、TNF和IFN等病原物質(zhì)誘導(dǎo)出現(xiàn)顯著變化［27］。本研究發(fā)現(xiàn)，在健康斑點(diǎn)叉尾鮰中，MIF在腸中表達(dá)量最高，肌肉中表達(dá)量最低，此外脾、鰓組織的表達(dá)量明顯高于頭腎、肝和腦。MIF基因的普遍性表達(dá)方式與已報道的其它脊椎動物MIF表達(dá)方式一致［15，27，28］。通常認(rèn)為MIF會以既定的模式持續(xù)的以較低水平分泌，并在誘導(dǎo)后通過非典型分泌途徑以較高水平釋放［29］。斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因在不同組織中的表達(dá)方式與已知硬骨魚有所不同。大黃魚MIF基因在腦中表達(dá)量最高［13］，鱸魚MIF基因在胸腺、外周血白細(xì)胞和頭腎中表達(dá)量較高［14］，綠河鲀MIF基因在鰓和性腺中表達(dá)量較高［15］，條石鯛MIF基因在肝中表達(dá)量最高［30］。不同硬骨魚MIF基因在不同組織中沒有統(tǒng)一的表達(dá)模式，這可能與機(jī)體的生理水平和免疫狀況有關(guān)，對此現(xiàn)象還需要進(jìn)一步深入的研究。

4 結(jié)論

根據(jù)斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因EST序列，應(yīng)用RACE技術(shù)克隆了MIF 3' UTR和5' UTR序列，利用Genome Walking技術(shù)克隆了MIF啟動子序列，通過特異PCR克隆MIF內(nèi)含子序列，并對多個體MIF基因組序列進(jìn)行多態(tài)性分析，利用熒光定量PCR研究MIF的組織分布。 結(jié)果顯示，斑點(diǎn)叉尾鮰MIF基因組序列共3 918 bp，其中編碼區(qū)348 bp，編碼115個氨基酸，5' UTR為70 bp，3' UTR為434 bp，啟動子為1 382 bp，共有2個內(nèi)含子，分別為243 bp和1 441 bp。MIF基因組序列中包含4個重復(fù)單元序列和60個多態(tài)性位點(diǎn)，其中共有6個SNP位于轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)上。斑點(diǎn)叉尾鮰MIF mRNA在腸中表達(dá)量最高，肌肉中表達(dá)量最低。

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（責(zé)任編輯 李楠）

Polymorphisms and Expression of Macrophage Migration Inhibitory Factor Gene from Channel Catfish，Ictalurus punctatus

Gao Lei1Du Xiaoxi2Li Le2Gao Xianggang1Bao Xiangbo1He Chongbo1
（1. Key Laboratory of Marine Fishery Molecular Biology of Liaoning Province，Liaoning Ocean and Fisheries Science Research Institute，Dalian 116023；2. College of Life Sciences，Liaoning Normal University，Dalian 116029）

Macrophage migration inhibitory factor（MIF）was considered as a unique cytokine produced by T-cell and involved in immune response to inflammation and stress. In this study, the genomic sequence of MIF was identified, and the polymorphisms and expression level were studied in channel catfish Ictalurus punctatus. The genomic sequence of MIF was identified to be 3 918 bp, consisting of a 70 bp 5'-untranslated region（UTR）, a 160 bp 3'-UTR, a 348 bp open reading frame（ORF）, two introns as 243 and 1 441 bp, and a 1382 bp promoter. Four repetitive sequences were found in promoter and introns. Sixty sites of single nucleotide polymorphisms（SNPs）were identified in MIF genomic sequence, among which 6 sites were found to locate in the binding sites for transcription factor. MIF was found to be most abundantly expressed in intestine, and weaker in other tissues. These results could give more information and greater understanding of the degree of MIF genetic variation.

Channel catfish Ictalurus punctatus macrophage migration inhibitory factor Genomic sequence Promoter polymorphism Tissue expression

2014-03-21

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（30972246）

高磊，男，博士，助理研究員，研究方向：水產(chǎn)動物分子遺傳學(xué)；E-mail：seamas_gao@163.com

赫崇波，博士，研究員，研究方向：海洋動物分子遺傳學(xué)；E-mail：chongbohe@163.com