MID2對豬繁殖與呼吸綜合征病毒復(fù)制的調(diào)控作用

周立坤,董鑫媛,李家輝,崔志瑩,趙士杰,徐 婕,陳 靜*,張宜娜*,夏平安

(1.河南農(nóng)業(yè)大學生命科學學院,鄭州 450002;2.河南農(nóng)業(yè)大學動物醫(yī)學院,鄭州 450002)

豬繁殖與呼吸綜合征(porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS),俗稱藍耳病,是由豬繁殖與呼吸綜合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV)引起的一種高度接觸性傳染病,其臨床癥狀主要為豬的繁殖機能障礙、仔豬生長緩慢、生產(chǎn)性能下降以及呼吸系統(tǒng)癥狀。自PRRS在美國和歐洲等地被發(fā)現(xiàn)以來,便開始在全球范圍內(nèi)廣泛流行,嚴重危害國內(nèi)外養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前PRRSV分為兩種基因型,歐洲型為PRRSV-1,北美型為PRRSV-2[1-2]。PRRSV是一種包膜的單股正鏈RNA病毒,基因組長度大約為15 kb,含有至少12個開放閱讀框(open reading frame,ORF),編碼16種非結(jié)構(gòu)蛋白和8種結(jié)構(gòu)蛋白[3]。PRRSV具有易突變、持續(xù)性感染、感染后能產(chǎn)生抗體依賴性增強(antibody dependent enhancement, ADE)效應(yīng)等特點,這也加劇了PRRSV的防控難度。目前國內(nèi)預(yù)防PRRSV感染的主要途徑是接種疫苗,但疫苗的持久性和有效性仍存在問題,因此如何精準防控病毒感染是目前急需解決的科學問題[4-5]。病毒感染宿主后,與宿主發(fā)生相互作用,逃逸宿主的免疫應(yīng)答,從而在宿主體內(nèi)增殖,這是病毒生存的關(guān)鍵。因此可以通過研究這些病毒與宿主之間的相互作用,開發(fā)新的抗PRRSV策略,以期更好地預(yù)防和治療PRRSV感染。

天然免疫是宿主抵抗病毒感染的第一道防線,病毒入侵宿主后,不同的模式識別受體(pattern recognition receptors,PRRs)能夠識別不同的病原體相關(guān)分子模式(pathogen-associated molecular patterns,PAMPs),通過刺激細胞中的信號分子,進而誘導(dǎo)下游干擾素(interferon,IFN)的產(chǎn)生以及一些干擾素刺激基因(IFN-stimulated genes,ISGs)的表達[6-7]。TRIM(tripartite motif protein,TRIM)家族蛋白作為ISGs的一員,同時也屬于E3泛素連接酶家族成員之一,廣泛參與了多種生物學過程,如限制病毒感染、調(diào)控天然免疫信號通路、自噬、細胞發(fā)育、凋亡和癌癥等[8]。TRIM蛋白由N端的一個RING結(jié)構(gòu)域、一個或兩個B-Box結(jié)構(gòu)域、一個coiled-coil結(jié)構(gòu)域和C端的非特異性結(jié)構(gòu)域組成。RING結(jié)構(gòu)域是一個鋅指結(jié)構(gòu)域,可以特異性地結(jié)合E2偶聯(lián)酶,從而發(fā)揮E3泛素連接酶的作用[9]。許多TRIM蛋白可以通過調(diào)節(jié)抗病毒天然免疫信號通路或直接靶向病毒蛋白調(diào)控病毒復(fù)制,如病毒感染后上調(diào)TRIM14,TRIM14通過招募去泛素化酶USP14逆轉(zhuǎn)cGAS的泛素化降解,提高其穩(wěn)定性并增強對HSV-1的抗病毒應(yīng)答[10]。TRIM11通過與TBK1相互作用,抑制IRF3介導(dǎo)的IFN-β產(chǎn)生[11]。TRIM25能夠靶向IBDV的VP3蛋白,并泛素化降解VP3,從而抑制IBDV復(fù)制[12]。最近的研究表明TRIM家族蛋白在調(diào)控PRRSV感染中發(fā)揮重要作用,如TRIM59能夠抑制PRRSV-2的體外復(fù)制[13];本實驗室前期的研究結(jié)果也顯示,TRIM22在調(diào)控PRRSV復(fù)制過程中發(fā)揮了重要作用[14]。因此深入探究TRIM家族蛋白調(diào)控PRRSV復(fù)制的分子機制,可以為PRRS的防控提供新靶點和新思路。

MID2(midline 2)屬于TRIM蛋白家族C-Ⅰ類成員,也被稱作TRIM1。與其他TRIM家族蛋白不同的是,對MID2的研究集中于Opitz G/BBB綜合征(Opitz BBB/G syndrome,OS)及對細胞周期的調(diào)控作用。近期的研究表明,MID2還能通過泛素化修飾LRRK2(leucine-rich repeat kinase 2),并控制其定位、降解和毒性進而參與到調(diào)控家族性帕金森病的過程[15]。此前已有報道表明,人源MID2能夠激活核因子κB(nuclear factor-κB,NF-кB)和激活子蛋白-1(activator protein 1,AP-1)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)[16],但是MID2在先天免疫和炎癥信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用目前尚不清楚。在本研究中作者發(fā)現(xiàn)MID2可能作為一種新的調(diào)控因子,通過正向調(diào)控I-IFN信號通路,抑制PRRSV復(fù)制。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 細胞、病毒和質(zhì)粒 人胚胎腎上皮細胞(HEK293 T),非洲綠猴腎細胞(MARC-145),PRRSV BJ-4毒株,pCMV-Flag載體,pCAGGS-HA載體,pGL3-basic和pGL3-IFN-β-Luc熒光素酶報告載體均由本實驗室保存。

1.1.2 試劑和抗體 雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒購自Promega公司;PrimeSTAR? Max DNA Polymerase、RNAiso Plus、PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 和TB Green? Premix Ex TaqTMII均購自TaKaRa公司;LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑購自Invitrogen公司;DMEM高糖培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司;膠回收試劑盒購自天根生化科技有限公司;無內(nèi)毒素質(zhì)粒提取試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司;兔抗HA多克隆抗體(51064-2-AP)、HRP-β-actin抗體(HRP-60008)和HRP-山羊抗兔IgG(H+L)抗體(SA00001-2)均購自Proteintech公司;兔抗Flag多克隆抗體(14793 s)購自CST公司;鼠抗Flag單克隆抗體(F1804)購自Sigma公司;兔抗PRRSV N蛋白多克隆抗體由本實驗室制備保存;HRP-山羊抗鼠IgG(H+L)抗體(5220-0341)購自SeraCare公司。兔源MID2特異性抗體購自Abclonal公司。

1.2 引物和siRNA的設(shè)計與合成

根據(jù)NCBI公布的猴源MID2(GenBank No.:XM_015127967)、PRRSV ORF7和猴源β-actin(GenBank: AB004 047.1)的基因序列,利用Primer Premier 5軟件設(shè)計MID2的擴增引物、RT-qPCR引物,及PRRSV ORF7和猴源β-actin的RT-qPCR引物,由上海生工生物工程股份有限公司合成。MID2特異性siRNA和陰性對照NC siRNA由上海吉瑪基因公司設(shè)計合成。引物及siRNA序列如表1所示。

表1 引物及siRNA序列Table 1 Primers and siRNA sequences

1.3 過表達MID2對PRRSV復(fù)制的影響

1.3.1 Western blot檢測過表達MID2對PRRSV N蛋白表達水平的影響 將pCMV-Flag質(zhì)粒和pCMV-Flag-MID2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞中,轉(zhuǎn)染24 h后將PRRSV 以MOI=0.1感染細胞。病毒感染24 h后收集細胞至離心管中,加入RIPA高強度裂解液,蛋白上樣緩沖液以及PMSF,煮沸后離心10 min,再進行SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜后分別用兔抗Flag多克隆抗體(1∶4 000)和兔抗PRRSV N多克隆抗體(1∶200)4 ℃過夜孵育,再用HRP-山羊抗兔IgG(1∶8 000)于室溫孵育1 h,PBST清洗3次后進行ECL顯影。

1.3.2 RT-qPCR檢測過表達MID2對PRRSV ORF7轉(zhuǎn)錄水平的影響 將pCMV-Flag質(zhì)粒和pCMV-Flag-MID2質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞中,轉(zhuǎn)染24 h后將PRRSV 以MOI=0.1感染細胞。病毒感染24 h后收獲細胞,提取細胞總RNA并反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為RT-qPCR反應(yīng)的模板。反應(yīng)所需的各個引物見表1,反應(yīng)體系:10 μL SYBR qPCR mix,0.5 μL上游引物,0.5 μL下游引物,1 μL cDNA模板,8 μL ddH2O,具體反應(yīng)程序按照試劑說明書進行。

1.4 敲低MID2對PRRSV復(fù)制的影響

1.4.1 Western blot檢測敲低MID2對PRRSV N蛋白表達水平的影響 將陰性對照siRNA-NC和siRNA-MID2分別轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞中,轉(zhuǎn)染24 h后將PRRSV 以MOI=0.1感染細胞。病毒感染24 h后按“1.3.1”的方法進行處理。

1.4.2 RT-qPCR檢測敲低MID2對PRRSV ORF7轉(zhuǎn)錄水平的影響 將陰性對照siRNA-NC和siRNA-MID2分別轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞中,轉(zhuǎn)染24 h后將PRRSV以 MOI=0.1感染細胞。病毒感染24 h后按“1.3.2”的方法進行處理。

1.5 雙熒光素酶基因報告試驗檢測MID2對IFN-β啟動子活性的影響

取生長狀態(tài)良好的HEK293T細胞均勻鋪種至24孔板中,待孔中細胞密度長至80%時,將pCMV-Flag-MID2質(zhì)粒以不同轉(zhuǎn)染劑量(0、50、100、300和500 ng)分別與pGL3-IFN-β-Luc質(zhì)粒、p-Renilla質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至細胞中,對照組轉(zhuǎn)染相應(yīng)劑量的pCMV-Flag質(zhì)粒及pGL3-IFN-β-Luc質(zhì)粒、p-Renilla質(zhì)粒,每組試驗設(shè)計三個重復(fù)。轉(zhuǎn)染18 h后,加入poly(I:C)或PBS刺激上述各組細胞,6 h后收集細胞樣品,利用雙熒光素酶試劑盒檢測熒光強度,計算相應(yīng)的啟動子活性。

1.6 MID2和RIG-I的Co-IP試驗

將pCMV-Flag質(zhì)粒和pCMV-Flag-MID2質(zhì)粒分別與pCMV-Myc-RIG-I質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293 T細胞中,轉(zhuǎn)染后36 h收獲細胞。首先用弱裂解液NP 40裂解細胞1 h,離心后取30 μL上清作為Input組樣品,在剩余上清中加入protein A/G瓊脂糖珠子進行除雜,再用偶聯(lián)Flag標簽抗體的瓊脂糖凝珠4 ℃過夜孵育。用PBS清洗瓊脂糖凝珠5次,再加入RIPA裂解液和PMSF進行裂解,最后將得到的樣品煮沸離心后,進行SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜后分別用兔抗Flag多克隆抗體(1∶4 000),兔抗Myc多克隆抗體(1∶2 000)和HRP-β-actin抗體(1∶1 000)4 ℃過夜孵育后,再用HRP-山羊抗兔IgG室溫孵育1 h后進行ECL顯影。

1.7 統(tǒng)計學分析

所有試驗均平行重復(fù)3次,并通過GraphPad Prism 8.0軟件中t-test對試驗數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。

2 結(jié) 果

2.1 MID2真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將生長狀態(tài)良好的MARC-145細胞裂解后,提取總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA作為MID2的擴增模板,進行PCR擴增。電泳結(jié)果顯示,在2 000 bp左右有單一條帶(圖1A),與預(yù)期結(jié)果相符。擴增片段經(jīng)同源重組酶連接至pCMV-Flag真核表達載體,將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α后,進行菌液PCR篩選鑒定。選取4株陽性菌株提取重組質(zhì)粒,進行雙酶切電泳鑒定,結(jié)果顯示在2 000、5 000 bp附近各有單一條帶,分別與目的基因和載體大小相符(圖1B)。最后任選一個質(zhì)粒送至生物公司進行測序,測序結(jié)果與NCBI上下載的基因序列完全一致。另將pCMV-Flag-MID2質(zhì)粒及pCMV-Flag空載轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中進行Western blot檢測,發(fā)現(xiàn)在80 ku處出現(xiàn)特異性條帶,確認pCMV-Flag-MID2真核表達質(zhì)粒構(gòu)建成功(圖1C)。以上結(jié)果說明,pCMV-Flag-MID2真核表達質(zhì)粒正確構(gòu)建并成功表達。

A. PCR擴增MID2目的條帶(1～3);B. 雙酶切后的pCMV-Flag-MID2重組質(zhì)粒(1～4);C. Western blot檢測pCMV-Flag-MID2質(zhì)粒表達A. PCR amplification of MID2 (1-3); B. pCMV-Flag-MID2 plasmid after double digestion (1-4);C. The identification of expression of pCMV-Flag-MID2 by Western blot圖1 pCMV-Flag-MID2真核表達質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定Fig.1 Construction and identification of MID2 eukaryotic expression plasmid

2.2 PRRSV感染上調(diào)MID2的表達

將PRRSV BJ-4毒株(MOI=0.1)感染MARC-145細胞,通過RT-qPCR檢測病毒感染24 h后細胞中MID2的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明,感染PRRSV后,MARC-145細胞中MID2的mRNA表達水平明顯上調(diào)(P<0.05,圖2A)。隨后,作者通過Western blot試驗檢測未感染PRRSV和感染PRRSV 24 h后細胞中內(nèi)源性MID2和PRRSV N蛋白的表達水平,結(jié)果顯示,PRRSV成功感染MARC-145細胞,且細胞中內(nèi)源性MID2的表達水平在病毒感染后顯著上調(diào)(圖2B)。以上結(jié)果表明,PRRSV感染上調(diào)MID2的表達。

A. RT-qPCR檢測接種PRRSV對MID2 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響(*.P<0.05);B. Western blot檢測接種PRRSV對MID2蛋白表達水平的影響A. The effect of PRRSV inoculation on MID2 mRNA transcription was detected by RT-qPCR (*.P<0.05); B. The effect of PRRSV inoculation on MID2 protein expression was detected by Western blot圖2 PRRSV感染上調(diào)MID2的表達Fig.2 MID2 is upregulated upon PRRSV infection

2.3 MID2抑制PRRSV復(fù)制

為了進一步研究MID2對PRRSV感染的調(diào)控作用,首先將構(gòu)建的MID2真核表達質(zhì)粒pCMV-Flag-MID2轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞,同時轉(zhuǎn)染pCMV-Flag空載作為空白對照,24 h后接種PRRSV(MOI=0.1)。接毒后24 h收取細胞樣品,通過RT-qPCR和Western blot試驗分別檢測細胞中PRRSV ORF7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平以及N蛋白的表達水平。結(jié)果顯示,過表達MID2明顯降低PRRSV ORF7的轉(zhuǎn)錄水平以及N蛋白表達水平,說明過表達MID2能夠抑制PRRSV的復(fù)制(圖3A～C)。隨后將siRNA-MID2(siRNA 1、siRNA 2、siRNA 3)與對照siRNA(siRNA-NC)分別轉(zhuǎn)染至MARC-145細胞,經(jīng)Western blot檢測siRNA在細胞中的干擾效率,結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)染siRNA 3的細胞中MID2蛋白的表達水平下降最為明顯,說明siRNA 3的干擾效率最好,可用于后續(xù)試驗(圖3D、E)。將siRNA3及陰性對照分別轉(zhuǎn)染到MARC-145細胞以敲低內(nèi)源性MID2的表達,然后接種PRRSV(MOI=0.1)。通過RT-qPCR檢測接毒24 h后細胞中PRRSV ORF7轉(zhuǎn)錄水平,同時通過Western blot檢測了敲低MID2后,病毒感染24 h時細胞中PRRSV N蛋白的表達水平,結(jié)果發(fā)現(xiàn),敲低MID2明顯上調(diào)PRRSV N蛋白的表達水平及ORF7的轉(zhuǎn)錄水平(圖3F、G),表明敲低MID2能夠促進PRRSV復(fù)制。以上結(jié)果表明,MID2是PRRSV復(fù)制的負調(diào)控因子,能夠顯著抑制PRRSV復(fù)制。

A.B. 過表達MID2對PRRSV N蛋白表達水平的影響;C. 過表達MID2對PRRSV ORF7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響;D、E. MID2干擾效率驗證;F. 敲低MID2對PRRSV N蛋白表達水平的影響;G. 敲低MID2對PRRSV ORF7 mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。*.P<0.05,***.P<0.001 A, B.Effects of overexpression of MID2 on PRRSV N protein expression levels; C. Effect of overexpression of MID2 on PRRSV ORF7 mRNA transcription levels;D, E. MID2 interference efficiency verification; F. Effects of knockdown of MID2 on PRRSV N protein expression levels; G. Effect of knockdown of MID2 on PRRSV ORF7 mRNA transcription levels.*.P<0.05,***.P<0.001圖3 MID2是PRRSV復(fù)制的負調(diào)控因子Fig.3 MID2 is a negative regulator of PRRSV replication

2.4 MID2正向調(diào)控I-IFN信號通路

為了探究MID2是否通過調(diào)控天然免疫信號通路影響PRRSV復(fù)制,作者將pGL3-IFN-β-Luc質(zhì)粒與pCMV-Flag-MID2真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中,對照組轉(zhuǎn)染pCMV-Flag空載,并分別用PBS和poly(I:C)進行刺激,通過雙熒光素酶基因報告試驗檢測IFN-β的啟動子活性。結(jié)果顯示,過表達MID2能夠顯著上調(diào)IFN-β的啟動子活性水平,且這種上調(diào)作用在poly(I:C)刺激后表現(xiàn)的更加明顯(P<0.05,圖4A)。為了驗證MID2的劑量是否會影響其對IFN-β的啟動子活性的調(diào)節(jié)作用,作者分別將不同劑量的pCMV-Flag-MID2(50、100、200和400 ng)與pGL3-IFN-β-Luc質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至HEK293T細胞中,進行雙熒光素酶基因報告試驗。結(jié)果顯示,過表達MID2能夠劑量依賴性上調(diào)poly(I:C)誘導(dǎo)的IFN-β的啟動子活性(P<0.05,圖4B)。隨后將siRNA-MID2及其陰性對照分別轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中,分別用poly(I:C)和PBS進行刺激,再次對IFN-β的啟動子活性進行檢測,發(fā)現(xiàn)poly(I:C)刺激后IFN-β的啟動子活性顯著升高,且敲低MID2明顯下調(diào)poly(I:C)誘導(dǎo)的IFN-β的啟動子活性(P<0.05,圖4C)。另外,作者在HEK293T細胞中過表達了pCMV-Flag-MID2質(zhì)粒,經(jīng)poly(I:C)刺激后,RT-qPCR檢測IFN-β、ISG15(IFN-stimulated gene 15)及ISG56(IFN-stimulated gene 56)基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示,過表達MID2能夠顯著上調(diào)poly(I:C)誘導(dǎo)的IFN-β、ISG15及ISG56的mRNA轉(zhuǎn)錄水平(圖4D～F)。以上結(jié)果說明MID2能夠正向調(diào)控I-IFN信號通路。

A. poly(I:C)刺激后,過表達MID2對IFN-β啟動子活性的影響;B. poly(I:C)刺激后,梯度過表達MID2對IFN-β啟動子活性的影響;C. poly(I:C)刺激后,敲低MID2對IFN-β啟動子活性的影響;D～F. poly(I:C)刺激后,過表達MID2對IFN-β及部分ISGs的mRNA轉(zhuǎn)錄水平的影響。ns. P>0.05,**. P<0.01, *** P<0.001, ****. P<0.000 1A. Effect of overexpression of MID2 on IFN-β promoter activity after poly(I:C) stimulation; B. Effect of gradient overexpression of MID2 on IFN-β promoter activity after poly(I:C) stimulation; C. Effect of MID2 knockdown on IFN-β promoter activity after poly(I:C) stimulation; D-F. Effects of overexpression of MID2 on mRNA transcription levels of IFN-β and some ISGs after poly(I:C) stimulation. ns. P>0.05,**. P<0.01, *** P<0.001, ****. P<0.000 1圖4 MID2正向調(diào)控I-IFN信號通路Fig.4 MID2 positively regulates the I-IFN signaling pathway

2.5 MID2與RIG-I相互作用

根據(jù)相關(guān)文獻報道,MID2與TRIM25的蛋白結(jié)構(gòu)域非常相似,二者的C端均含有PRY/SPRY結(jié)構(gòu)域。且有研究表明,TRIM25能與RIG-I發(fā)生相互作用[17]。因此,我們將pCMV-Flag-MID2真核表達質(zhì)粒和pCMV-Flag質(zhì)粒分別與pCMV-Myc-RIG-I真核表達質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中,轉(zhuǎn)染36 h后收樣,通過Co-IP試驗檢測二者之間是否存在相互作用。Western blot結(jié)果顯示,只有共轉(zhuǎn)染pCMV-Flag-MID2和pCMV-Myc-RIG-I后,在IP組能檢測到RIG-I蛋白,與預(yù)期結(jié)果一致,表明MID2和RIG-I之間存在相互作用(圖5A)。為了研究MID2對RIG的翻譯表達量是否有影響,作者分別將不同劑量的pCMV-Flag-MID2質(zhì)粒(0、1和2 μg)與1 μg的pCMV-Myc-RIG-I質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染到HEK293T細胞中。Western blot結(jié)果顯示,隨著MID2轉(zhuǎn)染劑量的增加,RIG-I的蛋白表達水平也顯著上調(diào)(圖5B)。以上結(jié)果說明,MID2與RIG-I之間存在相互作用,且MID2以劑量依賴的方式促進RIG-I的表達。隨后將pCMV-Flag空載、pCMV-Flag-MID2和pCMV-Flag-RIG-I質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染或共轉(zhuǎn)至HEK293T細胞中,通過雙熒光素酶基因報告試驗和RT-qPCR試驗分別檢測IFN-β的啟動子活性水平、IFN-β以及下游ISGs的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果顯示,MID2和RIG-I共轉(zhuǎn)時,IFN-β的啟動子活性水平、IFN-β mRNA轉(zhuǎn)錄水平以及下游ISGs的mRNA轉(zhuǎn)錄水平顯著高于單獨轉(zhuǎn)染RIG-I時的水平(圖5C～F),說明MID2能夠通過與RIG-I相互作用,促進RIG-I的蛋白表達,進而促進RIG-I介導(dǎo)的I-IFN信號通路,進一步增強抗病毒天然免疫反應(yīng)。

3 討 論

作為一種重要的病毒性傳染病,PRRS對世界各國的養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴重的威脅。在過去的三十年里,盡管在PRRSV的結(jié)構(gòu)、致病性、遺傳變異及免疫調(diào)控等方面取得了一定的研究進展,但是對于其入侵機體以及免疫逃逸的具體分子機制仍有待完善[1]。病毒與宿主蛋白之間的相互作用是病毒入侵機體的感染基礎(chǔ)和必然過程,同時也是宿主對抗病毒感染的重要手段。因此,深入研究病毒與宿主之間的相互作用有利于更好地了解病毒的感染機制,同時也能尋找到新的抗病毒因子,為病毒感染的精準防控以及抗病毒藥物的研發(fā)提供理論依據(jù)。

A. Co-IP檢測pCMV-Flag-MID2與pCMV-Myc-RIG-I的互作; B.梯度過表達pCMV-Flag-MID2質(zhì)粒,Western blot檢測RIG-I的表達水平; C. 雙熒光素酶報告基因檢測單獨轉(zhuǎn)染MID2、RIG-I及MID2與RIG-I共轉(zhuǎn)時IFN-β的啟動子活性; D～F. RT-qPCR檢測單獨轉(zhuǎn)染MID2、RIG-I及MID2與RIG-I共轉(zhuǎn)時,IFN-β、ISG15、ISG56的mRNA轉(zhuǎn)錄水平。***. P<0.001A. Co-IP detects the interaction between pCMV-Flag-MID2 and pCMV-Myc-RIG-I; B. After gradient overexpression of pCMV-Flag-MID2 plasmid, the expression levels of RIG-I was detected by Western blot; C. Dual-luciferase reporter gene assay were used to detect the promoter activity of IFN-β transfected with MID2, RIG-I alone, and MID2 cotransfected with RIG-I; D-F. mRNA transcription levels of IFN-β, ISG15 and ISG56 were determined by RT-qPCR when MID2 and RIG-I were transfected alone or MID2 was co-transfected with RIG-I.***. P<0.001圖5 MID2能夠和RIG-I發(fā)生互作Fig.5 MID2 interacts with RIG-I

最近的研究表明,多數(shù)TRIM家族蛋白都具有抗病毒的功能,在抑制病毒復(fù)制的過程中發(fā)揮重要作用。TRIM家族蛋白主要通過兩種途徑來發(fā)揮功能:一種是通過調(diào)節(jié)抗病毒先天免疫應(yīng)答的信號通路來抑制病毒復(fù)制,如TRIM56能誘導(dǎo)cGAS的Lys335位點泛素化,促進HSV-1感染后HEK293 T和Vero細胞中cGAS介導(dǎo)的IFNα/β的產(chǎn)生[18];TRIM21能與MAVS相互作用,催化MAVS發(fā)生K27連接的多泛素化,促進IRF3的激活,從而增強I型IFN信號通路,抑制CVB3在心肌細胞中的復(fù)制[19]。TRIM蛋白發(fā)揮功能的另一種方式是直接靶向病毒成分,通過降解或非降解機制導(dǎo)致病毒蛋白的降解或功能抑制,從而中斷病毒的生命周期,如TRIM32通過直接靶向PB1聚合酶并對其進行泛素化修飾來感知和抑制甲型流感病毒復(fù)制[20]。此外,有些TRIM家族蛋白還能夠同時進行以上兩種途徑來調(diào)控病毒的復(fù)制,如在感染IAV后,TRIM35一方面通過對TRAF3進行K63連接的泛素化修飾,促進RIG-I抗病毒信號級聯(lián)反應(yīng)的激活和I型IFN的產(chǎn)生,另一方面通過泛素-蛋白酶體系統(tǒng)降解病毒的PB2蛋白,從而抑制IAV復(fù)制[20]。在本研究中,作者通過雙熒光素酶報告基因試驗檢測到過表達MID2能夠促進IFN-β的啟動子活性,說明MID2可能是通過上調(diào)I型干擾素信號通路來抑制PRRSV的復(fù)制。

MID2的C端具有PRY/SPRY結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域在TRIM家族蛋白中最為常見。PRY/SPRY結(jié)構(gòu)域可以幫助TRIM蛋白形成多聚信號體,與細胞內(nèi)抗體相互作用,參與調(diào)節(jié)體內(nèi)免疫應(yīng)答,被認為是TRIM家族蛋白與其他蛋白質(zhì)和RNA結(jié)合的部位,具有非常重要的研究價值[21]。此外,對TRIM5α、TRIM25等蛋白的研究表明,該結(jié)構(gòu)域還與限制病毒復(fù)制的功能有關(guān)。如:TRIM5α能夠通過SPRY與coiled-coil結(jié)構(gòu)域之間的互作提高自身識別逆轉(zhuǎn)錄病毒衣殼蛋白的能力[22];TRIM25能夠通過SPRY結(jié)構(gòu)域與RIG-I發(fā)生相互作用,并對RIG-I進行K63連接的泛素化修飾,導(dǎo)致RIG-I下游信號傳導(dǎo)活性顯著增加[17]。在本研究中,作者通過Co-IP試驗,發(fā)現(xiàn)MID2能夠與RIG-I相互作用,且以劑量依賴的方式促進RIG-I的表達,進一步增強RIG-I介導(dǎo)的I-IFN信號通路的激活及下游抗病毒基因的表達,但二者發(fā)生互作的具體結(jié)構(gòu)域有待后續(xù)深入研究。

4 結(jié) 論

MID2是PRRSV復(fù)制過程中一個重要的負調(diào)控因子,在PRRSV感染后表達上調(diào),且MID2能夠上調(diào)IFN-β的啟動子活性。此外,MID2通過靶向RIG-I從而正調(diào)控I-IFN抗病毒免疫應(yīng)答,從而抑制PRRSV的增殖。