中華鱉高雄性率調(diào)控技術(shù)研究進展

鄭 露，蔣業(yè)林*，程云生，侯冠軍，王 芬，季索菲，王佳佳，李 翔

(1.安徽省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水產(chǎn)研究所，安徽合肥 230031；2.安徽省鱉類良種繁育與健康養(yǎng)殖工程技術(shù)研究中心，安徽蚌埠 233000，3.安徽省喜佳農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司，安徽蚌埠 233000)

中華鱉(Pelodiscussinensis)隸屬于爬形綱龜鱉目，營養(yǎng)價值高，是我國廣為分布和養(yǎng)殖的名貴食用水產(chǎn)動物[1]。近年來，我國中華鱉人工養(yǎng)殖發(fā)展迅速，但病害卻十分嚴重，控制傳染病的發(fā)生和蔓延，對提高養(yǎng)鱉效益、降低生產(chǎn)成本尤為重要。在中華鱉實際生產(chǎn)和科研探索歷程中，發(fā)現(xiàn)中華鱉雄性個體比雌性個體生長速度快，裙邊厚實，膠原蛋白豐富，發(fā)病少，養(yǎng)殖成活率高，不管是養(yǎng)殖戶還是消費者更加青睞于雄性中華鱉的養(yǎng)殖和食用。因此，在生產(chǎn)中提高中華鱉的雄性率對于推動中華鱉產(chǎn)業(yè)更快更好地發(fā)展具有重要意義。

有關(guān)爬行類的單性控制，國外學(xué)者曾做過一些研究，Bull[2]報道，爬行類中有些種類的性別決定與孵化溫度密切相關(guān)。國外研究成果中也涉及到多種性激素對龜鱉類性別控制技術(shù)的報道，Bentley[3]指出雌性黃喉水龜血漿中的雌二醇含量在產(chǎn)卵前后期處于波動狀態(tài)，含量較高時出現(xiàn)在產(chǎn)卵前，含量較低時出現(xiàn)在剛產(chǎn)完卵和產(chǎn)卵后期。卵產(chǎn)出后，卵巢內(nèi)的卵泡逐漸變大，血漿中的雌二醇含量隨之升高。說明雌二醇能夠刺激黃喉水龜卵的發(fā)育，促進卵的成熟。

國內(nèi)有關(guān)中華鱉的性別控制研究的報道中，溫度和外源激素是常用于中華鱉性別分化調(diào)控的關(guān)鍵因子，而外源激素中的雌二醇、甲基睪丸酮、芳香化酶抑制劑是研究最多的激素種類。通過對最新相關(guān)研究文獻綜述，并對有關(guān)技術(shù)的應(yīng)用前景進行分析，以指導(dǎo)中華鱉高雄性人工誘導(dǎo)技術(shù)在生產(chǎn)上廣泛應(yīng)用，促進該產(chǎn)業(yè)生產(chǎn)效率的提高。

1 中華鱉高雄性率研究

1.1孵化溫度孵化溫度對于大部分魚類、兩棲類、爬行類動物的性別分化和性腺發(fā)育影響顯著，大多數(shù)龜鱉目動物都具有溫度依賴型性別決定(temperature-dependent sex determination，TSD)，溫度對影響中華鱉孵化和發(fā)育的作用很大，具體表現(xiàn)在孵化溫度可以決定稚鱉的性別比例、影響孵化周期的長短和孵化率的高低[4]。

針對溫度對于中華鱉性別分化等的影響方面，國內(nèi)外很多學(xué)者都做了大量研究。羅曼等[5]認為孵化溫度在(27～29)±0.5 ℃，分期前保持濕度85%，孵化率可以達到95%以上，并且在24～26 ℃時，孵化出來的個體中雄性和雌性的比例大于1，溫度在26.0～27.5 ℃時，孵化出來的個體中雄性和雌性的比例小于1。阮成旭等[6]在32 ℃條件下孵出的雄性比例為64.1%，32 ℃孵化出的雌性比例是34.3%，與聶劉旺等[7]的結(jié)論和以上結(jié)果相差無幾，認為在29 ℃孵化下性別比例接近1∶1。巫旗生等[8]研究發(fā)現(xiàn)，中華鱉在32 ℃孵化雄性率高，27 ℃孵化雌性率高。

目前，關(guān)于孵化溫度對中華鱉性別分化的影響仍然有爭議，就溫度在32 ℃情況下中華鱉雄性率的研究結(jié)果也有差異。任少亭等[9]在該溫度下雄性孵化率為85%，朱道明等[10]認為同溫度下雄性孵化率為88%。也有部分研究認為，鱉卵孵化有2個極限溫度，孵化溫度在<26 ℃和>36 ℃的情況下，胚胎無法成活，溫度在26～30 ℃雌性個體居多，在30～34 ℃時，雌雄個體都有，而在34～36 ℃時雄性個體占比較大。這些研究結(jié)果的差別可能與孵化介質(zhì)、濕度以及所處環(huán)境有很大關(guān)系。雖然試驗結(jié)果不同，但均表明孵化溫度確實可以影響中華鱉的性別。綜合大量試驗表明：在一定溫度(26～36 ℃)范圍內(nèi)，隨著溫度升高，中華鱉雄性率提高，最適孵化溫度在32 ℃左右，雄性率最高可達90%以上。

1.2外源激素動物性別的決定和性別的分化與很多因素有關(guān)，除了基因和溫度對性別分化有重要影響外，眾多類固醇激素也起到關(guān)鍵的調(diào)控作用。在眾多外源激素中，雌二醇、甲基睪丸酮、芳香化酶抑制劑對于中華鱉性別分化的影響最大。

1.2.1雌二醇。雌二醇(Estradiol，E2)是雌激素中的一種天然激素，作用于性腺分化不明顯時期，能夠有效調(diào)節(jié)脊椎動物卵巢的生長和發(fā)育，刺激并誘導(dǎo)性腺向雌性方向轉(zhuǎn)化，誘導(dǎo)性腺快速成熟[11]。

方永強等[12]在鯔魚性別未分化期，喂食添加E2的飼料，鯔魚可全雌發(fā)育，且比未經(jīng)處理的鯔魚發(fā)育快，進入性成熟。在卵巢分化時期，E2處理可降低睪酮的水平，從而改變雌雄激素比例，誘導(dǎo)雌性化的發(fā)生。E2在性腺未分化時期促進其發(fā)育，在性腺發(fā)育成熟后，亦可改變其性別。溫茹淑等[13]用E2作用于性腺發(fā)育成熟的劍尾魚，發(fā)現(xiàn)精巢內(nèi)的精小囊數(shù)量減少，精原細胞發(fā)育停滯，精子數(shù)量稀少甚至沒有。孫鵬[14]用E2處理雄性中華絨螯蟹后，雄性性腺的繼續(xù)發(fā)育受到抑制，性腺退化，并且逐漸朝雌性發(fā)育，造成這種現(xiàn)象期主要是由于雄性特異基因表達的降低和雌性特異基因表達的增高。

唐瑤[15]在中華鱉卵性別分化期注射E2，發(fā)現(xiàn)E2等能夠明顯減少中華鱉的孵化時間，且孵化的中華鱉全部為雌性。將添加E2的飼料投喂給剛孵化的雄性稚幼鱉，性別并未像前面報道的劍尾魚一樣發(fā)生性別轉(zhuǎn)化，說明雌二醇不能使已孵化出卵的中華鱉性別特征發(fā)生改變。王莉等[16]在中華鱉性腺分化早期使用E2對胚胎進行處理，發(fā)現(xiàn)E2能顯著降低雄性性別關(guān)鍵因子DMRT1、SOX9 mRNA 和蛋白表達水平，從而抑制雄性分化，促進卵巢細胞發(fā)育?？梢娨欢舛鹊拇贫紝τ谥腥A鱉分化為雌性個體具有很好的誘導(dǎo)作用，但是超過一定濃度以后，隨著濃度的增加雌性率下降。

1.2.2甲基睪丸酮。甲基睪丸酮(MT)又名甲基睪丸素，是一種人工合成的雄性激素，一般為白色或乳白色結(jié)晶性粉末，能夠促進雄性動物精巢的發(fā)育和成熟，在水產(chǎn)領(lǐng)域應(yīng)用較多。在魚類性腺誘導(dǎo)方面作用明顯，且不同濃度對各種魚類有不同的生物學(xué)作用，國內(nèi)外有大量研究報道。國內(nèi)張虹[17]將拌有100 μg/g的17-α-甲基睪丸酮的飼料投喂于雌核發(fā)育的草魚，發(fā)現(xiàn)73.3%個體性腺有向精巢發(fā)育的趨勢，且有23.3%的個體性腺發(fā)育遲緩，出現(xiàn)畸形，而對照組性腺發(fā)育正常，雌雄比例均衡，表明17-α-甲基睪丸酮能有效誘導(dǎo)雌核發(fā)育草魚性腺向雄性轉(zhuǎn)化。

范俊杰等[18]研究不同濃度MT對雌性食蚊魚形態(tài)雄性化的影響，設(shè)置4個濃度梯度(0、5、50、500 nmol/L)，采用浸浴法處理生長發(fā)育期間的雌性個體，結(jié)果表明MT雌激素效應(yīng)明顯，且濃度在50～500 nmol/L范圍內(nèi)，隨著濃度增大，雌魚在生長發(fā)育過程中出現(xiàn)形態(tài)雄性化比例增大。

國外相關(guān)研究報道也比較多，Bhandari等[19]用MT處理尼羅羅非魚雌性個體，結(jié)果表明在性別分化期外源性雄激素通過抑制類固醇關(guān)鍵酶，實現(xiàn)羅非魚雄性化。Chatain等[20]采用17α-甲基去氫睪丸酮投喂的方法獲得了全雄性舌齒鱸。Wassermann等[21]采用雄性激素浸泡處理成功誘導(dǎo)尼羅羅非魚的性反轉(zhuǎn)，雄性率最高可達100%。Piferrer等[22]研究表明，提高17α-甲基睪丸酮濃度卻導(dǎo)致銀大馬哈魚雌性比例增加。

MT對中華鱉性別分化方面的影響也有報道，胡增高[23]對3種龜鱉目血漿中性激素隨季節(jié)性的變化進行研究，發(fā)現(xiàn)中華鱉雄性個體血漿中性激素含量最低，而在交配期血漿中睪酮含量最高，說明睪酮能促進精子的形成。唐瑤[15]分別以濃度為25、50、100 mg/kg的MT投喂孵化出卵的仔稚鱉，在喂養(yǎng)到30 d時，稚鱉雄性特征顯現(xiàn)。表明在性別決定前用甲基睪丸素處理可以提高仔稚鱉的雄性率。而葉玉珍等[24]以甲基睪丸素處理不同時期的中華鱉胚胎，所孵出的鱉在出生后的第1天就能觀察到明顯的雄性副性征，并且100%的個體外部形態(tài)發(fā)生很大改變，生殖器明顯外翻，背甲稍長，尾巴粗長并露出背板的裙邊。通過查閱大量文獻，指出適宜濃度的MT能夠促進中華鱉雄性性腺的發(fā)育，對于提高雄性率意義重大。

1.2.3芳香化酶抑制劑。在類固醇激素的代謝過程中，通常需要多種酶的參與和催化，其中一種酶稱為芳香化酶(aromatase)，是體內(nèi)催化雄激素轉(zhuǎn)化為雌激素的關(guān)鍵酶，這一轉(zhuǎn)化過程對魚類、鳥類、爬行類和兩棲類等脊椎動物的性別分化和性腺發(fā)育是必不可少的。芳香化酶抑制劑(AI)通過抑制芳香化酶的活性，從而抑制雌激素的合成和分泌，使胚胎內(nèi)雌激素減少而雄性激素相對增加，使胚胎向雄性轉(zhuǎn)化。

AI在水產(chǎn)動物研究中應(yīng)用較廣，在魚類研究中相關(guān)報道也較多。國內(nèi)李廣麗等[25]采用腹部埋植方式將AI作用于2齡雌性赤點石斑魚性腺，試驗過程中魚類卵母細胞逐漸退化，而精原細胞大量增殖，幼魚由雌性轉(zhuǎn)為雄性，成功實現(xiàn)性逆轉(zhuǎn)，說明AI在魚類性別分化上誘導(dǎo)作用明顯。傅麗容等[26]研究AI對中華條頸龜性別的控制，指出在30 ℃條件下孵化受精卵，在孵化20 d時涂抹一定濃度的AI，暫養(yǎng)7 d后進行性別鑒定，試驗組雄性率最高可達95%，而對照組雄性率最高為63%，說明AI能夠有效提高中華條頸龜?shù)男坌月省?/p>

賈一何[27]為了研究芳香化酶對烏蘇里擬鲿仔魚生理結(jié)構(gòu)的影響，將不同濃度的AI飼料投喂開口2d的小仔魚，連續(xù)投喂90 d，飼養(yǎng)到195日齡時觀察其生長和性腺發(fā)育情況。結(jié)果表明：AI對于烏蘇里擬鲿生長沒有促進作用，但是能夠抑制芳香化酶合成雌激素，導(dǎo)致雌性仔魚卵巢內(nèi)細胞排列不規(guī)則，卵細胞不能正常發(fā)育。張厚梅等[28]為了研究芳香化酶與黃鱔(monopterus albus)性逆轉(zhuǎn)之間的內(nèi)在聯(lián)系，以不同性別黃鱔的性腺和腦組織為試驗材料，采用免疫組化方法檢測芳香化酶在不同性別黃鱔的性腺和腦組織上的定位及其變化趨勢。結(jié)果顯示：雌性黃鱔性腺中，芳香化酶主要分布在成熟卵母細胞的細胞質(zhì)上，雄性黃鱔性腺中，主要分布在各級精母細胞上。分布在腦組織中的AI在黃鱔由雌性轉(zhuǎn)化為雄性過程中含量逐漸減少，意味著黃鱔性腺和腦組織中的芳香化酶可能參與黃鱔的性逆轉(zhuǎn)過程。

國外關(guān)于AI在魚類性別分化方面也有報道，Piferrer等[29]以濃度為10 mg/dm3AI浸泡性別未分化的大鱗大麻哈魚，處理2 h后發(fā)現(xiàn)原來具有雌性遺傳基因的個體發(fā)育為雄性，且雄性性腺的形態(tài)和結(jié)構(gòu)與正常雄魚無差異。

關(guān)于AI在中華鱉研究方面，王莉等[16]采用AI在中華鱉胚胎孵化的第15期和第17期，滴加50 μg/μL的AI 5 μL，待孵化出殼后對其性腺進行染色分析，發(fā)現(xiàn)其性腺結(jié)構(gòu)明顯雄性化且雌性比例顯著下調(diào)至13.1%。包海聲等[30]將中華鱉受精卵在恒溫恒濕培養(yǎng)箱中孵化至15 d時，在正對胚胎的卵殼位置上滴加20 μg/μL的AI，第2天重新滴加相同劑量的藥物，置于相同環(huán)境下繼續(xù)孵化，孵化至25期時收集胚胎性腺。試驗結(jié)果表明，經(jīng)過AI處理的中華鱉性腺內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，呈現(xiàn)雌性向雄性轉(zhuǎn)化現(xiàn)象，數(shù)據(jù)統(tǒng)計顯示，對照組中雄性稚鱉占51.0%，而AI處理組中，雄性比例顯著增加到91.9%。

綜合大量試驗結(jié)果表明：一定濃度AI通過抑制芳香化酶的分泌，從而抑制雌性激素的合成，在生產(chǎn)實踐中有效抑制中華鱉體內(nèi)該激素的分泌對于提高雄性率意義重大。

2 中華鱉高雄性率調(diào)控技術(shù)應(yīng)用

依據(jù)中華鱉高雄性率相關(guān)研究及可行性、方便操控、使用成本低的原則，不同的企業(yè)可選擇相應(yīng)的調(diào)控技術(shù)進行產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)。目前，控溫控濕孵化房、控溫控濕孵化箱、外源激素人工誘導(dǎo)法等幾種措施均在生產(chǎn)中得到應(yīng)用，而控溫控濕孵化房在當前實現(xiàn)中華鱉高雄性率產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用中最普遍。

祝茜等[31]通過孵化試驗表明，人工孵化比自然孵化損耗小，可以提高孵化率，大大縮短孵化時間，而調(diào)溫調(diào)濕箱是最穩(wěn)定和方便的孵化方式，能達到高孵化率的效果。在缺乏此設(shè)備時，因陋就簡，用自制孵化盤孵化，細心管理，保持適宜的溫度和濕度，也能達到較高的孵化率。林輝[32]認為鱉卵人工孵化的關(guān)鍵是控制孵化室的溫度和濕度，室內(nèi)溫度控制在32～33 ℃，此時孵化箱內(nèi)沙溫為30～31 ℃，室內(nèi)相對濕度為80%～85%。邢春英[33]對中華鱉采取控溫孵化，控制恒溫在30 ℃，41～42 d便會全部出殼，出殼率可達95%以上，而且稚鱉對卵黃吸收完全，體質(zhì)健壯，養(yǎng)殖成活率相對較高。因此，在中華鱉產(chǎn)業(yè)化良種生產(chǎn)中，使用控溫控濕孵化房和孵化箱，能較好地實現(xiàn)中華鱉高雄性率。

3 結(jié)語

動物的性別研究一直都是發(fā)育生物學(xué)和進化生物學(xué)探討的熱點話題，由于很多動物性別的可塑性，很多專家學(xué)者希望通過控制其性別來提高在某方面的利用價值。由于中華鱉個體雄性較雌性具有更高的經(jīng)濟價值，養(yǎng)殖戶更加熱衷于雄性的孵化和養(yǎng)殖。在這個研究過程中，如果能找到一種操作簡便、成本低廉且高子代雄性率的誘導(dǎo)技術(shù)，將會大大提升中華鱉產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。為此，闡述影響中華鱉雄性率的主要因子，從國內(nèi)外大量研究資料中總結(jié)得出一些結(jié)論。當然，在中華鱉性別分化方面還存有未知領(lǐng)域，有待今后進一步探索。