番茄黃化曲葉病毒（TY）侵染性克隆接種鑒定方法研究

張少麗，邵景成，胡志峰

（甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所，甘肅 蘭州 730070）

番茄已成為我國種植面積最大的蔬菜作物之一，但由于番茄黃化曲葉病毒?。═Y）的大面積爆發(fā)，嚴重制約了番茄產(chǎn)業(yè)的進一步發(fā)展。據(jù)各地植保部門的不完全統(tǒng)計，我國番茄TY的年發(fā)生面積超過6.7萬hm2，年經(jīng)濟損失至少20億元［1～2］。TY一旦發(fā)生，防治效果較差。預(yù)防該病最有效的措施是培育抗病品種，而抗病品種的選育，從抗源材料的篩選、后代分離群體的選擇，直到品種的推廣，都離不開抗病性鑒定。

目前對TY鑒定方法有分子標記檢測、帶毒煙粉虱侵染、發(fā)病環(huán)境下自然接種、含TY-DNA的侵染性克隆注射接種等。雖然分子標記簡單易行，但由于其與抗病基因間存在一定的遺傳距離，檢測結(jié)果與實際抗病性間很難達到100%吻合，需要結(jié)合其它方法做進一步的驗證。在沒有自然發(fā)病的地區(qū)利用帶毒煙粉虱侵染、發(fā)病環(huán)境下自然接種的方法，生態(tài)風(fēng)險很大，采用TY-DNA的侵染性克隆注射接種法可彌補以上不足［3］。甘肅省蘭州市尚未發(fā)現(xiàn)TY的發(fā)生，我們開展了TY-DNA侵染性克隆接種鑒定方法研究，初步確立了一套無發(fā)病區(qū)采用侵染性克隆接種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，以期為抗TY番茄品種的選育和防止TY的發(fā)生提供有效手段。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

供試番茄品種為感TY番茄品種MM、中蔬4號（由中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜花卉研究所提供）和鮮食番茄雜交組合98-B1（由甘肅省農(nóng)業(yè)科學(xué)院蔬菜研究所提供）。

用于苗期接種的TY-DNA侵染性克隆pBin-PLUS-1.7A+2β（農(nóng)桿菌）引自浙江大學(xué)周雪平教授實驗室。

1.2 實驗方法

1.2.1 育苗 實驗材料于2014年5月12日播種于50孔的育苗穴盤中，置育苗溫室中培養(yǎng)，4～6葉時進行苗期接種。

1.2.2 培養(yǎng)基配制 液體培養(yǎng)基配制：YEP1—牛肉膏1%，酵母提取液1%，NaCl 0.5%，pH 7.0；YEP2—胰蛋白胨1%，酵母提取液1%，NaCl 0.5%，pH 7.0。固體培養(yǎng)基是在上述液體培養(yǎng)基中分別加入0.8%的瓊脂即可。

1.2.3 農(nóng)桿菌的培養(yǎng) 將配制好的培養(yǎng)基在120℃下滅菌30 min，取出晾至37℃左右，加入利福平（50 mg/L）和卡那霉素（50 mg/L）。在液體培養(yǎng)基中接入農(nóng)桿菌菌種，200 r/min、28℃過夜搖菌，進行活化。將活化好的農(nóng)桿菌接種于固體培養(yǎng)基中28℃倒置暗培養(yǎng)，得到固體菌落。挑取單菌落，接種于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，培養(yǎng)至菌液濃度為OD600≈0.6、OD600≈1.0。共得到 6種不同狀態(tài)的含TY-DNA的農(nóng)桿菌，即YEP1固體菌落、YEP1液體菌菌液濃度OD600≈0.6、YEP1液體菌菌液濃度OD600≈1.0；YEP2固體菌落、YEP2液體菌菌液濃度OD600≈0.6、YEP2液體菌菌液濃度OD600≈1.0。

1.2.4 接種 于2014年6月18日（番茄4～6葉苗齡）時進行接種。菌液接種時采用韌皮部（距根部1～2 cm處）人工注射接種［3］，每株0.5 mL左右，每品種每處理各接種10株。固體菌落接種時，用牙簽戳破韌皮部（距根部1～2 cm處），刮取固體菌落，涂抹于傷口，每品種接種10株，對照（不接種）為10株。接種后20、30、45 d觀察植株發(fā)病癥狀，統(tǒng)計發(fā)病率。

圖1 MM、中蔬4號、98-B1接種30 d植株發(fā)病情況（以YEP2液體菌菌液濃度OD600≈0.6接種為例）

2 結(jié)果與分析

2.1 番茄TY的發(fā)病過程

對接種植株觀察發(fā)現(xiàn)，接種后20 d內(nèi)植株不表現(xiàn)發(fā)病癥狀。接種后30 d時，大部分接種植株上部葉片出現(xiàn)輕微黃化，各處理間發(fā)病程度無差異，但品種間發(fā)病程度不同，具體發(fā)病程度由高到低依次表現(xiàn)為MM、中蔬4號、98-B1（見圖1）。接種后45 d時，接種植株明顯生長緩慢或停滯，上部葉邊緣上卷、黃化、皺縮，表現(xiàn)為充分感病，各處理間及品種間發(fā)病程度差異均不明顯（見圖2）。

圖2 MM、中蔬4號、98-B1接種45 d植株發(fā)病情況（以YEP2液體菌菌液濃度OD600≈0.6接種為例）

2.2 植株發(fā)病情況

接種45 d后，所有接種植株已充分發(fā)病，而同一穴盤的對照植株完全正常，說明該病不會通過土壤、水分傳播，也表明育苗溫室內(nèi)不存在傳毒媒介煙粉虱。處理發(fā)病率統(tǒng)計結(jié)果（表1）表明，處理間差異不明顯，固體菌落接種以YEP2固體菌落接種的發(fā)病率效果較高，液體菌菌液接種以YEP1液體菌菌液濃度OD600≈0.6和YEP2液體菌菌液濃度OD600≈0.6接種的發(fā)病率效果較好。綜合考慮認為，當(dāng)液體菌（無論YEP1還是YEP2）菌液濃度為OD600≈0.6時，發(fā)病效果較好。

表1 接種植株發(fā)病率調(diào)查結(jié)果

3 小結(jié)與討論

1）利用含TY-DNA的侵染性克隆進行注射接種，無論是被用做番茄轉(zhuǎn)基因研究的常用品種MM、中蔬4號，還是鮮食番茄雜交組合98-B1，都能正常發(fā)病，發(fā)病程度也無太大差異，預(yù)示該方法有一定的廣適性。

2） 根據(jù)研究結(jié)果初步判定，各處理間差別不明顯。相比之下，當(dāng)2種液體培養(yǎng)基菌液濃度為OD600≈0.6時發(fā)病率較高。但采用固體菌落接種操作簡單，易于掌握，適合大量材料的鑒定。

3）從環(huán)境安全方面考慮，侵染性克隆接種方法具有很大優(yōu)勢，不會帶來生態(tài)風(fēng)險。另外，該方法能夠比較客觀的反應(yīng)材料的真實抗病性，大大降低了自然接種下不同年份環(huán)境因素的干擾及帶毒煙粉虱的喜食偏好等因素的影響。

4）本實驗對2種不同培養(yǎng)基培養(yǎng)的固體菌落及不同濃度的菌液進行了接種比較，初步確立了一套無發(fā)病區(qū)采用侵染性克隆接種鑒定番茄黃化曲葉病毒抗性的方法，為今后的抗TY番茄品種的選育奠定了基礎(chǔ)。

［1］ 龔一帆，杜永臣，謝丙炎，等.威脅番茄生產(chǎn)的新病害——番茄黃化曲葉病毒病［J］.中國蔬菜，2009（21）：1-4.

［2］ 胡志峰，邵景成.甘肅省設(shè)施番茄黃化曲葉病毒病的發(fā)生與防治［J］. 甘肅農(nóng)業(yè)科技，2014（1）：54-56.

［3］ 陶小榮.中國番茄黃化曲葉病毒致病分子機理及其衛(wèi)星DNA誘導(dǎo)的基因沉默研究［D］.杭州：浙江大學(xué)，2004.