荷移光譜法測定雞肉中左氧氟沙星殘留*

龐艷玲，孟德素

(菏澤學(xué)院化學(xué)化工系，山東菏澤，274015)

左氧氟沙星(LVFX)為化學(xué)合成的抗菌藥，是第四代喹諾酮類藥物，具有抗菌譜廣、抗菌作用強、使用安全等特點，是治療泌尿、呼吸道、胃腸系統(tǒng)細(xì)菌感染性疾病的首選藥物，目前測定分析方法主要是熒光法［1］、紫外分光光度法［2］、HPLC 法［3］、紫外吸收系數(shù)法［4］、紫外檢測法［5］、毛細(xì)管電泳法［6］、高效液相色譜法［7～8］、一階導(dǎo)數(shù)分光光度法［9］等。幾年來，部分養(yǎng)殖戶存在不合理甚至“濫用”左氧氟沙星的現(xiàn)象，由此形成了畜禽產(chǎn)品左氧氟沙星殘留超標(biāo)的安全隱患。

荷移反應(yīng)是基于電子給體和電子受體之間的電荷轉(zhuǎn)移形成荷移復(fù)合物的一類反應(yīng)，由于荷移絡(luò)合物的形成，使吸收光譜發(fā)生較大幅度紅移，從而避開藥物制劑或體液中其他物質(zhì)的干擾，使其選擇性顯著提高。本文研究了左氧氟沙星與茜素的荷移反應(yīng)，確定了最佳反應(yīng)條件，并對反應(yīng)機理進行了初步探討。

1 儀器與試劑

TU-1810型紫外可見分光光度計，北京普析通用儀器有限公司;紅外光譜儀，傅里葉紅外光譜儀-FTIR370;pHS-3型精密酸度計，上海雷磁儀器廠。

左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品，中國食品藥品檢定研究院含量97%;茜素，中國醫(yī)藥公司上?；瘜W(xué)試劑采購供應(yīng)站。

雞肉，市購。所用試劑若無特別說明均為分析純，試驗用水為去離子水。

2 實驗方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

(1)茜素標(biāo)準(zhǔn)溶液溶液:準(zhǔn)確稱取茜素13.0 mg溶于無水乙醇中，并定容至100 mL。

(2)左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液:準(zhǔn)確稱取左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品10.3 mg，溶解并定容至100 mL。

(3)BR緩沖溶液的配制:在100 mL三酸混合液(磷酸、乙酸、硼酸，濃度均為0.04 mol/L)中，用0.2 mol/L NaOH溶液調(diào)至不同pH值的緩沖溶液。

(4)準(zhǔn)確移取左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液2 mL于10 mL比色管中，加入1 mL茜素溶液并加水定容，搖勻后在室溫下放置10 min，以同種方法配制試劑空白作參比，在532 nm處測其吸光度。

2.2 實驗條件優(yōu)化

2.2.1 吸收光譜

圖1 左氧氟沙星(1)、茜素(2)和絡(luò)合物(3)的可見吸收光譜圖Fig.1 The Vis spectra of LVFX(1)，Alizarin(2)and complex(3)

按照試驗方法配制溶液，在400～700 nm內(nèi)分別掃描左氧氟沙星、茜素和配制溶液的吸收光譜(圖1)。左氧氟沙星在可見光區(qū)沒有吸收峰，茜素在435 nm處有最大吸收，左氧氟沙星和茜素生成的絡(luò)合物在532 nm處有最大吸收，最大吸收發(fā)生紅移且吸收強度增大。在532 nm處的吸光度與左氧氟沙星濃度成正比，據(jù)此擬定測定左氧氟沙星的分析方法，實驗證明該方法可行。

2.2.2 反應(yīng)時間的影響

按照試驗方法配制溶液，在室溫下分別反應(yīng)10、20、30、40、50、60 min 后，在 532 nm 處測其吸光度，結(jié)果表明，絡(luò)合物的吸光度不隨時間變化而變化。

2.2.3 反應(yīng)溫度的影響

按照2.1(3)配制溶液，分別在20、25、30、35、40、45℃ 下保溫10 min后，冷卻至室溫，并在532 nm處測其吸光度。結(jié)果表明，溫度對絡(luò)合物的吸光度影響不大，本實驗選室溫反應(yīng)即可。

2.2.4 試劑用量的影響

按照2.1(3)配制溶液，只改變左氧氟沙星用量分別為1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL 時，測其吸光度。結(jié)果表明，LVFX用量為2 mL時反應(yīng)可以完全進行。

2.2.5 酸堿度的影響

按照2.1(3)配制6份溶液，分別向其中加入不同pH的標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液，測其吸光度。結(jié)果表明，酸性和堿性溶液中吸光度降低，所以本實驗采用中性環(huán)境。

2.2.6 溶劑的影響

按照2.1(3)配制溶液，分別用不同溶劑溶解茜素，測定溶液吸光度。結(jié)果表明，溶劑對絡(luò)合物吸光度影響不大，考慮到實驗成本和環(huán)境效應(yīng)，所以本實驗采用乙醇作溶劑。

2.2.7 溶劑比例的影響

按照2.1(3)配制溶液，分別改變水和乙醇的比例，測定溶液吸光度。結(jié)果表明，

溶劑比例對絡(luò)合物吸光度影響不大，所以本實驗采用加水定容即可。

2.2.8 方法重現(xiàn)性

按照2.1(3)配制6份溶液并測其吸光度。結(jié)果如表1所示。由表1可知，6次測定結(jié)果的RSD是1.35%。

表1 精密度的測定Table 1 The determination of precision

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

按照試驗方法配制溶液，對測得數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計，處理得回歸方程為A=0.017 9c-0.011 3，相關(guān)系數(shù)是0.999 6，表觀摩爾吸光系數(shù)ε=6.47×103L/(mol·cm)，左氧氟沙星在1～50 mg/L符合比爾定律。

2.3 荷移絡(luò)合物組成及穩(wěn)定常數(shù)的測定

利用等摩爾連續(xù)變換法測得左氧氟沙星與茜素作用生成的荷移絡(luò)合物的組成比為1∶1，絡(luò)合物表觀穩(wěn)定常數(shù)為2.85×105。

2.4 反應(yīng)機理的探討

用KBr壓片法分別測左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)品、茜素固體與絡(luò)合物晶體的紅外光譜。比較光譜圖可知，左氧氟沙星哌嗪環(huán)上與—CH3相連的C-N伸縮振動峰由1 048.73 cm-1絡(luò)合后移至1 079.39 cm-1，波數(shù)增大，強度也顯著增大;4位酮基的振動峰由1 624.11 cm-1移至1619.17 cm-1，變化不大，其他特征峰位置和相對強度變化不大，表明電子給予體左氧氟沙星，是哌嗪環(huán)上與—CH3相連的N原子上的孤對電子發(fā)生了轉(zhuǎn)移。而作為電子受體的茜素，振動峰由1 632.81 cm-1移至1 619.71 cm-1，波數(shù)減小;其他峰的位置和強度變化不大，表明電子接受體左氧氟沙星，是中間的對苯醌環(huán)接受了電子。

左氧氟沙星中的氮原子上有一對孤對電子可作為n-π電子給予體，茜素是一平面缺電子體系，可作為電子接受體，左氧氟沙星與茜素作用形成n-π電荷轉(zhuǎn)移絡(luò)合物。根據(jù)荷移絡(luò)合物的組成和兩種反應(yīng)物的結(jié)構(gòu)推斷，此荷移反應(yīng)的反應(yīng)式為:

2.5 樣品分析和回收率

2.5.1 樣品的制備

市場隨機購買雞肉樣品，絞碎混勻，準(zhǔn)確稱取混勻雞肉組織1.0 g于5 mL離心管中，加入4 mL乙腈和0.04 mL乙酸，高速勻漿提取30s，提取液以5 000 r/min離心5 min，上清液轉(zhuǎn)移至10 mL具塞比色管中，重復(fù)提取1次，合并提取液，加入2 mL正己烷渦旋震蕩脫脂，棄去正己烷層，吸取下層清液，反復(fù)用正已烷脫脂至溶液澄清，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾后待測定。

2.5.2 樣品含量的分析

用處理好的樣品，對雞肌肉組織中左氧氟沙星殘留進行測定，未測出氧氟沙星。為考察方法的可行性，做加標(biāo)回收試驗。稱取1.0 g混勻后的雞肉組織，添加左氧氟沙星標(biāo)準(zhǔn)溶液進行回收率實驗，分別添加相當(dāng)于5.0、10.0、2 0.0 mg/kg 3個水平，渦旋混勻，余下操作同雞肉樣品制備。每個添加水平平行做6份，計算其回收率和精密度，結(jié)果見表2。

表2 左氧氟沙星在雞肉中的回收率(n=6)Table 2 Recoveries of Lefx in chicken samples(n=6)

由表2可知，回收率在92.0% ～96.8%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)小于5.6%，均符合藥物殘留分析的要求。在保證儀器檢出限和回收率穩(wěn)定的前提下，雞肉組織中左氧氟沙星檢測方法的檢出限為1.0 mg/kg(按S/N=3計)。

3 結(jié)論

左氧氟沙星與茜素在水與乙醇的混合溶液中發(fā)生反應(yīng)，生成絡(luò)合物的最大吸收波長為532 nm;表觀摩爾吸光系數(shù)是6.47×103L/mol·cm;藥物濃度在1～50 mg/L內(nèi)符合比耳定律。應(yīng)用擬定的方法測定雞肉組織中左氧氟沙星的含量，回收率在92.0%～96.8%，雞肉組織中左氧氟沙星檢測方法的檢出限為1.0 mg/kg(按S/N=3計)。所用儀器簡單，操作快速、簡便，可用于雞肉中左氧氟沙星含量的準(zhǔn)確、快速測定。

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