螺旋藻抗氧化肽的制備及其體外活性研究

歐 贇， 喬燕燕， 王維有， 候 凡， 王 宇， 任迪峰*， 魯 軍

（1.北京林業(yè)大學(xué) 生物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院/北京市林業(yè)食品加工與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2.中國(guó)食品發(fā)酵工業(yè)研究院/北京市蛋白功能肽工程技術(shù)研究中心，北京 100027；3.清華大學(xué) 玉泉醫(yī)院，北京 100049）

眾所周知，活性氧（Reactive Oxygen Species）如羥基自由基、氫過氧自由基等，是人體代謝的產(chǎn)物之一。ROS的增多會(huì)破壞DNA、蛋白質(zhì)，酶等細(xì)胞分子，并導(dǎo)致癌癥、心血管疾病和糖尿病等嚴(yán)重的疾病[1]。同樣，油脂的氧化也會(huì)引起食品的腐敗變質(zhì)?？寡趸瘎┩ㄟ^抑制氧化酶的活性、消耗環(huán)境中的氧以及提供氫原子來阻斷活性氧和食品中油脂自動(dòng)氧化的連鎖反應(yīng)。

雖然許多人工合成抗氧化劑在相關(guān)疾病的防治中得到廣泛的使用，但是這些人工抑制劑如丁基羥基茴香醚（BHA）和特丁基對(duì)苯二酚（TBHQ）等，都無法避免地帶有潛在的毒副作用。食源性的蛋白質(zhì)水解物所含的多肽具有天然的抗氧化活性，易吸收，而且沒有人工合成抗氧化劑的副作用[2]。鑒于天然抗氧化肽的優(yōu)勢(shì)，近年來一些研究已經(jīng)驗(yàn)證了不同生物來源[3-5]的活性肽的抗氧化活性作用。

螺旋藻（Spirulina platensis）被譽(yù)為21世紀(jì)人類最理想的食品[6]，其富含蛋白質(zhì)、β-胡蘿卜素、γ-亞麻酸、維生素E等營(yíng)養(yǎng)成分[7]。同時(shí)，螺旋藻不僅包括8種人體必需氨基酸，還是目前已知植物中螺旋藻是蛋白質(zhì)含量最高的一種[6]，因此，螺旋藻是獲得天然活性肽的潛在寶貴資源。

作者通過對(duì)螺旋藻粉凍融，超聲等預(yù)處理，優(yōu)化木瓜蛋白酶解條件，并結(jié)合超濾、凝膠過濾層析等方法，從鈍頂螺旋藻的酶解液中分離、純化得到活性肽，并對(duì)其進(jìn)行體外生物活性研究，從而為螺旋藻抗氧化肽的開發(fā)和用于抗氧化功能食品和生物制藥方面奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

鈍頂螺旋藻：北京林業(yè)大學(xué)螺旋藻研究所提供；牛血清白蛋白、木瓜蛋白酶（純度99%）、L-半胱氨酸（分析純）、1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）標(biāo)準(zhǔn)品（純度99%）、總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒：南京建成生物工程研究所提供；抗壞血酸 （純度99%）、無水乙醇、乙二胺四乙酸、氯化鈉、無水硫酸銅、氫氧化鈉、三氯乙酸、2-氨基-2-（羥甲基）-1，3-丙二醇（Tris）、鹽酸、水楊酸、氨水均為分析純。

WFZ752型紫外分光光度計(jì)：上海光譜儀器有限公司產(chǎn)品；Heto PowerDry LL1500凍干機(jī)：賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司產(chǎn)品；FA1604N電子分析天平：上海精密儀器廠產(chǎn)品；Anke GL-20G-Ⅱ高速冷凍離心機(jī)：上海安亭科學(xué)儀器廠產(chǎn)品；DSY-2-8電熱恒溫水浴鍋：北京國(guó)華醫(yī)療器械廠產(chǎn)品；層析柱：上海之信儀器有限公司產(chǎn)品。

1.2 方法

1.2.1 螺旋藻藻藍(lán)蛋白的提取和質(zhì)量分?jǐn)?shù)測(cè)定螺旋藻粉20 g懸浮在160 mL蒸餾水中，在-18℃下緩慢冷凍，然后在25～30℃水浴解凍，反復(fù)5次，再用超聲波破碎3 min，使藻藍(lán)蛋白充分溶出。在6 000 g、4℃條件下離心30 min，離心后去除沉淀，收集蛋白上清液。

以牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)物，采用Bio-Rad Protein Assay Kit測(cè)定蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)[8]。上清液通過真空冷凍干燥，得到螺旋藻的蛋白粉，保存于4℃。

1.2.2 螺旋藻藻藍(lán)蛋白酶解條件優(yōu)化 為了得到較高的多肽濃度，確定木瓜蛋白酶水解螺旋藻藻藍(lán)蛋白的最佳條件，根據(jù)預(yù)備實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)計(jì)正交試驗(yàn)方案，實(shí)驗(yàn)因素水平見表1。

1.2.3 三氯乙酸（TCA）法測(cè)定多肽質(zhì)量分?jǐn)?shù) 參考魯偉等人[9]的方法進(jìn)行測(cè)定。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表Table 1 Factors and levels of the orthogonal experiment

1.2.4 超濾 在30 mL底物質(zhì)量濃度為2 g/dL的螺旋藻蛋白液中加入終濃度為2.0 mmol/L的乙二胺四乙酸、5.0 mmol/L L-半胱氨酸、300 mmol/L氯化鈉，并在1.2.2得到的最佳酶解條件進(jìn)行酶解。

將酶解液在6 000 g、4℃條件下經(jīng)截留相對(duì)分子質(zhì)量（MWCO）為30 000的超濾膜過濾去除酶等大分子物質(zhì)，然后濾液經(jīng)過不同截留相對(duì)分子質(zhì)量（MWCO 10 000、3 000）的超濾膜在 4 ℃、6 000 g下超濾，獲得具有不同相對(duì)分子質(zhì)量的濾液，并按1.2.5中所介紹方法測(cè)定各部分濾液的體外抗氧化活性，濾液真空冷凍干燥后在4℃下保存。

1.2.5 抗氧化活性研究

1）清除DPPH自由基能力 參考Kim S Y等人[10]的方法進(jìn)行測(cè)定。

2）清除羥基自由基能力 參考李超等人[11]的方法進(jìn)行測(cè)定。

3）總抗氧化能力 參照總抗氧化能力檢測(cè)試劑盒 （南京建成生物工程研究所）的操作說明，于520 nm處測(cè)定反應(yīng)液的吸光度值，根據(jù)公式計(jì)算得到待測(cè)樣品的總抗氧化能力。

1.2.6 螺旋藻活性肽的純化 具有最高抗氧化活性的凍干粉溶解在10 mL 10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）中，經(jīng)脫氣及 0.22 μm Supor膜過濾處理，然后通15/600 mm凝膠過濾柱分離。流動(dòng)相為10 mmol/L Tris-HCl（pH 7.0，包含 150 mmol/L NaCl），流量為0.8 mL/min。洗脫峰在215 nm波長(zhǎng)處進(jìn)行檢測(cè)并收集，然后按1.2.5中所介紹方法檢測(cè)抗氧化活性。

2 結(jié)果與分析

2.1 螺旋藻蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測(cè)定結(jié)果

經(jīng)Bio-Rad Protein Assay方法測(cè)定螺旋藻蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。在稀釋不同倍數(shù)的樣品中，其中稀釋50倍的螺旋藻蛋白液在595 nm處的吸收值為0.369，基本落在標(biāo)準(zhǔn)曲線的有效線性范圍。因此，根據(jù)該樣品計(jì)算得到螺旋藻的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)約為56%。

圖1 Bio-Rad Protein Assay標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of Bio-Rad Protein Assay

2.2 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

木瓜蛋白酶水解的正交試驗(yàn)結(jié)果及方差分析見表2及表3。

表2 正交試驗(yàn)分析Table 2 Analysis of the orthogonal experiment

表3 正交試驗(yàn)方差分析Table 3 Variance analysis for the orthogonal experiment

由正交試驗(yàn)方差分析可知，在α=0.01水平上，A因素（溫度）的不同處理水平對(duì)指標(biāo)影響顯著；B因素（酶底比）、C因素（時(shí)間）和D因素（pH）的不同處理水平對(duì)指標(biāo)影響不顯著。確定各因素的主次關(guān)系為A>B>C>D，最優(yōu)組合為A2B2C3D2，即溫度為60℃，酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%，時(shí)間為9 h，pH為7.0。

2.3 不同相對(duì)分子質(zhì)量范圍螺旋藻酶解液的抗氧化活性

螺旋藻的木瓜蛋白酶水解液經(jīng)超濾得到不同分子量范圍的酶解液。如表4所示，相對(duì)分子質(zhì)量范圍為0到3 000的酶解液具有最強(qiáng)的抗氧化活性，表明該片段活性肽捕獲自由基更容易[12-13]，因此選擇該部分酶解液進(jìn)行抗氧化肽的純化。各酶解液的抗氧化肽得率按酶解前后215 nm處吸光度值的比值確定，從表2可知，相對(duì)分子質(zhì)量范圍為0到3 000的酶解液的得率為（13.23±1.24）%。

表4 螺旋藻木瓜蛋白水解液的抗氧化活性Table 4 Antioxidative activities of the papain hydrolysates of Spirulina platensis

2.4 抗氧化肽的純化

相對(duì)分子質(zhì)量范圍為0到3 000的螺旋藻酶解液經(jīng)凝膠過濾柱分離，從圖2可以看出，在215 nm處有4個(gè)主要吸收峰（I～I(xiàn)V）。經(jīng)1.2.5中所介紹方法檢測(cè)抗氧化活性，測(cè)得吸收峰III具有最強(qiáng)的抗氧化活性。

圖2 木瓜蛋白水解液的凝膠色譜圖（Sephadex G-15層析柱（1.6 cm × 60 cm））Fig.2 Gelfiltration chromatogram ofthe papain hydrolysates on a Sephadex G-15 column（1.6 cm×60 cm）

圖3 DPPH·清除標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.3 Clearance curve of DPPH·

圖4 OH·清除標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.4 Clearance curve of OH·

圖5 總抗氧化能力標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.5 Total antioxidative capability curve

根據(jù)抗壞血酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算出清除50%DPPH自由基所需的抗壞血酸溶液用量即為半數(shù)有效量 IC50，得到 IC50（抗壞血酸）=18.36 μg/mL，而經(jīng)過凝膠層析得到螺旋藻活性肽（III峰）原液（質(zhì)量濃度C=0.104 2 mg/mL）的DPPH自由基清除率為（28.49±1.05）%，相當(dāng)于（10.01±0.68） μg/mL 的抗壞血酸溶液。

同理可知，質(zhì)量濃度為0.104 2 mg/mL螺旋藻活性肽（III峰）的清除羥基自由基清除率與（0.477±0.028）mg/mL的抗壞血酸相同，螺旋藻活性肽（III峰）原液的總抗氧化能力相當(dāng)于該試劑盒條件下濃度為（0.037 9±0.008 1）mg/mL的抗壞血酸溶液。

因此，螺旋藻活性肽比相同質(zhì)量的濃度的米蛋白短肽[14]的抗氧化能力強(qiáng)，說明是一種具有較強(qiáng)抗氧化活性的天然活性肽。該天然活性肽具有營(yíng)養(yǎng)豐富、易吸收、無毒副作用等特點(diǎn)，因而該活性肽具有很好的應(yīng)用前景。

3 結(jié) 語

木瓜蛋白酶水解的最適工藝條件為：酶質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.6%、溫度60℃、水解時(shí)間9 h、pH 7.0。在最佳木瓜蛋白酶優(yōu)化工藝下，水解鈍頂螺旋藻，通過超濾得到不同相對(duì)分子質(zhì)量范圍的抗氧化肽混合液，其中相對(duì)分子質(zhì)量范圍為0到3 000的酶解液活性最高。

經(jīng)過層析得到螺旋藻活性肽（III峰）原液（C=0.104 2 mg/mL）具有較強(qiáng)的抗氧化活性，其DPPH·清除率、OH·清除率和總抗氧化能力分別相當(dāng)于質(zhì)量濃度為（1.01±0.07）×10-2mg/mL、（4.77±0.28）×10-1mg/mL 和（3.79±0.81）×10-2mg/mL 的抗壞血酸溶液。小分子肽不但具有易吸收的特點(diǎn)，而且經(jīng)腸胃消化有良好的穩(wěn)定性[15]，因此，該活性肽在保健食品和藥品中具有很好的應(yīng)用前景。

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