基于KGdF4:Tb3+納米材料檢測(cè)四環(huán)素的生物傳感新方法

段 諾， 吳世嘉， 王周平

（1.江南大學(xué) 食品學(xué)院，江蘇 無(wú)錫 214036；2.食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)，江蘇 無(wú)錫 214122）

四環(huán)素（Tetracycline，Tc）是四環(huán)素類抗生素的一種，是由放線菌屬產(chǎn)生的一類廣譜抗生素，對(duì)革蘭氏陰性菌和陽(yáng)性菌、立克次氏體等均有抑菌作用[1]。近年來(lái)，四環(huán)素被廣泛應(yīng)用于飼料添加劑，一方面能夠有效地預(yù)防和治療魚(yú)類、畜禽類的疾病，另一方面可促進(jìn)其生長(zhǎng)速度，控制生殖周期和繁育能力。然而一些不法分子為了經(jīng)濟(jì)效益，常濫用這類藥物，致使其在動(dòng)物性食品中大量殘留，不僅危害人體健康，而且更為嚴(yán)重的是畜禽產(chǎn)品中殘留較低濃度的四環(huán)素類抗生素容易誘導(dǎo)各種致病菌產(chǎn)生耐藥性，不利于對(duì)人類和畜禽類疾病的治療[2-4]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)于四環(huán)素殘留常用的檢測(cè)方法有微生物法[5]、薄層層析法[6]、液相色譜法[7-9]、酶聯(lián)免疫法[10-11]等。上述方法均具有靈敏度高、重復(fù)性好等特點(diǎn)。然而上述方法也存在耗時(shí)、設(shè)備昂貴、樣品前處理步驟繁瑣等缺點(diǎn)。因此構(gòu)建快速、準(zhǔn)確、靈敏的食品安全檢測(cè)新方法新技術(shù)，對(duì)于實(shí)現(xiàn)四環(huán)素的超痕量檢測(cè)具有重要意義。

鑭系元素?fù)诫s的新型納米材料KGdF4：Ln3+納米粒子是一類具有顯著熒光發(fā)射的粒子，相比于傳統(tǒng)的熒光染料和量子點(diǎn)，KGdF4：Ln3+納米粒子具有以下顯著的優(yōu)點(diǎn)：較長(zhǎng)的熒光壽命，可以很好的消除散射光對(duì)于熒光檢測(cè)的干擾、較大的斯托克斯位移（＞50 nm）、較窄的熒光發(fā)射峰形（＜10 nm）、低毒性以及很高的抗光漂白性[12-13]。目前KGdF4：Ln3+納米粒子在生物大分子檢測(cè)分析、醫(yī)療診斷分析等方面具有比較廣泛的應(yīng)用。

氧化石墨烯也是一類具有非常良好的電子、機(jī)械和熱性能的納米材料，近年來(lái)備受關(guān)注[14]。研究表明，單鏈DNA可以通過(guò)π-π共軛大量的吸附在氧化石墨烯的表面[15]。而由于磷酸骨架中的核苷酸堿基的遮蔽作用，導(dǎo)致氧化石墨烯對(duì)于DNA雙鏈以及折疊的DNA復(fù)合物的吸附能力相對(duì)較弱[16]。與此同時(shí)，氧化石墨烯具有較寬的紫外吸收，是一種高效的熒光淬滅劑，這些特性使得氧化石墨烯成為一種優(yōu)良的檢測(cè)平臺(tái)[17-18]。

作者利用KGdF4：Ln3+納米粒子作為熒光分子，氧化石墨烯作為熒光淬滅分子，結(jié)合適配體與目標(biāo)物質(zhì)的高親和力和高特異性識(shí)別，構(gòu)建了一種靈敏、高效的熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系檢測(cè)四環(huán)素的方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品：購(gòu)自上海晶純科技股份有限公司；氟化銨、氯化鉀、氯化鈉、乙二醇、戊二醛等：購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；聚丙烯亞胺：購(gòu)自梯希愛(ài)（上海）化成工業(yè)發(fā)展有限公司；GdCl3·6H2O、TbCl3·6H2O、親和素：購(gòu)自 Sigma 公司；牛奶樣品：購(gòu)自無(wú)錫華潤(rùn)萬(wàn)家超市。四環(huán)素適配子[19]5'-biotin-CGT ACG GAA TTC GCT AGC CCC CCG GCA GGC CAC GGC TTG GGT TGG TCC CAC TGC GCG TGG ATC CGA GCT CCA CGT G-3'：由生工生物工程（上海）有限公司合成。

1.2 儀器與設(shè)備

紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)UV-1800：日本島津公司；冷凍離心機(jī)：德國(guó)eppendorf公司；ZD-85氣浴恒溫振蕩器：上海比朗儀器有限公司；JEM2100透射電鏡：日本JEOL公司；熒光光譜儀FLUORMAX-4：美國(guó)HORIBA公司；X射線衍射儀D8：德國(guó)布魯克AXS有限公司；傅立葉變換紅外光譜儀Nicolet iS10：美國(guó)賽默飛公司；Direct-Q3超純水系統(tǒng)：美國(guó)Millipore公司。

1.3 氧化石墨烯的制備

在Hummers方法的基礎(chǔ)上做改進(jìn)[20]，利用石墨粉末得到氧化石墨烯。稱取2 g石墨薄片和1.6 g NaNO3，在冰浴狀態(tài)下加入67.5 mL濃硫酸中。隨后緩慢加入 9 g KMnO4反應(yīng)溶液中，35℃攪拌 30 min。隨后560 mL溫水緩慢加入溶液中形成糊狀，再加入 30%H2O2，室溫條件下連續(xù)攪拌5 d，溶液逐漸變?yōu)榱咙S色。最后將懸液離心，用去離子水清洗多次，在真空干燥箱中70℃干燥得到氧化石墨烯片層。

1.4 鑭系元素?fù)诫s的KGdF4：Tb3+納米材料的制備

將 2.0 mmol KCl、1.0 mmol GdCl3·6H2O、0.01 mmol TbCl3·6H2O、1 mL（300 mg/mL）聚丙烯亞胺以及20 mL乙二醇加入至100 mL圓底燒瓶中，充分?jǐn)嚢柚了泄腆w溶解。另取8 mmol NH4F加入至燒杯中，并加入20 mL乙二醇，放入40℃水浴鍋中恒溫?cái)嚢柚凉腆w全部溶解。后將溶解的NH4F逐滴加入至圓底燒瓶中，充分?jǐn)嚢? h，形成懸浮液。將懸浮液轉(zhuǎn)入至高溫反應(yīng)釜中，放入電熱鼓風(fēng)干燥箱195℃恒溫加熱4 h。反應(yīng)結(jié)束后將產(chǎn)物分裝入離心管中，10 000 r/min離心15 min。棄上清液，沉淀用乙醇以及超純水超聲清洗三次。最后成品烘干，研成粉末保存，即制得鑭系元素?fù)诫s的KGdF4：Tb3+納米粒子。

1.5 KGdF4：Tb3+納米粒子-四環(huán)素適配體復(fù)合物的制備

將 15 mg KGdF4：Tb3+納米粒子于 5 mL PBS 中超聲分散 20 min，之后加入 1.25 mL（1.06 g/mL）戊二醛，37℃恒溫振蕩2 h。然后用PBS超聲清洗三次 （9 000 r/min、10 min）。 所得沉淀于0.9 mL PBS中重懸，加入0.1 mL（1 mg/mL）親和素，37℃恒溫振蕩6 h。反應(yīng)結(jié)束后用結(jié)合緩沖液 （20 mmol/L Tris-HCl、100 mmol/L NaCl、5 mmol/L KCl、2 mmol/L MgCl2、1 mmol/L CaCl2、pH 7.0）清洗 3 次，加入 20 μL（10 μmol/L）生物素化的四環(huán)素適配體，37℃恒溫振蕩2 h。之后用結(jié)合緩沖液清洗3次（9 000 r/min、10 min），再用結(jié)合緩沖液配制成1 mg/mL的體系，構(gòu)成KGdF4：Tb3+納米粒子-四環(huán)素適配體復(fù)合物。放入4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 四環(huán)素檢測(cè)

配制不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)樣品（0.5、1、5、10、20、50、100 ng/mL）， 分別與上述制備的 KGdF4：Tb3+納米粒子-四環(huán)素適配體復(fù)合物于37℃孵育1 h，然后加入氧化石墨烯（100 μL，1 mg/mL），37 ℃繼續(xù)孵育1.5 h。最后使用熒光光譜儀FLUORMAX-4測(cè)定樣品熒光光譜，設(shè)定激發(fā)波長(zhǎng)273 nm，考察發(fā)射峰543 nm處熒光強(qiáng)度。

1.7 牛奶樣品中四環(huán)素加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

利用建立的方法對(duì)牛奶中的四環(huán)素進(jìn)行檢測(cè)，對(duì)牛奶樣品的處理方法為：取10 mL牛奶，在10℃下7 000 r/min離心10 min，完全去除上層脂肪層。將得到的樣本用去離子水1∶20稀釋，再經(jīng)過(guò)一次性注射式濾器過(guò)濾，最終得到待測(cè)溶液。配制不同濃度的四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入待測(cè)溶液中，利用本設(shè)計(jì)方法檢測(cè)其中四環(huán)素的含量，計(jì)算檢測(cè)值，得到回收率。

2 結(jié)果與分析

2.1 四環(huán)素的檢測(cè)原理

KGdF4：Tb3+納米粒子的表面富含氨基，并通過(guò)戊二醛法與親和素進(jìn)行連接，之后再與生物素化的四環(huán)素適配體進(jìn)行結(jié)合，構(gòu)成熒光供體探針。同時(shí)我們制備得到了氧化石墨烯單片層，通過(guò)紫外掃描發(fā)現(xiàn)其在300～700 nm之間存在廣泛的紫外吸收區(qū)，并且與制備得到的KGdF4：Tb3+材料的熒光發(fā)射譜重疊，也就意味著氧化石墨烯可以作為能量受體淬滅KGdF4：Tb3+納米粒子的熒光。據(jù)此設(shè)計(jì)了一個(gè)熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系檢測(cè)四環(huán)素的方法，技術(shù)原理見(jiàn)圖1。將KGdF4：Tb3+-四環(huán)素適配體熒光供體探針與氧化石墨烯共同孵育，由于π-π堆積作用，適配體（單鏈DNA）就會(huì)被固定到氧化石墨烯片層表面，致使KGdF4：Tb3+熒光被氧化石墨烯淬滅。當(dāng)加入目標(biāo)物質(zhì)四環(huán)素時(shí)，四環(huán)素與熒光供體探針上的適配體發(fā)生特異性結(jié)合從而降低了適配體表面電荷，使得這部分適配體不具備與氧化石墨烯π-π共軛結(jié)合的能力，從而不會(huì)吸附在氧化石墨烯片層表面，KGdF4：Tb3+熒光得以保留，據(jù)此可實(shí)現(xiàn)四環(huán)素的定量檢測(cè)。

圖1 基于熒光共振能量轉(zhuǎn)移的四環(huán)素檢測(cè)原理圖Fig.1 Schematic representation of the detection of tetracycline using FRET

2.2 材料表征

所制備的KGdF4：Tb3+納米粒子的熒光光譜見(jiàn)圖2a所示，在激發(fā)波長(zhǎng)273 nm下，KGdF4：Tb3+納米粒子在540 nm左右處有顯著的發(fā)射峰。利用TEM對(duì)KGdF4：Tb3+納米粒子的形貌進(jìn)行表征，由圖2b可見(jiàn)，KGdF4：Tb3+納米粒子在水中分散性良好，顆粒都趨于球形，粒徑在25～30 nm左右，且分布較為均勻。對(duì)KGdF4：Tb3+納米粒子進(jìn)行X射線衍射表征，結(jié)果見(jiàn)圖2c所示。該納米粒子粉末的X射線衍射圖譜可以完全索引到KGdF4的純立方相，可以表明該粉末具有高度結(jié)晶的KGdF4晶體存在，沒(méi)有其他晶體雜質(zhì)的干擾。對(duì)KGdF4：Tb3+納米粒子進(jìn)行紅外光譜表征。聚乙烯亞胺在KGdF4：Tb3+納米粒子的合成過(guò)程中包覆于材料表面，為該材料提供了豐富的氨基與亞氨基，使其形貌良好，生物相容性佳。如圖2d所示，在1 396 cm-1處的紅外峰為C-N鍵的伸縮振動(dòng)，2 950、2 856 cm-1處的紅外峰分別為C-H鍵的非對(duì)稱與對(duì)稱伸縮振動(dòng)。在1 625 cm-1處的顯著紅外峰為氨基中N-H鍵的特征峰，由此可以表征聚乙烯亞胺的成功包被，使得KGdF4：Tb3+納米粒子的表面具有豐富的活性基團(tuán)，可為后續(xù)的親和素連接提供基礎(chǔ)，并可大幅的改良其在水中的分散性與生物相容性。

圖2 KGdF4：Tb3+納米粒子熒光光譜圖 （a）， 透射電鏡圖（b），X 射線衍射圖譜（c）和紅外光譜光譜圖（d）Fig.2 Fluorescence spectra （a），TEM image （b），XRD image （c），F(xiàn)T-IR spectra ofKGdF4：Tb3+nanoparticles（d）

2.3 氧化石墨烯的表征

從圖3a可以清楚的看到氧化石墨烯片層的薄片，以及特有的褶皺和卷邊的現(xiàn)象，可以確認(rèn)氧化石墨烯單片層制備成功。另外，測(cè)定了氧化石墨烯的紫外吸收光譜，由圖3b中看到，氧化石墨烯具有非常寬泛的紫外吸收大約包含了從300～700 nm的范圍，而恰好此范圍與KGdF4：Tb3+納米粒子的熒光發(fā)射光譜重疊，這意味著KGdF4：Tb3+納米粒子發(fā)射的熒光將被氧化石墨烯吸收從而發(fā)生熒光淬滅。

圖3 氧化石墨烯透射電鏡圖（a）和紫外吸收光譜圖（b）Fig.3 TEM image （a） and UV-visible absorption spectrum（b） of graphene oxide

2.4 KGdF4：Tb3+納米粒子與親和素連接的表征

本實(shí)驗(yàn)中KGdF4：Tb3+納米粒子-四環(huán)素適配體復(fù)合物由KGdF4：Tb3+納米粒子與四環(huán)素適配體構(gòu)成，二者的連接通過(guò)親和素與生物素的特異性結(jié)合來(lái)完成。其中四環(huán)素適配體5'端修飾了生物素，KGdF4：Tb3+納米粒子與親和素則按照1.5所述方法進(jìn)行連接。利用紫外-可見(jiàn)吸收光譜對(duì)其是否成功連接進(jìn)行了表征。由圖4中曲線A可以看出，親和素在未與KGdF4：Tb3+納米粒子連接之前在280 nm處有明顯的紫外吸收峰；當(dāng)親和素與KGdF4：Tb3+納米粒子進(jìn)行孵育之后，離心收集所得上清液的紫外吸收?qǐng)D譜見(jiàn)曲線B。此時(shí)在親和素280 nm處的紫外特征吸收峰峰值大幅降低。從而表明親和素已成功固定到KGdF4：Tb3+納米粒子的表面。

圖4 親和素原液（曲線A）與孵育后上清液（曲線B）的紫外-可見(jiàn)吸收?qǐng)D譜Fig.4 UV-visible absorption spectrum of avidin（curve A）and the supernatant after incubation（curve B）

2.5 熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系

如圖5所示，連接了四環(huán)素適配體的KGdF4：Tb3+納米粒子作為能量供體探針，當(dāng)能量供體探針與氧化石墨烯連接后，KGdF4：Tb3+納米粒子熒光被氧化石墨烯淬滅 （曲線A），而將無(wú)適配體修飾的KGdF4：Tb3+納米粒子與氧化石墨烯混合掃描熒光圖譜 （曲線B），KGdF4：Tb3+納米粒子熒光強(qiáng)度略有下降。由此可以推斷，KGdF4：Tb3+納米粒子熒光的淬滅是因?yàn)檫m配體修飾后KGdF4：Tb3+納米粒子通過(guò)ππ效應(yīng)能夠吸附到石墨烯表面，從而拉近了能量供體與能量受體間的空間距離，導(dǎo)致了熒光共振能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的發(fā)生。由此表明，具有適配體功能化的熒光生物探針是本實(shí)驗(yàn)建立的關(guān)鍵要素。

圖5 KGdF4：Tb3+納米粒子-適配體復(fù)合物與氧化石墨烯孵育后的熒光光譜（a）和KGdF4：Tb3+納米粒子與氧化石墨烯孵育后的熒光光譜（b）Fig.5 Fluorescence spectra of KGdF4：Tb3+-aptamer after the incubation with graphene oxide （a），fluorescence spectra of the KGdF4：Tb3+after the incubation with graphene oxide（b）

2.6 線性范圍與檢測(cè)限

根據(jù)實(shí)驗(yàn)原理檢測(cè)體系中不存在被測(cè)物四環(huán)素時(shí)熒光強(qiáng)度為最低值，隨四環(huán)素質(zhì)量濃度增加體系熒光強(qiáng)度隨之增強(qiáng)，在最佳實(shí)驗(yàn)條件下，KGdF4：Tb3+納米粒子在543 nm處的熒光發(fā)射峰與四環(huán)素質(zhì)量濃度在0.5～100 ng/mL范圍內(nèi)呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系 （圖6a）。回歸方程為y=430.0x+75 095（R2=0.993），最低檢出限（3S/N）為 0.25 ng/mL，其中 y 為熒光強(qiáng)度，x為四環(huán)素質(zhì)量濃度。10次重復(fù)檢測(cè)10ng/mL的四環(huán)素溶液以評(píng)價(jià)該方法的精密度，其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為2.5%，因此本實(shí)驗(yàn)具較好的靈敏度與準(zhǔn)確性。圖6b為加入不同質(zhì)量濃度四環(huán)素的熒光圖譜。

2.7 特異性研究

為了評(píng)價(jià)本實(shí)驗(yàn)方法對(duì)于四環(huán)素的特異性，實(shí)驗(yàn)考察了與四環(huán)素類似的抗生素：金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素與氯霉素在此方法下的檢測(cè)效果。在所構(gòu)建的檢測(cè)系統(tǒng)中，分別加入10 ng/mL的四環(huán)素、金霉素、土霉素、強(qiáng)力霉素與氯霉素，測(cè)定該檢測(cè)體系熒光值，結(jié)果見(jiàn)圖7。四環(huán)素在該檢測(cè)體系中引起的熒光強(qiáng)度的變化遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于其余四種物質(zhì)。這是因?yàn)樗沫h(huán)素適配體與四環(huán)素發(fā)生特異性結(jié)合，導(dǎo)致熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系破壞，熒光強(qiáng)度大幅的恢復(fù)；而四環(huán)素適配體對(duì)于其余四種物質(zhì)不具備高親合力，此時(shí)四環(huán)素適配體修飾的熒光納米粒子仍大量的被氧化石墨烯所吸附，體系中的熒光被大幅的淬滅。綜上所述，基于四環(huán)素適配體與四環(huán)素的高度特異性使得該檢測(cè)方法具有良好的選擇性。

圖6 四環(huán)素質(zhì)量濃度與體系熒光強(qiáng)度的標(biāo)準(zhǔn)曲線（a）和不同四環(huán)素質(zhì)量濃度條件下體系的熒光圖譜（b）Fig.6 Standard curve of the fluorescence intensity versus the tetracycline concentration（a），typical recording output for the detection of different concentrations of tetracycline using the developed method（b）

圖7 四環(huán)素檢測(cè)方法的特異性分析Fig.7 Specificity analysis of tetracycline detetion

2.8 加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)

表1所示為本文方法測(cè)得的四環(huán)素質(zhì)量濃度與應(yīng)用傳統(tǒng)高效液相色譜法所得的四環(huán)素質(zhì)量濃度，二者結(jié)果基本一致，高效液相色譜法所得回收率在95.3%～102%之間，該實(shí)驗(yàn)方法所得回收率在96.1%～102.5%之間，說(shuō)明本法可用于實(shí)際樣品的檢測(cè)。

3 結(jié)語(yǔ)

根據(jù)氧化石墨烯的紫外吸收光譜與KGdF4：Tb3+納米粒子的熒光光譜相重疊這一現(xiàn)象，結(jié)合單鏈適配體與氧化石墨烯的π-π共軛作用及其與目標(biāo)物質(zhì)的高親和力和高特異性，構(gòu)建了一種利用熒光共振能量轉(zhuǎn)移體系檢測(cè)四環(huán)素的方法。本研究制備的KGdF4：Tb3+納米粒子是一種低度的，具有良好生物相容性的綠色納米材料，適配體為體外合成，成本低，穩(wěn)定性好，特異性強(qiáng)。因而該方法操作簡(jiǎn)單、靈敏度高，可以作為檢測(cè)四環(huán)素的備選方法。

表1 牛奶樣品中四環(huán)素的檢測(cè)回收率（n=5）Table 1 Recovery of tetracycline detection in milk samples（n=5）

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