D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因在枯草芽孢桿菌中的表達

賈 敏， 沐萬孟， 張 濤， 江 波*

（1.食品科學與技術(shù)國家重點實驗室，江南大學，江蘇 無錫 214122；2.江南大學 食品學院，江蘇 無錫 214122）

D-阿洛酮糖是稀有糖的一種，是D-果糖C-3位的差向異構(gòu)體。D-阿洛酮糖不僅是一種無熱量的甜味劑[1]，而且可作為其他稀有糖生產(chǎn)的重要原料[2]。D-阿洛酮糖具有多種獨特的營養(yǎng)學和生理學功能，受到越來越多研究者的注意。D-阿洛酮糖零能量，可預防肥胖[3]；能降低血糖[4]，可作為II型糖尿病人的輔助治療劑、膳食補充劑和甜味劑；可降低血脂，減少脂肪合成酶活性，抑制腹腔內(nèi)脂肪堆積[5]；有抗氧化活性，具有較強的活性氧（ROS）清除功能[6]；具有神經(jīng)保護作用[7]。鑒于D-阿洛酮糖良好的理化性質(zhì)，美國食品及藥品管理局于2011年對D-阿洛酮糖的安全性進行確認，并正式批準其為GRAS（一般認為安全，Generally Recognized as Safe）食品，允許應(yīng)用于食品，膳食補充劑和醫(yī)藥制劑中，具有巨大的市場前景[8]。

D-阿洛酮糖在自然界中存在極少，利用化學方法合成D-阿洛酮糖雜質(zhì)多且不易分離。利用D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶 （D-psicose 3-epimerase，DPE，EC 5.3.1.-），通過催化D-果糖C3位的差向異構(gòu)化獲得D-阿洛酮糖。作者所在實驗室已成功構(gòu)建大腸桿菌工程菌株BL21（DE3）/pET22b-cbdte表達DPE酶[9]。但由于大腸桿菌宿主安全性的問題，使其所表達的DPE重組蛋白不適宜應(yīng)用于D-阿洛酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)中。而枯草芽孢桿菌是食品級微生物，屬于GRAS級微生物，不存在內(nèi)毒素等食品安全問題，被廣泛應(yīng)用于各種工業(yè)酶制劑中[10-11]。

本研究旨在利用食品級微生物枯草芽孢桿菌作為宿主菌，構(gòu)建DPE酶枯草芽孢桿基因工程菌，實現(xiàn)DPE酶在枯草芽孢桿菌中的表達，為D-阿洛酮糖的工業(yè)化生物酶法生產(chǎn)奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗儀器與試劑

Authorized Thermal Cycler PCR儀：購自德國Eppendorf；垂直板蛋白電泳系統(tǒng)：購自PowerPac Universal；凝膠成像系統(tǒng)Gel DocXR：購自美國Bio-Rad公司；高效液相色譜儀Agilent 1260：購自美國Agilent公司；紫外可見分光光度計UV2102PC：購自上海尤尼柯儀器有限公司；全自動高壓滅菌鍋CL-40M：購自日本ALP公司；超凈工作臺SW-CJIFD：購自蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；高速冷凍離心機Centrifuge 5804R：購自德國Eppendorf公司。

Premix TaqDNA聚合酶、限制性內(nèi)切酶、T4 DNA連接酶：購自TaKaRa公司；質(zhì)粒DNA提取試劑盒及DNA膠回收試劑盒：購自上海生工生物工程有限公司；D-阿洛酮糖標準品：購自Sigma公司；其他常規(guī)試劑：進口分裝或國產(chǎn)分析純；引物合成及DNA測序：由上海生工生物工程有限公司完成。質(zhì) 粒 pET22b-cbdpe， 質(zhì) 粒 pMA5， 宿 主 菌Escherichia coli DH5α和宿主菌 Bacillus subtilis WB800：由作者所在實驗室保藏。

1.2 培養(yǎng)基制備

種子（LB）培養(yǎng)基（組分 g/L）：胰蛋白胨 10.0，酵母提取物 5.0，NaCl 10.0；pH 7.0。

發(fā)酵培養(yǎng)基（組分g/L）：酵母抽提物 15.0，葡萄糖 5.0，NaCl 8.0，MgSO4·7H2O 1.0，Na2HPO4·12H2O 1.0；自然pH。滅菌后加入抗生素。

1.3 DPE基因的克隆

以大腸桿菌質(zhì)粒pET22b-cbdpe為模板，通過PCR的方法進行DPE基因擴增。為便于分離純化，設(shè)計引物時將pET22b質(zhì)粒上帶有的His-tag標簽引入目的基因中，并在該基因的兩端分別引入兩個酶切位點，Nde I和BamH I，設(shè)計一對引物如下：

PMA1：5'-CGCCATATGAAATATGGTATTTATT TTGCT-3'

PMA2：5'-CGCGGATCCTTGTTAGCCGGATCTC-3'

PCR反應(yīng)程序如下：94℃預變性10 min，94℃變性 1 min，56℃退火 1 min，72℃延伸 1 min，35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0 g/dL瓊脂糖凝膠回收預期大小的片段。與pMD-T-19載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布在含有氨芐青霉素（100 μg/mL）的LB平板上，挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒進行測序，得到pMD19-T-cbdpe。

1.4 枯草芽孢桿菌重組表達質(zhì)粒的構(gòu)建

將獲得的pMD19-T-cbdpe和pMA5質(zhì)粒，用Nde I和BamH I進行雙酶切，回收基因片段，經(jīng)T4連接酶連接過夜后轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，涂布含有氨芐霉素（100 μg/mL）的LB平板，37℃過夜培養(yǎng)。挑取陽性克隆，提取質(zhì)粒，進行測序驗證。并利用Nde I和BamH I進行雙酶切驗證。

1.5 枯草芽孢桿菌重組菌的構(gòu)建及篩選

制作Bacillus subtilis WB800感受態(tài)細胞[12]轉(zhuǎn)化重組質(zhì)粒pMA5-cbdpe，將轉(zhuǎn)化子涂布卡那霉素（50 μg/mL）的LB平板，37℃培養(yǎng) 24 h，挑取單菌落至液體培養(yǎng)基，進行發(fā)酵培養(yǎng)，測定菌體酶活，并進行SDS-PAGE分析。

1.6 DPE酶活力測定

將獲得的枯草芽孢桿菌重組菌接入發(fā)酵培養(yǎng)基進行搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)，測定生長曲線和酶活曲線。酶活力測定方法參照文獻[13]。酶活力單位定義為：1 mL發(fā)酵液在55℃和pH 7.0條件下，單位時間（1 min）內(nèi)產(chǎn)生1 μmol的D-阿洛酮糖為一個酶活力單位，以U/mL表示。D-阿洛酮糖采用HPLC檢測，液相柱：Sugar-Pak I鈣型離子交換柱；柱溫：85℃；流動相：0.1mmol/L EDTA-Ca水溶液 （0.22 μm 膜過濾）；洗脫流速：0.4 mL/min；進樣量：10 μL；檢測器：Shodex示差折光檢測器。

1.7 DPE酶的分離純化

收集對數(shù)中后期的發(fā)酵液，10 000 r/min離心5 min，棄上清液，取菌體用50 mmol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）溶解，重懸菌體，進行超聲破碎。工作條件為：工作時間1 s，停止時間2 s，共計12 min。將破碎菌體進行低溫高速離心 （4℃、12 000 r/min離心15 min）。收集上清液即為粗酶液。用微孔濾膜（0.22 μm）過濾，備用。

先用上樣緩沖液（50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，pH 7.4） 平 衡Ni2+-Chelating Sepharose Fast Flow親和層析柱。將5 mL的粗酶液加到層析柱上，用低咪唑洗脫液（50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，50 mmol/L 咪唑，pH 7.4）洗脫雜蛋白質(zhì)，后利用高咪唑洗脫液 （50 mmol/L Na2HPO4，50 mmol/L NaH2PO4，500 mmol/L NaCl，500 mmol/L 咪 唑 ，pH 7.4）洗脫目的蛋白質(zhì)。收集目的蛋白質(zhì)放入透析袋中，利用平衡液透析過夜。

1.8 DPE酶蛋白濃度測定

采用Lowry法[14]測定蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白（BSA）為標準蛋白質(zhì)，做標準曲線。將樣品稀釋至一定濃度，根據(jù)標準曲線算出蛋白質(zhì)濃度。

2 結(jié)果與分析

2.1 DPE基因克隆

以大腸桿菌重組質(zhì)粒pET22b-cbdpe為模板，PCR擴增得到約900 bp的DPE基因，見圖1。獲得的pMD19-T-cbdpe經(jīng)測序驗證，Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DPE基因進行比對發(fā)現(xiàn)，目的基因得到正確擴增。

圖1 PCR產(chǎn)物凝膠電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis of PCR product

2.2 重組表達載體的構(gòu)建與鑒定

將pMD19-T-cbdpe和pMA5質(zhì)粒，用Nde I和BamH I進行雙酶切，用T4連接酶進行連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA5-cbdpe，其構(gòu)建過程見圖2。

圖2 pMA5-cbdpe重組質(zhì)粒構(gòu)建過程Fig.2 Restructuring process of pMA5-cbdpe plasmid

對重組質(zhì)粒進行Nde I和BamH I雙酶切驗證，瓊脂糖凝膠電泳在約900 bp及7 000 bp處出現(xiàn)條帶，與目的基因及pMA5的片段大小一致，初步確定獲得pMA5-cbdpe的陽性克隆，見圖3。

圖3 重組質(zhì)粒pMA5-cbdpe的雙酶切驗證Fig. 3 Restriction enzyme digestion analysis of recombinant plasmid pMA5-cbdpe

經(jīng)基因組測序，并與NCBI中Clostridium bolteae ATCC BAA-613 DPE基因序列進行比對，結(jié)果表明成功構(gòu)建了重組載體pMA5-cbdpe。將重組載體轉(zhuǎn)化入B.subtilis WB800，經(jīng)卡那霉素（50 μg/mL）LB平板篩選后，挑取陽性克隆子，發(fā)酵培養(yǎng)，進行菌液PCR鑒定，獲得一株包含DPE基因的枯草芽孢桿菌重組菌，見圖4。

圖4 重組枯草芽孢桿菌PCR鑒定Fig.4 PCR identification of recombinant B.subtilis

2.3 枯草芽孢桿菌重組菌的表達及活性鑒定

枯草芽孢桿菌重組菌經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)，取菌體進行SDS-PAGE電泳驗證顯示，在34 000左右出現(xiàn)明顯表達蛋白質(zhì)，見圖5。這與大腸桿菌表達DPE相對分子質(zhì)量一致，表明該枯草芽孢桿菌可實現(xiàn)DPE的表達，經(jīng)離心沉淀后即可獲得菌體。干燥后即可制得粗酶粉，用于D-阿洛酮糖的生產(chǎn)，避免理化操作可能對酶性質(zhì)產(chǎn)生的影響。

利用枯草芽孢桿菌模式菌株B.subtilis 168，進行DPE酶表達時，PCR鑒定重組菌中包含DPE基因后，發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)重組菌沒有酶活 （結(jié)果未顯示）；而利用敲除八種蛋白酶的宿主菌B.subtilis WB800作為宿主菌[15]，則可在菌體中檢測到酶活?？赡苁怯捎谒拗骶牡鞍酌缚山到馑磉_的DPE重組蛋白，導致利用B.subtilis 168表達DPE酶不能檢測到酶活。

圖5 SDS-PAGE圖Fig.5 SDS-PAGE profiles

為檢測重組菌產(chǎn)DPE酶的酶活情況，將不同發(fā)酵時間的發(fā)酵液與D-果糖溶液在合適條件下進行反應(yīng)，測定不同時間發(fā)酵液DPE酶活及菌體生長狀況，見圖6。在對數(shù)中后期，發(fā)酵16～24 h時，酶活達到最高，為6.8 U/mL，高于大腸桿菌IPTG誘導表達的酶活（約3.5 U/mL）[16]。表明該菌株可表達相對較高活性的DPE酶。

圖6 重組枯草芽孢桿菌發(fā)酵曲線Fig.6 Curve of enzyme activity of recombinant B.subtilis

對于DPE酶的工業(yè)化生產(chǎn)，大腸桿菌表達的DPE酶在工業(yè)化發(fā)酵中，需要額外添加誘導劑，并且需保持較低的誘導溫度以減少包涵體的大量產(chǎn)生；而枯草芽孢桿菌表達DPE酶發(fā)酵過程簡單，無需降溫，減少能耗，并且無包涵體產(chǎn)生，單位發(fā)酵液酶活較高。真核表達系統(tǒng)如畢赤酵母等，一般需要較長發(fā)酵時間才能達到較高酶活；而枯草芽孢桿菌16～24 h即可達到較高酶活水平，發(fā)酵時間短，節(jié)約能耗。

2.4 重組DPE酶的分離純化

Clostridium bolteae DPE酶菌體經(jīng)超聲破碎，離心后得到粗酶液，由于引入6個組氨酸標簽，通過Ni2+柱親和層析，將目的蛋白質(zhì)與雜蛋白質(zhì)分離，經(jīng)SDS-PAGE電泳檢測，見圖7。在34 000處得到目的蛋白，其相對分子質(zhì)量大小與預測符合，進一步證明DPE基因在枯草芽孢桿菌宿主中得到正確表達。

圖7 分離純化后的重組蛋白SDS-PAGE電泳圖Fig.7 SDS-PAGE profile of the purified recombinant protein

2.5 重組DPE酶的酶學性質(zhì)

2.5.1 pH對DPE酶活力的影響 在55℃、pH 5.0～9.0的緩沖溶液中分別測定DPE酶活力，重復3次，取平均酶活力，見圖8。該DPE酶的最適pH為7.0，與大腸桿菌表達的DPE酶一致[17]。其酶活力＞90%的pH范圍有所擴大，為6.0～7.5。

2.5.2 pH對DPE酶穩(wěn)定性的影響 將純化后的DPE酶在pH 5.0～9.0的緩沖液反應(yīng)體系中，4℃保存2 h，然后測定殘余酶活，以原始酶活為最高酶活100%，見圖9。在pH 5.0～8.5的范圍內(nèi)，DPE酶相對穩(wěn)定，殘余酶活均在80%以上。

2.5.3 溫度對DPE酶活力的影響 在pH 7.0條件下，測定40～80℃下的酶活力，結(jié)果見圖10。重組DPE酶在55℃下酶活力達到最高。在45～65℃其相對酶活仍可維持在80%以上。

圖8 pH值對酶活力的影響Fig.8 Effects of pH on DPE enzyme activity

圖9 pH值對酶穩(wěn)定性的影響Fig.9 Effects of pH on DPE stability

圖10 溫度對酶活力的影響Fig.10 Effects of temperature on DPE enzyme activity

2.5.4 溫度對DPE酶穩(wěn)定性的影響 將酶液在不同溫度下保溫不同的時間，測定DPE酶的殘余酶活，結(jié)果見圖11?？莶菅挎邨U菌表達的DPE酶的熱穩(wěn)定性比大腸桿菌表達的DPE酶的熱穩(wěn)定性略有提高。其55℃的半衰期由42 min增加到45 min[17]。

圖11 溫度對DPE酶穩(wěn)定性的影響Fig.11 Effects of temperature on DPE stability

2.5.5 金屬離子對DPE酶活力的影響 不同金屬離子對酶的催化效果有不同的影響，見圖12。在酶反應(yīng)體系中加入不同的金屬離子，DPE酶的穩(wěn)定性及催化活力會有所不同。DPE酶是一種金屬蛋白酶，在金屬螯合劑EDTA的存在下，DPE酶徹底失活。Co2+和Mn2+離子可提高DPE酶的活性，尤其是Co2+離子。 Zn2+、Mg2+、Cu2+、Ca2+對其酶活有明顯抑制作用，這與大腸桿菌表達的重組DPE酶酶學性質(zhì)一致[17]。

3 結(jié)語

D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶可在食品級微生物枯草芽孢桿菌中的表達，利用PCR擴增D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶基因與枯草芽孢桿菌載體pMA5連接，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMA5-cbdpe。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis WB800感受態(tài)細胞，利用卡那霉素篩選和PCR鑒定，獲得一株D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶重組枯草芽孢桿菌菌株。該重組菌株無需誘導即可產(chǎn)生D-阿洛酮糖3-差向異構(gòu)酶，18 h時酶活即可達到6.8 U/mL。同時，對枯草芽孢桿菌表達的重組DPE酶的酶學性質(zhì)進行測定，發(fā)現(xiàn)其酶學性質(zhì)與大腸桿菌來源的DPE酶相似。

圖12 不同金屬離子對重組DPE酶活影響Fig.12 Effect of different metallic ions on the DPE activity

利用枯草芽孢桿菌作為宿主菌進行D-阿洛酮糖 3-差向異構(gòu)酶生產(chǎn)，無內(nèi)毒素產(chǎn)生，無需添加誘導劑，發(fā)酵簡單，發(fā)酵時間短，能耗低，適用于D-阿洛酮糖的工業(yè)化生產(chǎn)。此外，本研究也可為提高我國酶制劑行業(yè)在食品及其他相關(guān)領(lǐng)域發(fā)展的研究提供參考，具有重要的現(xiàn)實意義。

[1]Matsuo T，Suzuki H，Hashiguchi M，et al.D-psicose is a rare sugar that provides no energy to growing rats[J].Journal of Nutrition Science Vitaminol，2002，48：77-80.

[2]Izumori K.Izumoring：a strategy for bioproduction of all hexoses[J].Journal of Biotechnology，2006，124（4）：717-722.

[3]Iida T，Hayashi N，Yamada T，et al.Failure of d-psicose absorbed in the small intestine to metabolize into energy and its low large intestinal fermentability in humans[J].Metabolism，2010，59（2）：206-214.

[4]N Hayashi，T Iida，T Yamada，et al.Study on the postprandial blood glucose suppression effect of D-psicose in borderline diabetes and the safety of long-term ingestion by normal human subjects[J].Bioscience，Biotechnology，Biochemistry，2010，74：510-519.

[5]Matsuo T，Izumori K.D-Psicose inhibits intestinal α -glucosidase and suppresses the glycemic response after ingestion of carbohydrates in rats[J].Journal of Clinical Biochemistry and Nutrition，2009，45（2）：202-206.

[6]Murata A，Sekiya K，Watanabe Y，et al.A novel inhibitory effect of D-allose on production of reactive oxygen species from neutrophils[J].J Bioscience Bioengineering，2003，96：89-91.

[7]Takata M，Yamaguchi F，Nakanose K，et al.Neuroprotective effect of D-psicose on 6-hydroxydopamine-induced apoptosis in rat pheochromocytoma（PC12） cells[J].Journal of Bioscience Bioengineering，2005，100：511-516.

[8]Mu W，Zhang W，F(xiàn)eng Y，et al.Recent advances on applications and biotechnological production of D-psicose[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2012，94（6）：1461-1467.

[9]儲菲菲，沐萬孟，邢慶超，等.Clostridium bolteae ATCC BAA-613 D-塔格糖3-差向異構(gòu)酶的誘導表達、純化及活性研究[J].食品工業(yè)科技，2012，33（7）：198-201.CHU Feifei，MU Wanmeng，XING qingchao，et al.Study on expression，purification and enzyme activity of Clostridium bolteae ATCC BAA-613 D-tagatose 3-epimerase[J].Science and Technology of Food Industry，2012，33（7）：198-201.（in Chinese）

[10]Yang H，Liu L，Li J，et al.Heterologous expression，biochemical characterization，and overproduction of alkaline a-amylase from Bacillus alcalophilus in Bacillus subtilis[J].Microb Cell Fact，2011，10：77.

[11]李靜靜，徐美娟，張顯，等.一種耐低溫α-乙酰乳酸脫羧酶在枯草芽孢桿菌中的高效表達[J].食品與生物技術(shù)學報，2013，32（5）：516-523.LI Jingjing，XU Meijuan，Zhang Xian，et al.High-level expression of cold-adapted α-acetolactate decarboxylase in Bacillus subtilis[J].Food Science and Biotechnology，2013，32（5）：516-523.（in Chinese）

[12]Kunst F，Rapoport G.Salt stress is an environmental signal affecting degradative enzyme synthesis in Bacillus subtilis[J].Journal of Bacteriology，1995，177（9）：2403-2407.

[13]Wanmeng Mu，F(xiàn)eifei Chu，Qiangchao Xing，et al.Cloning，expression，and characterization of a D-psicose 3-epimerase from Clostridium cellulolyticum H10[J].Journal of Agriculture and Food Chemistry，2011，59：7785-7792.

[14]Lowry O H，Rosenbrough N J，F(xiàn)arr A L，et al.Protein measurement with the folin phenol reagent[J].Journal of Biological Chemistry，1951，193：265-275.

[15]Wu S C，Yeung J C，Duan Y，et al.Functional production and characterization of a fibrin-specific single-chain antibody fragment from Bacillus subtilis：effects of molecular chaperones and a wall-bound protease on antibody fragment production[J].Applied and Environmental Microbiology，2002，68（7）：3261-3269.

[16]賈敏，江波，張曉鳴，等.乳糖誘導D塔格糖3差向異構(gòu)酶基因在大腸桿菌中的表達[J].食品工業(yè)科技，2013，34（13）：143-146.JIA Min，JIANG Bo，ZHANG Xiaoming，et al.Expression of recombinant D-tagatose 3-epimerase in E.coli BL21/（DE3）induced by lactose[J].Science and Technology of Food Industry，2013，34（13）：143-146.（in Chinese）

[17]Jia M，Mu W，Chu F，et al.A d-psicose 3-epimerase with neutral pH optimum from clostridium bolteae for d-psicose production：cloning，expression，purification，and characterization[J].Applied Microbiology and Biotechnology，2014，98（2）：717-725.