石墨烯固相萃取-液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法測定食品接觸材料中9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚的遷移量

龔 強(qiáng)， 丁 利， 肖家勇， 吳新華， 成 婧，朱紹華， 焦艷娜， 付善良， 王利兵*

（1.湖南出入境檢驗(yàn)檢疫局 檢驗(yàn)檢疫技術(shù)中心，食品安全科學(xué)技術(shù)湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004；2.中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙410004）

雙酚-二環(huán)氧甘油醚類物質(zhì)作為合成環(huán)氧樹脂原料且具有清除氯酸作用，常用作為嬰兒奶瓶、食品罐頭等多種食品接觸材料的內(nèi)涂層[1-2]。這類容器在使用過程中，雙酚類物質(zhì)殘留會向食品中遷移，與食品接觸后形成水合物、氯代物等衍生物而造成污染[3-5]。環(huán)境毒理學(xué)將這類物質(zhì)稱為環(huán)境激素，又稱“外因性內(nèi)分泌干擾物”。有研究報道，微量甚至痕量的雙酚A及其環(huán)氧化合物，即可能對動物生理狀況、生殖系統(tǒng)以及胎兒發(fā)育造成不良影響[6-8]。鑒于其對健康的危害，檢測接觸食品中其遷移含量，為預(yù)防其危害有著重要意義。目前，對于食品接觸材料中有毒有害物質(zhì)的遷移量測定一般采用食品模擬物，但對于實(shí)際樣品來說，樣品基質(zhì)復(fù)雜，前處理更復(fù)雜，有毒有害物質(zhì)的痕量遷移量的測定具有一定挑戰(zhàn)性。

石墨烯作為一種新型的碳納米材料，因?yàn)槠洫?dú)特而又嚴(yán)密的二維結(jié)構(gòu)，近來被廣泛關(guān)注。石墨烯具有比碳納米管更大的比表面積，而且石墨烯的制備更為簡單，且不受金屬離子的污染。近年來，石墨烯作為比碳納米管更優(yōu)異的吸附劑而廣泛用于SPE等分離領(lǐng)域，Liu等人以石墨烯負(fù)載硅膠固相萃取環(huán)境樣品中氯酚，同時進(jìn)一步利用石墨烯包覆磁性材料富集生物大分子以及環(huán)境樣品中多溴聯(lián)苯醚[9-12]；Dong等人采用石墨烯基質(zhì)分散萃取了生物樣品中的小分子[13]。

作者在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，采用石墨烯填充固相萃取柱，高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜測定，以實(shí)際樣品為基質(zhì)，測定不同生產(chǎn)日期的同類基質(zhì)以及不同基質(zhì)中的雙酚-二環(huán)氧甘油醚的遷移量，方法簡單、靈敏、快速。

1 材料與方法

1.1 儀器、試劑與材料

API 4000 Q TRAP質(zhì)譜儀，美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司制造；多功能微量化樣品處理儀，長沙中訊電子工程研究所制造；固相萃取儀，美國Supelco公司制造；高速離心機(jī)，德國Sigma公司制造；KQ-250E超聲波振蕩器，美國進(jìn)口。

甲醇、叔丁基甲醚、乙酸乙酯、乙腈，均為色譜純，德國Merck公司產(chǎn)品；乙酸、乙酸銨，為分析純，北京化工廠產(chǎn)品；水為超純水，以美國Millipore超純水儀制備。

石墨烯（直徑 0.5～2 μm，厚度～0.8 nm），南京先鋒納米公司產(chǎn)品；雙酚-二環(huán)氧甘油醚標(biāo)準(zhǔn)品：雙酚A 二縮水甘油醚（BADGE），雙酚 A（2，3-二羥基丙基）縮水甘油醚（BADGE·H2O），雙酚 A（3-氯-2-羥丙基）縮水甘油醚（BADGE·HCl），雙酚 A-雙（2，3-二羥丙基）醚（BADGE·2H2O），雙酚 A 二（3-氯-2-羥丙基）醚（BADGE·2HCl），雙酚 A（3-氯-2-羥丙基）（2，3-二羥基丙基）醚（BADGE·H2O·HCl），雙酚F 二縮水甘油醚（BFDGE），雙酚 F-雙（2，3-二羥丙基）醚（BFDGE·2H2O），雙酚 F 雙（3-氯-2-羥丙基）醚（BFDGE·2HCl），純度均≥95%，Sigma-Aldrich 公司產(chǎn)品；八寶粥、魚肉、橘片罐頭和牛肉等罐頭食品，購于長沙超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取9種雙酚-環(huán)氧甘油醚標(biāo)準(zhǔn)品各10.0 mg，用甲醇溶解，配成1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。分別取標(biāo)準(zhǔn)儲備液，用甲醇定容配成100 μg/mL的中間標(biāo)準(zhǔn)溶液。上述溶液均4℃冷藏避光儲存。取適量儲備液，用甲醇稀釋配成溶度為1.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3 石墨烯固相萃取小柱的制備

采用商品化空的3 mL的固相萃取小柱，用墊圈封住小柱底部，稱取20 mg石墨烯置于固相萃取柱中，用墊圈封住小柱頂部并壓緊，使其高度約為0.3 cm。使用前依次用6 mL甲醇、6 mL水活化。

1.4 樣品前處理

1.4.1 提取 稱取5.0 g樣品于50 mL的離心管中，加入15 mL叔丁基甲醚，振蕩混勻2 min，超聲提取15 min后，以7 000 r/min離心5 min，分離上清液。下層殘渣再用15 mL叔丁基甲醚采用上述步驟重復(fù)提取一次，合并兩次提取液。將提取液氮?dú)獯抵两桑?6 mL 甲醇-水（體積比 50∶50）溶解，肉制品樣品采用正己烷去脂：加3 mL正己烷，振蕩混勻后棄正己烷層，凈化。

1.4.2 凈化 將提取液加到已活化石墨烯固相萃取小柱上，控制體積流量為1 mL/min，讓溶液流盡，5 mL水淋洗，棄淋洗液。用9 mL乙酸乙酯洗脫，收集全部洗脫液，氮?dú)獯抵两?，用體積比1∶1甲醇-水定容至1 mL，過0.45 μm濾膜，上機(jī)分析。

1.5 色譜條件和質(zhì)譜條件

1.5.1 色譜條件 流動相為甲醇 （A）和5 mmol/L醋酸銨溶液（內(nèi)含質(zhì)量分?jǐn)?shù)0.1%乙酸）（B），體積流量為0.25 mL/min；梯度（體積分?jǐn)?shù)）洗脫程序?yàn)椋撼跏紩r 40%B；0～10 min，45%～5%B；10～10.01 min，5%～40%B；10.01～15 min，40%B。 色譜柱為 COSMOSIL柱（150mm×2.0mm；2.5μm），柱溫30℃，進(jìn)樣量10μL。

1.5.2 質(zhì)譜條件 離子源：質(zhì)譜離子源為電噴霧離子源（ESI）；掃描方式：正離子掃描；霧化氣（Gas1）：60.00 psi；輔助氣（Gas2）：65.00 psi；離子噴霧電壓（IS）：5 500.00 V；氣簾氣（Cur）：20.00 psi；離子化溫度（TEM）：500℃；檢測方式：多反應(yīng)監(jiān)測掃描模式（MRM）。多反應(yīng)監(jiān)測條件下9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚定性離子對、定量離子對、碰撞氣能量和去簇電壓見表1。

表1 多反應(yīng)檢測掃描模式檢測9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚的部分質(zhì)譜參數(shù)Table 1 Some parameters of multiple reaction monitoring detection for 9 bisphenol diglycidyl ethers

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用注射泵連續(xù)進(jìn)樣，將9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚標(biāo)準(zhǔn)溶液（質(zhì)量濃度100 ng/mL）分別注入離子源中，正離子模式下進(jìn)行母離子全掃描，選擇適當(dāng)?shù)姆肿与x子峰。結(jié)果表明，電噴霧正離子電離模式下，9種物質(zhì)全掃描的分子離子[M+NH4]+最理想。分別對9種甘油醚的母離子進(jìn)行二次碎裂，得到碎片離子峰的信息，確定每個目標(biāo)化合物的特征離子對后，在多反應(yīng)監(jiān)測 （MRM）模式下優(yōu)化去簇電壓（DP）、碰撞能量（CE）。 聯(lián)機(jī)液相色譜儀，參照本課題組吳新華[13]液相條件，流動注射分析優(yōu)化碰撞氣（CAD）、霧化氣（Gas1）、輔助氣（Gas2）、噴霧電壓（IS）、氣簾氣（CUR）、離子化溫度（TEM）等質(zhì)譜參數(shù)。優(yōu)化好9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚的MRM色譜圖，見圖1。

圖1 9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）色譜圖（100 ng/mL）Fig.1 Chromatograms of 9 bisphenol diglycidyl ethers in MRM mode（100 ng/mL）

2.2 石墨烯用量的選擇

石墨烯表面積非常大 （理論值為2630 m2/g）[9]，有著很強(qiáng)的吸附能力，因此適當(dāng)選擇固相萃取中石墨烯的用量對實(shí)驗(yàn)極為關(guān)鍵。Liu等采用20 mg石墨烯作為固相萃取填料，對氯酚類物質(zhì)進(jìn)行分析，獲得了較好的回收率[12]。本文作者選擇了5、10、20、40、60、80 mg石墨烯，對空白樣品進(jìn)行加標(biāo)回收分析，9種甘油醚的加標(biāo)量均為10.0 μg/kg。石墨烯用量低于20 mg時，9種環(huán)氧甘油醚的回收率隨著石墨烯的增加而增大；用量在20～40 mg之間時，回收率變化不大；當(dāng)用量大于40 mg時，回收率隨著石墨烯增加反而有所降低（見圖2）。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇20 mg石墨烯作為固相萃取填料用量。

2.3 提取溶劑的優(yōu)化

參照本課題組吳新華文獻(xiàn)[14]，本實(shí)驗(yàn)分別比較了乙腈、甲醇、乙酸乙酯和叔丁基甲醚作為提取溶劑對9種環(huán)氧甘油醚提取效率的影響 （見圖3）。9種甘油醚的加標(biāo)量均為10 μg/kg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同的提取溶劑對9種甘油醚的回收率差異較大。其中甲醇、乙腈提取回收率較低，9種甘油醚的回收率在34.6%～70.7%之間。叔丁基甲醚對9種甘油醚的回收率在63.7%～101.9%，綜合分析較其他3種試劑提取回收率好。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇叔丁基甲醚作為提取溶劑。

圖2 石墨烯用量對9種環(huán)氧甘油醚回收率的影響Fig.2 Effect of graphene on the recoveries of 9 bisphenol diglycidyl ethers

2.4 洗脫溶劑的選擇

經(jīng)石墨烯吸附后，洗脫效率是回收率的保證。實(shí)驗(yàn)過程中分別比較了乙腈、堿性甲醇（含體積分?jǐn)?shù)5%氨水）、叔丁基甲醚和乙酸乙酯作為洗脫溶劑對9種環(huán)氧甘油醚洗脫效率的影響（見圖4）。9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚的加標(biāo)量均為10.0 μg/kg，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：不同的洗脫溶劑對9種甘油醚的回收率差異較大。其中乙腈的洗脫回收率較低，9種甘油醚的回收率在40.1%～71.9%之間。堿性甲醇對BADGE的回收率為58.2%；對BFDGE的回收率為50.4%；對其他幾種甘油醚的回收率在77.3%～86.5%之間。叔丁基甲醚對BADGE、BFDGE及BFDGE·2HCl的回收率較低，分別為52.6%、52.7%和65.4%。乙酸乙酯對9種甘油醚的回收率在65.7%～107.9%之間，洗脫回收率高于其他3種溶劑。因此，本實(shí)驗(yàn)選擇乙酸乙酯作為洗脫溶劑。

2.5 方法的線性范圍與檢測限

圖3 不同溶劑提取罐頭食品中雙酚-二環(huán)氧甘油醚的回收率Fig.3 Recoveries of bisphenol diglycidyl ethers in the canned foodstuffs by different extraction solvent

圖4 不同溶劑洗脫罐頭食品中雙酚-二環(huán)氧甘油醚的回收率Fig.4 Recoveries of bisphenol diglycidyl ethers in the canned foodstuffs by different elution solvent

在上述優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件下，用空白基質(zhì)溶液配制一系列雙酚-二環(huán)氧甘油醚質(zhì)量濃度分別為0.5、1.0、2.0、5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL 的混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，進(jìn)行添加實(shí)驗(yàn)分析。結(jié)果表明9種環(huán)氧甘油醚的質(zhì)量濃度x（ng/mL）和峰面積y之間均有良好的線性關(guān)系，相關(guān)系數(shù)在0.992 2～0.999 6之間（見表 2）；其中 BADGE·2H2O、BFDGE·2HCl的線性范圍為 0.5～50.0 ng/mL；BADGE·2HCl和BFDGE·2H2O的線性范圍為5.0～100.0 ng/mL；其他5種的線性范圍為2.0～100.0 ng/mL。 分析物最低檢測限（LOQ）根據(jù)其響應(yīng)值大于或等于基線響應(yīng)值的3倍（S/N≥3）且準(zhǔn)確度和精密度RSD＜20%來確定。采用實(shí)際樣品添加法進(jìn)行分析，確定方法的最低定量檢測限，見表2。

2.6 方法的回收率與精密度

采用5 g不同罐頭基質(zhì)，分別按低（線性低限）、中、高3個濃度進(jìn)行9種環(huán)氧甘油醚標(biāo)準(zhǔn)混合溶液的添加回收分析。每個加標(biāo)濃度水平平行測定6份樣品，計算平均回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差，見表3。9種環(huán)氧甘油醚在橘片罐頭樣品中的平均添加回收率為65.4%～111.3%，肉類罐頭中的平均添加回收率為60.0%～97.6%。相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于20%，方法重復(fù)性較好。

2.7 實(shí)際樣品的測定

用本法對不同種類及不同生產(chǎn)日期的同類罐頭作實(shí)樣測定，對陽性樣品多重測定，結(jié)果表明靈敏度高、重復(fù)性好。圖5為實(shí)樣MRM色譜圖。

表2 9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚的回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)和檢測限Table 2 Regression equations，linear ranges，correlation coefficients and LODs of 9 bisphenol diglycidyl ethers

表3 不同罐頭樣品中9種環(huán)氧甘油醚添加平均回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（n=6）Table 3 Recoveries and relative standard detiation（RSDs） of 9 bisphenol diglycidyl ethers in can food（n=6）

圖5 實(shí)際樣品MRM色譜圖Fig.5 MRM chromatograms of real samples

魚罐頭樣品檢出 220.0 μg/kg的 BADGE·HCl和 139.0 μg/kg 的 BADGE·H2O·HCl； 牛肉罐頭樣品檢 出 222.0 μg/kg 的 BADGE·HCl，47.2 μg/kg 的BADGE·H2O和49.2μg/kg 的 BADGE·H2O·HCl。

3 結(jié)語

通過優(yōu)化改進(jìn)樣品前處理條件，以實(shí)際樣品為檢測對象，建立了罐頭食品接觸材料中9種雙酚-二環(huán)氧甘油醚遷移量的石墨烯固相萃取凈化HPLC-MS/MS檢測方法。該方法操作簡單，靈敏度高，使用石墨烯作為固相萃取柱回收率高、重復(fù)性好，為食品接觸材料中內(nèi)分泌干擾物的遷移動力學(xué)研究提供了檢測技術(shù)基礎(chǔ)，對食品安全有著重要的意義。

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