大鼠室管膜下區(qū)和齒狀回的EGFR表達＊

西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院人體解剖與組織胚胎學(xué)系·神經(jīng)生物學(xué)研究所 （西安710061）

肖新莉 徐 曦Δ 馮 駿＃ 譚 敬＃ 劉 勇▲

表皮生長因子受體（Epidermal growth factor receptor，EGFR）與表皮生長因子（EGF）與轉(zhuǎn)化生長因子-α（TGF-α）結(jié)合后，能促進體外培養(yǎng)或在體的內(nèi)源性神經(jīng)前體細胞增殖［1，2］。成年動物側(cè)腦室前部的室下區(qū)（SVZ）和海馬的顆粒下區(qū)（SGZ）終生存在著神經(jīng)發(fā)生［3］。根據(jù)細胞超微結(jié)構(gòu)和抗原特征，界定了三類SVZ細胞類型：膠質(zhì)纖維酸性蛋白陽性（GFAP＋）的神經(jīng)干細胞（B類細胞）、表皮生長因子受體陽性（EGFR＋）的轉(zhuǎn)化擴增祖細胞（C類細胞）和doublecortin陽性 （DCX＋）的 神 經(jīng) 母 細 胞 （A 類 細 胞）［4，5］。激 活EGFR能極大地刺激SVZ細胞增殖：小鼠側(cè)腦室注射EGF能促進SVZ細胞增殖［6］，而TGF-α基因敲除小鼠的SVZ細胞增殖能力下降［7］。神經(jīng)球體外實驗證實，在細胞自我更新和增殖過程中，EGF是必需的，這進一步說明了EGF在SVZ細胞增殖中的核心作用［8，9］。近年發(fā)現(xiàn)：EGFR 信號通 路參與調(diào) 節(jié)SVZ各細胞類型間的平衡。Aguirre等［10］報道EGFR和Nortch信號途徑在多細胞有機體發(fā)育過程中在調(diào)節(jié)神經(jīng)干細胞和神經(jīng)祖細胞數(shù)量平衡上有重要作用。在體加強EGFR信號致使神經(jīng)祖細胞數(shù)量擴增，并且神經(jīng)干細胞的數(shù)量和自我更新能力下降，這是通過EGFR介導(dǎo)的Notch信號調(diào)控機制實現(xiàn)的。

本實驗觀察大鼠不同發(fā)育時期SVZ和齒狀回（DG）的EGFR的表達，旨在明確EGFR在這兩個區(qū)域表達的意義及其與動物年齡的關(guān)系。

材料與方法

1 BrdU標記 生后7d的大鼠處死前一天給予3次BrdU（50mg／kg，腹腔注射，溶解在0．9%生理鹽水和0．007NNaOH，濃度為10mg／ml，Sigma），間隔8h，最后一次注射BrdU后的8h處死，可作免疫熒光雙重染色。

2 實驗動物及組織準備 SD大鼠40只，分為胚胎18d（E18）組，生后1d組（P1）、3d組（P3）、5d組（P5）、7d組（P7）、30d組（P30）、120d組（P120）和365d組（P365），雌雄不限。取孕18dSD大鼠1只，用2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后，頸椎脫臼法處死。取出胎鼠，斷頭取腦，經(jīng)4%多聚甲醛后固定。其他各組大鼠經(jīng)腹腔麻醉，打開胸腔，用0．1MPBS（pH7．4）經(jīng)左心室灌注沖洗，再用4%多聚甲醛磷酸鹽緩沖液緩慢灌注固定，切取包含SVZ和DG的腦片，石蠟包埋，切片，片厚7μm，每間隔5片取1片，貼于經(jīng)鉻礬明膠處理過的載玻片上，用于EGFR染色。

3 免疫組織化學(xué)染色 石蠟切片脫蠟至水，正常山羊血清封閉2h，滴加兔抗大鼠EGFR抗體（1∶100，Santa Cruz），4℃孵育過夜，加山羊抗兔二抗，室溫孵育2h，ABC復(fù)合物室溫孵育1h，每步間用0．01MPBS（pH7．4）洗，DAB顯色，常規(guī)脫水、透明、封片，陰性對照片用0．01MPBS（pH7．4）代替EGFR抗體。

對于BrdU／EGFR雙重免疫熒光染色，腦切片在50%甲酰胺（2×SSC溶液配制，0．3M 氯化鈉，0．03 M檸檬酸鈉）65℃孵育2h，2N鹽酸37℃孵育30min進行DNA變性，然后在0．1M 硼酸（pH8．5）室溫孵育10min，加封閉液（5%正常山羊血清）2h后，然后加小鼠抗BrdU（1∶500，Sigma公司）和EGFR（1∶100，Millionpore）在4℃過夜，切片經(jīng)0．01M磷酸鹽緩沖液洗后，加FITC標記（1∶100，驢抗兔，Millionpore）和Cy3標記（山羊抗小鼠，Millionpore）熒光抗體4h，用熒光封片劑封片后奧林巴斯共聚焦激光掃描顯微鏡觀察結(jié)果。

4 結(jié)果觀察 每只大鼠選取背海馬顳側(cè)的3張切片（連續(xù)切片每12張選1張），使用Image-pro-plus軟件（Olympus，Japan），計數(shù)EGFR陽性細胞數(shù)。

5 統(tǒng)計學(xué)處理 本組將所得數(shù)據(jù)輸入計算機，采用SPSS10．0軟件進行，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較采用t檢驗和方差分析，以P＜0．05為有顯著性差異，P＜0．01為有極顯著性差異。

結(jié) 果

1 側(cè)腦室室管膜和室管膜下區(qū) EGFR陽性細胞呈胞漿和胞膜著色（見圖1～2）。各組室管膜細胞都呈EGFR陽性。側(cè)腦室背外側(cè)角SVZ的EGFR陽性細胞聚集，形成由內(nèi)向外細胞數(shù)逐漸減少、并且沿胼胝體下方排列的細胞鏈，在P30，P120和P365側(cè)腦室背外側(cè)角SVZ的EGFR陽性細胞較E18，P1，P3，P7組明顯減少，在P365的側(cè)腦室SVZ背外側(cè)角亦可見較多的EGFR陽性細胞，E18，P1，P5組EGFR陽性細胞數(shù)目顯著性地多于其它組（見圖2C）。

2 齒狀回 在齒狀回，顆粒細胞、一些位于SGZ、分子層和門區(qū)的細胞呈EGFR陽性（見圖3～4）。在分子層，P1時EGFR陽性細胞數(shù)目顯著性地多于P7，P30，P120和P365，并且P3和P5與P120和P365時的EGFR陽性細胞數(shù)目比較也有顯著性差異，在顆粒細胞層，P1，P3和P5的EGFR陽性細胞數(shù)顯著性地少于P7，P30，P120和P365，并且P7與P30，P120和P365的EGFR陽性細胞數(shù)比較也有顯著性差異（見圖4B-D）。在門區(qū)，出生后7d內(nèi)的EGFR陽性細胞數(shù)目較多。

3 免疫熒光雙重染色 在SVZ，90%左右的BrdU陽性細胞都是EGFR陽性細胞。未見室管膜的EGFR陽性細胞呈BrdU陽性（見圖5A-C）。在齒狀回，60%～80%在門區(qū)的BrdU陽性細胞呈EGFR陽性細胞，30%～40%在SGZ的BrdU陽性細胞呈EGFR陽性細胞，20%左右的顆粒細胞層的BrdU陽性細胞呈EGFR陽性細胞（見圖5D-F）。

圖1 EGFR在側(cè)腦室室管膜和室管膜下區(qū)的表達 A：E18；B：P1；C：P3；D：P5；E：P7；F：P30．SVZ：腦室室管膜下區(qū)；LV：側(cè)腦室；標尺在圖F：A-E：400μm，F(xiàn)：200μm

圖2 EGFR在側(cè)腦室室管膜和室管膜下區(qū)的表達 A：P120；B：P365．C：各年齡組室管膜下區(qū)的陽性細胞數(shù)統(tǒng)計分析結(jié)果；標尺＝200μm

圖3 EGFR在齒狀回的表達 A：P1；B：P3；C：P5；D：P7；E：P30；F：P120．ml：分子層；GL：顆粒細胞層；HI：門區(qū)；標尺在圖G：A：800μm，B and C：400μm，D-F：200μm

圖4 EGFR在齒狀回的表達 A：P356．B-D：各年齡組齒狀回各層的陽性細胞數(shù)統(tǒng)計分析結(jié)果 標尺＝200μm

圖5 BrdU與EGFR在生后1周大鼠的室管膜下區(qū)和齒狀回的熒光雙重染色 BrdU：紅色，EGFR：綠色；A-C：室管膜下區(qū)，△雙染細胞；D-F：齒狀回，△門區(qū)的雙染細胞，↓：顆粒細胞層的雙染細胞；標尺＝20μm

討 論

Bouab等［11］研究顯示存在于SVZ和SGZ的神經(jīng)干細胞隨小鼠年齡增長再生能力下降。在老年小鼠，大量的成體神經(jīng)干細胞處于靜止狀態(tài)。實驗揭示中年小鼠（生后1年）和年輕小鼠（生后2月）相比，SVZ的總體產(chǎn)出大幅下降，包括各類神經(jīng)前體亞群細胞數(shù)目減少，這些變化與SVZ小窩內(nèi)顯著的細胞學(xué)異常有關(guān)，包括SVZ的萎縮和大量脂滴在室管膜細胞內(nèi)聚集。中年小鼠SVZ系統(tǒng)產(chǎn)出降低與靜態(tài)相關(guān)變化有關(guān)系。組織培養(yǎng)實驗表明：年輕小鼠和中年小鼠的SVZ的神經(jīng)球形成成體神經(jīng)干細胞數(shù)目相等，但是中年小鼠的SVZ的神經(jīng)球表現(xiàn)出獨有的體外培養(yǎng)特性，在體的內(nèi)源性的SVZ區(qū)的成體神經(jīng)干細胞分裂頻率下降。我們的研究也表明位于SVZ和齒狀回的分子層和門區(qū)呈EGFR陽性細胞隨大鼠年齡增長數(shù)目下降。

Cesetti等［12］報道腦片研究發(fā)現(xiàn)，在SVZ，絕大多數(shù)轉(zhuǎn)化擴增祖細胞是EGFR陽性細胞，利用細胞追蹤技術(shù)顯示這些細胞在培養(yǎng)的兩天內(nèi)退出細胞循環(huán)分化為一種介于轉(zhuǎn)化擴增祖細胞和神經(jīng)母細胞之間的狀態(tài)。Danilov等［13］超微結(jié)構(gòu)研究顯示神經(jīng)干細胞和神經(jīng)母細胞的纖毛內(nèi)結(jié)構(gòu)表達EGFR，并且只有這兩類細胞能夠結(jié)合BrdU。在細胞分裂時，EGFR與紡錘體的微管蛋白關(guān)聯(lián)。我們的研究在SVZ也發(fā)現(xiàn)了大量的BrdU陽性細胞都是EGFR陽性細胞。室管膜細胞也表達EGFR，但是不結(jié)合BrdU，這點與我們的觀察結(jié)果一致。

Okano等［14］使用 H3標記胸腺嘧啶，在SVZ和SGZ，發(fā)現(xiàn)大量的含有H3胸腺嘧啶標記的細胞呈EGFR陽性。這點與我們的觀察結(jié)果一致。Fox等［15］報道在齒狀回的一些中間神經(jīng)元表達EGFR，在我們的研究中，不同年齡階段的大鼠齒狀回的分子層和門區(qū)都能夠檢測到EGFR陽性細胞，可以推測這些細胞絕大多數(shù)都是中間神經(jīng)元。

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