RP-HPLC法測定消痛靈中延胡索乙素含量的方法研究

汪軍 姚閩

（江西省藥物研究所 南昌330029）

消痛靈是由制川烏、延胡索、胡椒等中藥組成的傳統(tǒng)復(fù)方制劑。其中延胡索辛甘溫，入肺、肝、脾三經(jīng)，活血散瘀、理氣止痛，治一身上下諸痛。主治胃痛、胸腹痛、疝痛、痛經(jīng)、月經(jīng)不調(diào)、產(chǎn)后瘀血、跌打損傷[1]。其主要成分為生物堿類，其中屬叔胺類者含量約0.65%，屬季銨類者約0.3%。叔胺類生物堿延胡索乙素為主要有效成分。本實(shí)驗(yàn)的目的是采用HPLC法測定方中延胡索乙素的含量，進(jìn)而達(dá)到控制消痛靈的質(zhì)量。現(xiàn)報(bào)道如下：

1 材料與方法

1.1 材料 Agilent1200高效液相色譜儀；U-3000型紫外-可見分光光度計(jì)（日本日立公司）；AE-240電子分析天平；PHS-3S精密pH計(jì)；KQ-250VDB型超聲機(jī)。色譜甲醇、雙蒸水、乙醚、磷酸、異丙醇、三乙胺均為分析純。消痛靈（自制）、延胡索乙素購自中國藥品生物制品檢定所（批號：110726-200409）

1.2 方法 李紅艷等采用Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-磷酸鹽緩沖液（pH 7.65，65:35）[2]；陸益等用乙醚提取香術(shù)止痛酊中延胡索乙素，使用Zorbax ODS C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以甲醇 -水（67:33）為流動相[3]；陳再興等采用Kromail C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈 -0.1%磷酸溶液（pH 6.5）為流動相[4]，檢測波長均為280 nm，結(jié)果表明方法可行。綜合文獻(xiàn)資料，本實(shí)驗(yàn)擬采用色譜條件為：色譜柱：C18（250 mm×4.6 mm，5μm）（大連依利特）；流動相：甲醇-0.01%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH=6.0，34:66）；柱溫：25℃；檢測波長：280 nm；流速：1.00 mL/min。

1.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取延胡索乙素對照品適量加甲醇制成每1 mL含對照品40 μg的溶液，搖勻即得。

1.2.2 供試品溶液的制備 精密稱取消痛靈2.0 g置錐形瓶中，加適量20%乙醇超聲溶解，用0.1 mol/mL HCl調(diào)至酸性，用乙醚振搖萃取3次，每次30 mL，棄去乙醚層，剩余液體用氨試液調(diào)至堿性，再用乙醚萃取3次，用量分別為40 mL、30 mL、20 mL，合并乙醚液至水浴鍋上蒸干，殘?jiān)眉状既芙獠⒍ㄈ葜?5 mL容量瓶中，搖勻，微孔濾膜濾過，即得。陰性樣品制備方法同上。

2 結(jié)果

精密吸取對照品溶液、供試品溶液及陰性樣品溶液各20 μL，分別注入液相色譜儀，測定。研究結(jié)果表明，延胡索乙素保留時間為22 min左右，理論塔板數(shù)以延胡索乙素峰計(jì)為5 249，且其能夠與樣品中的其它物質(zhì)很好地分離，陰性樣品無干擾。

2.1 線性關(guān)系的考察 配制濃度分別為0.001 5 mg/mL、0.003 0 mg/mL、0.004 5 mg/mL、0.006 0 mg/mL、0.007 5 mg/mL、0.009 0 mg/mL 的對照品溶液，分別取20 μL，注入高效液相色譜儀，按上述色譜條件測定，以峰面積積分值為縱坐標(biāo)，延胡索乙素的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為：y=9027.9x+36.747，R=0.9993，線性范圍 0.0015～0.009 0mg/mL。

2.2 精密度試驗(yàn) 在相同色譜條件下，取同一延胡索乙素對照品溶液（0.004 5 mg/mL）20 μL，連續(xù)進(jìn)樣6次，平均峰面積為804.3，RSD 0.74%。

2.3 穩(wěn)定性

取同一供試樣品溶液，每隔1 h進(jìn)樣1次，共進(jìn)樣6次，平均峰面積為433.9，RSD 1.77%，結(jié)果表明供試品溶液在8 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4 重復(fù)性試驗(yàn) 取同一批消痛靈6份，依上法測定，延胡索乙素平均含量0.66%，RSD 1.35%，結(jié)果表明方法重現(xiàn)性良好。

2.5 加樣回收實(shí)驗(yàn) 分別精密稱取已知含量的樣品（共6份），每份約1.0 g，分別精密加入對照品溶液，按上述方法測定并計(jì)算回收率，結(jié)果延胡索乙素平均回收率為95.4%、RSD為1.71%。

2.6 樣品處理方法的考察

2.6.1 提取溶媒對延胡索乙素提取效果的影響莊建紅等采用超聲、冷浸、熱回流3種不同的提取方法，對延胡索中延胡索乙素含量測定進(jìn)行比較，結(jié)果表明超聲提取方法含量高，操作簡便[5]。因此本實(shí)驗(yàn)精密稱取等量的消痛靈分別用20%乙醇、0.1 mol/mL HCl、氨水 -甲醇（1:20）超聲溶解，按供試品溶液的制備方法處理，在以上色譜條件下測定。結(jié)果顯示，以氨水-甲醇（1:20）為溶媒時，延胡索乙素的色譜峰面積均未達(dá)到自動積分的最小值；以0.1 mol/mL HCl為溶媒時延胡索乙素的峰面積明顯小于以20%乙醇為溶媒時的峰面積，故最終確定用20%乙醇作為提取溶媒。見表1。

表1 溶媒對延胡索乙素提取效果影響測定結(jié)果

2.6.2 萃取溶劑對延胡索乙素提取效果的影響精密稱取等量的消痛靈分別用20%乙醇超聲溶解，酸堿除雜后，分別用乙醚、乙酸乙酯萃取。制得的供試品溶液在以上色譜條件下測定，比較結(jié)果后發(fā)現(xiàn)用乙醚萃取制得的供試品溶液峰形較乙酸乙酯好，故最終確定用乙醚作為萃取溶劑。見表2。

表2 不同萃取溶劑條件下延胡索乙素峰形比較

2.6.3 色譜柱對延胡索乙素HPLC色譜峰的影響 通過對延胡索乙素的HPLC條件的考察，發(fā)現(xiàn)延胡索乙素在HPLC含測中使用不同的色譜柱，延胡索乙素的含量、保留時間及峰形均會受到一定的影響。見表3。

表3 不同色譜柱對消痛靈提取物延胡索乙素色譜峰的影響

3 討論

確定一個最優(yōu)的樣品處理方法對研究含量測定，將其用于中藥質(zhì)量控制至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)考察了提取溶媒、萃取劑、色譜柱、柱溫等因素對延胡索乙素的影響，最終確定以20%乙醇-0.1 mol/L HCl-氨試液-乙醚為最佳提取系統(tǒng)。但是在萃取過程中產(chǎn)生的乳化現(xiàn)象對延胡索乙素的含量測定有一定的影響，通過實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)柱溫對延胡索乙素色譜峰的影響較小，雖然較高的柱溫能使延胡索乙素的出峰時間縮短，但延胡索乙素與其他成分的分離改善不大。選用不同的色譜柱對延胡索乙素含量、保留時間及峰形會受到一定的影響，通過本實(shí)驗(yàn)結(jié)果看，選擇250 nm長度的色譜柱分離效果較好，結(jié)果更準(zhǔn)確。本實(shí)驗(yàn)對消痛靈中延胡索乙素的含量測定方法進(jìn)行了系統(tǒng)地考察，并建立了科學(xué)、合理、可操作性強(qiáng)、專一性好的含量測定方法，該方法可較好地控制中藥復(fù)方消痛靈的質(zhì)量。

[1]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典[M].第2部.北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2005.130-131

[2]李紅艷,廖錦紅,陳愛青,等.反相高效液相色譜法同時測定中藥延胡索中延胡索乙素和原阿片堿的含量[J].咸寧學(xué)院學(xué)報(bào),2008,28(3):98-101

[3]陸益,黎遠(yuǎn)冬,梁寧生,等.RP-HPLC法測定香術(shù)止痛酊中延胡索乙素的含量[J].廣西醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2008,25(3):427-428

[4]陳再興,孟舒,姜鴻,等.反相高效液相色譜法同時測定不同產(chǎn)地夏天無藥材中原阿片堿和延胡索乙素的含量 [J].天津中醫(yī)藥,2008,25(4):334-336

[5]莊建紅,簡惠,王俊香,等.延胡索中延胡索乙素含量測定提取方法的研究[J].時珍國醫(yī)國藥,1998,9(5):421