人轉(zhuǎn)錄因子sp1在大腸桿菌中的表達(dá)與體外純化

王琪煒，陳寶俊，強(qiáng)倩，李淑鋒

(1.東南大學(xué)生命科學(xué)研究院，江蘇南京 210018;2.南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院心胸外科，江蘇南京 210008;3.東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，江蘇南京 210009)

許多重要的生命活動(dòng)是由含有鋅指結(jié)構(gòu)域(zinc finger motif)的轉(zhuǎn)錄因子所調(diào)控的［1-2］，sp1(specific protein 1)就是這種類型的一種重要轉(zhuǎn)錄因子［3］。sp1蛋白的C端區(qū)域含有3個(gè)連續(xù)的鋅指結(jié)構(gòu)域，這一區(qū)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合GC-rich的啟動(dòng)子區(qū)域，從而調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄。它識(shí)別的DNA核心結(jié)合序列為 GGCGGGG［4］。

sp1最初是作為Hela細(xì)胞抽提物中具有體外轉(zhuǎn)錄活性的組分而被發(fā)現(xiàn)的［5］，后來的研究證明sp1在組織中的分布很廣泛而且能夠調(diào)控許多的靶基因［6-7］。通常情況下，受其調(diào)控的靶基因多為細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長等相關(guān)的基因［8-10］。更為重要的是，sp1在一些腫瘤中的表達(dá)水平明顯異常［11-13］。

為了研究sp1在基因表達(dá)中的調(diào)控作用，我們在原核系統(tǒng)中表達(dá)sp1蛋白并進(jìn)行純化。

1 材料與方法

1.1 材料

pET-28b質(zhì)粒，大腸桿菌Top10、BL21(DE3)菌株由作者所在實(shí)驗(yàn)室保存;含人sp1 cDNA的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-sp1購自Addgene;DNA分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ、XhoⅠ及T4DNA連接酶購自TaKaRa公司;PCR試劑及Agarose Gel快速純化試劑盒購自上海申能博彩生物科技有限公司;IPTG、尿素、蔗糖等化學(xué)試劑購自上海生工生物工程股份有限公司;Ni-IDA親和層析填料購自Pharmarcia公司。

1.2 方法

1.2.1 重組質(zhì)粒的亞克隆 將人源sp1真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-SP1用限制性內(nèi)切酶Eco RⅠ-XhoⅠ進(jìn)行雙酶切，瓊脂糖凝膠電泳后，回收約2 200 bp的片段，即為sp1-699c(88-786 aa)的cDNA。再用T4DNA連接酶將回收后的雙酶切片段連接到用Eco RⅠ-XhoⅠ雙酶切并回收后的pET-28b質(zhì)粒，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top 10感受態(tài)菌株，卡那霉素抗性LB平板篩選陽性克隆，挑取單克隆進(jìn)行酶切鑒定后送至南京金斯瑞生物科技有限公司進(jìn)行測序。用經(jīng)測序后完全正確的菌落提取重組質(zhì)粒。

1.2.2 融合蛋白在BL21(DE3)中的誘導(dǎo)表達(dá)與菌體收集 用經(jīng)測序后確認(rèn)正確的重組質(zhì)粒pET28b-sp1-699c轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)菌株，卡那霉素抗性LB平板篩選陽性克隆，挑取單克隆于含有卡那霉素的3 ml LB培養(yǎng)基，37℃振蕩過夜，吸取1 ml過夜培養(yǎng)菌液于100 ml含卡那霉素的LB培養(yǎng)基中，37℃繼續(xù)搖菌，培養(yǎng)至OD600nm達(dá)到0.8時(shí)，加入終濃度為1 mmol·L-1的IPTG，18℃誘導(dǎo)12 h，離心收集菌體，與0 h時(shí)的菌體同時(shí)進(jìn)行SDS-PAGE分析。將表達(dá)菌體重懸于5 ml預(yù)冷的裂解緩沖液(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl，30 mmol·L-1NaCl，0.05 mmol·L-1ZnCl2)，冰上超聲破碎，4℃ 12 000 r·min-1離心30 min，將離心后的上清和沉淀取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.3 包涵體中目的蛋白的變復(fù)性 將超聲離心后的沉淀重懸于5 ml預(yù)冷的1 mol的蔗糖溶液，反復(fù)吹打，充分混勻，4℃ 12 000 r·min-1離心30 min，棄上清，再將沉淀重懸于10 ml預(yù)冷的Triton-EDTA洗滌液(2%Triton X-100，10 mmol·L-1EDTA)，反復(fù)吹打，充分混勻，4℃放置12 h后，4℃ 12 000 r·min-1離心30 min，棄上清，用5 ml 8 mol的尿素溶液重懸沉淀，用1 L 透析液 A(4 mol·L-1尿素，30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl，30 mmol·L-1NaCl，0.05 mmol·L-1ZnCl2，1 mmol·L-1DTT)攪拌透析12 h，再用1 L透析液B(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl，30 mmol·L-1NaCl，0.05 mmol·L-1ZnCl2，1 mmol·L-1DTT)攪拌透析12 h。收集袋內(nèi)液，4℃ 12 000 r·min-1離心30 min，取上清和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE分析。

1.2.4 可溶性目的蛋白的純化 裝填Ni-IDA層析柱，當(dāng)柱床約2 cm高時(shí)，用3 ml緩沖液D(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl，30 mmol·L-1NaCl，0.05 mmol·L-1ZnCl2，500 mmol·L-1咪唑)洗去 Ni-IDA 上的雜蛋白，再用15 ml的緩沖液A(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl，30 mmol· L-1NaCl，0.05 mmol· L-1ZnCl2，10 mmol·L-1咪唑)平衡柱床，之后將透析后的袋內(nèi)液上清上樣，用4 ml的緩沖液B(30 mmol·L-1pH 7.5 Tris-HCl，30 mmol·L-1NaCl，0.05 mmol· L-1ZnCl2，50 mmol·L-1咪唑)洗去雜蛋白，最后用緩沖液C(30 mmol· L-1pH 7.5 Tris-HCl，30 mmol· L-1NaCl，0.05 mmol·L-1ZnCl2，250 mmol·L-1咪唑)洗脫含His-tag的目的蛋白，收集洗脫峰。取樣進(jìn)行SDS-PAGE分析。

2 結(jié) 果

2.1 原核表達(dá)質(zhì)粒pET28b-sp1-699c的構(gòu)建

sp1的真核表達(dá)質(zhì)粒pCMV-sp1圖譜如圖1所示，pCMV-sp1可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)1-87aa deleted的sp1蛋白，即C端699aa的sp1變體蛋白。我們將這一段編碼序列用Eco RⅠ和XhoⅠ切開連入pET-28b載體。

圖1 sp1真核表達(dá)質(zhì)粒p CMV-sp1圖譜Fig 1 Schematic diagram of the sp1's eukaryotic expression plasmid

重組質(zhì)粒酶切鑒定結(jié)果如圖2所示，其中長度約5.3 kb的片段為pET28b載體，長度約2.2 kb的片段為人源sp1-699c的cDNA片段。

圖2 重組質(zhì)粒p ET28b-sp1-699c酶切鑒定電泳結(jié)果Fig 2 Electrophoresis result of double-enzyme-cutting identification about recombination plasmid M.DNA marker;1.Recombination plasmid;2.Double-enzyme-cutting fragments

2.2 融合蛋白His-sp1的誘導(dǎo)表達(dá)與純化

經(jīng)SDS-PAGE分析，如圖3所示，融合蛋白的分子質(zhì)量約為91 kD，與理論值相符，且在菌體中實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)，但是主要仍為不可溶的包涵體形式，欲獲得較高濃度的目的蛋白，還需將包涵體經(jīng)高濃度尿素變性，使之溶解，再通過透析去除尿素，使目的蛋白復(fù)性，最后利用融合蛋白N端的His-Tag與鎳柱親和層析，一步純化獲得目的蛋白。

圖3 大腸桿菌表達(dá)的融合蛋白SDS-PAGEFig 3 SDS-PAGE of fusion protein expressed by E.coli M.Protein marker;1.Total protein before IPTG induction;2.Total protein after IPTG induction;3.Supernatant after ultrasonication;4.Precipitation after ultrasonication

融合蛋白親和層析后的SDS-PAGE如圖4所示，經(jīng)透析去除尿素后，絕大多數(shù)目的蛋白變?yōu)榭扇苄问?，透析后袋?nèi)液的上清用Ni-IDA親和層析純化過程簡單、高效，獲得了高濃度的融合蛋白(圖4泳道5)，且純化后的樣品純度也可達(dá)到85%左右，達(dá)到了進(jìn)行DNA-蛋白質(zhì)結(jié)合實(shí)驗(yàn)的純度標(biāo)準(zhǔn)。

3 討 論

sp1是一種在體內(nèi)各種組織中廣泛表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子，其C端區(qū)域含有3個(gè)連續(xù)的鋅指結(jié)構(gòu)域?yàn)镈NA的識(shí)別與結(jié)合結(jié)構(gòu)域，這些鋅指結(jié)構(gòu)域能夠特異性地識(shí)別并結(jié)合靶基因啟動(dòng)子區(qū)域GC-rich的位點(diǎn)，從而對基因的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行調(diào)控。研究發(fā)現(xiàn)，sp1參與調(diào)控多種重要的組成型基因［7，14］，在維持機(jī)體正常發(fā)育及生命活動(dòng)的過程中起重要作用，同時(shí)其作為體內(nèi)廣泛表達(dá)并發(fā)揮作用的轉(zhuǎn)錄因子，機(jī)體對sp1的表達(dá)水平也有嚴(yán)格的調(diào)控［15-17］。通常情況下，受sp1調(diào)控的下游基因多為細(xì)胞增殖、細(xì)胞分化、細(xì)胞生長以及促進(jìn)腫瘤的侵襲與遷移等相關(guān)的基因。sp1作為轉(zhuǎn)錄因子，自身表達(dá)水平的上調(diào)或下調(diào)能夠激活或者抑制這些基因的表達(dá)，從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生、生長、轉(zhuǎn)移以及血管生成等過程，在腫瘤的發(fā)生過程中扮演了非常重要的角色。而且，它在許多惡性腫瘤中表達(dá)明顯升高，與腫瘤的惡化及轉(zhuǎn)移程度相關(guān)［18］。因此，了解sp1的調(diào)控機(jī)制，不但有助于了解腫瘤的發(fā)生機(jī)制，還可為治療提供潛在的靶點(diǎn)。

在本研究中，我們使用了大腸桿菌的原核表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)過一系列條件的探索，尋找到一種能夠快速、高效地表達(dá)并且純化出人轉(zhuǎn)錄因子sp1蛋白的方法，為

圖4 融合蛋白親和層析后SDS-PAGEFig 4 SDS-PAGE after affinity chromatography of fusion protein M.Protein marker;1.Sample of the affinity chromatography;2.Liquid that flows though;3.Eluate of other protein;4-7.Eluate of target protein(the elution peak is lane 5)

其下游靶基因的調(diào)控研究奠定了基礎(chǔ)。

［1］EMERSON R O，THOMASJ H.Adaptive evolution in zinc finger transcription factors［J］.PLoSGenetics，2009，5(1):e1000325.

［2］VAQUERIZASJM，KUMMERFIELD SK，TEICHMANN SA，et al.A census of human transcription factors:function，expression and evolution［J］.Nat Rev Genet，2009，10:252-263.

［3］WIERSTRA I.Sp1:emerging roles-beyond constitutive activation of TATA-less housekeeping genes［J］.Biochemi Biophys Res Commun，2008，372:1-13.

［4］KADONAGA JT，CARNER K R，MASIARZ F R，et al.Isolation of cDNA encoding transcription factor sp1 and functional analysis of the DNA binding domain［J］.Cell，1987，51:1079-1090.

［5］DYNAN W S，TJIAN R.Isolation of transcription factors that discriminate between different promoters recognized by RNA polymeraseⅡ［J］.Cell，1983，32:669-680.

［6］LI L，HE SH，SUN JM.Gene regulation by sp1 and sp3［J］.Biochemistry Cell Biology，2004，82(4):460-471.

［7］BOUWMAN P，PHILPSEN S.Regulation of the activity of sp1-related transcription factors［J］.Mol Cell Endocrinol，2002，195:27-38.

［8］KAMADA M，SO A，MURAMAKI M，et al.Hsp27 knockdown using nucleotide-based therapies inhibit tumor growth and enhance chemotherapy in human bladder cancer cells［J］.Cancer Ther，2007，6(1):299-308.

［9］JENNINGSR，ALSARRAJ M，WRIGHT K L，et al.Regulation of the human transforming growth factor beta typeⅡreceptor gene promoter by novel sp1 sites［J］.Oncogene，2001，20(47):6899-6909.

［10］AMMANAMANCHI S，BRATTAIN M G.Sp3 is a transcriptional repressor of transforming growth factor-beta receptors［J］.J Biol Chem，2001，276(5):3348-3352.

［11］張俊，計(jì)駿，袁菲，等.轉(zhuǎn)錄因子sp1在胃癌中的表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系［J］.中華腫瘤雜志，2005，9:531-533.

［12］SAFE S，ABDELRAHIM M.Sp transcription factor family and its role in cancer［J］.Eur J Cancer，2005，41(16):2438-2448.

［13］LOU Z，O'REILLY S，LIANG H，et al.Down-regulation of over-expressed sp1 protein in human fibro sarcoma cell lines inhibits tumor formation［J］.Cancer Res，2005，65(3):1007-1017.

［14］ZAID A，LI R，LUCIAKOVA K，et al.On the role of the general transcription factor sp1 in the activation and repression of diverse mammalian oxidative phosphorylation genes［J］.J Bioenerg Biomembr，1999，31(2):129-135.

［15］OH J E，HAN J A，HWANG E S.Down-regulation of transcription factor，sp1，during cellular senescence［J］.Biochem Biophys Res Commun，2007，353:86-91.

［16］IHN H，IHN Y，TROJANOWSKA M.Sp1 phosphorylation induced by serum stimulates the human alpha2(Ⅰ)collagen gene expression［J］.J Invest Dermatol，2001，117(2):301-308.

［17］YOU H L，ENG H L，HSU S F，et al.A PKC-Sp1 signaling pathway induces early differentiation of human keratinocytes through up-regulation of TSGIO1［J］.Cell Signal，2007，19:1201-1211.

［18］LUDIWIG H，KHAYAT D，GIACCONE G，et al.Proteasome inhibition and its clinical prospects in the treatment of hematologic and solid malignancies［J］.Cancer，2005，104(9):1794-1807.