臭菘根部分離的一種酪氨酸酶抑制劑的研究

毛欣欣+張智文+李長田

摘要：目的：對(duì)臭菘根部中分離的一種化學(xué)成分的酪氨酸酶抑制活性進(jìn)行研究。方法：利用色譜柱分離純化再根據(jù)理化性質(zhì)和波譜技術(shù)對(duì)化合物進(jìn)行結(jié)果鑒定，采用酶動(dòng)力學(xué)方面對(duì)臭菘根部分離得到的化合物3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸其酪氨酸酶抑制研究。結(jié)果：從臭菘植物根部的甲醇部分分離的化合物3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸，對(duì)單酚酶（IC50=0.4毫摩爾/升）和二酚酶（IC50=0.25毫摩爾/升）都具有抑制作用。結(jié)論：從臭菘植物根部首次分離得到的化合物3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸為酪氨酸酶的競爭型可逆性抑制劑，抑制常數(shù)（KI）為3.0997 毫摩爾/升。

關(guān)鍵詞：臭菘;酪氨酸酶;抑制作用;動(dòng)力學(xué);3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸

中圖分類號(hào)：TQ464.8 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼： ?A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI編號(hào)： 10.14025/j.cnki.jlny.2014.24.0017

臭菘為天南星科（Araceae）臭菘屬（Symplocarpus）多年生宿根草本植物，分布于東西伯利亞鄂霍茨克、中國東北部、北美東部、朝鮮半島和日本，在中國主要分布于吉林省、黑龍江和烏蘇里江流域以及松花江流域[1-4]。

臭菘生長于海拔300米以下地區(qū)，常生于濕草甸、沼澤或沼澤落葉林中、潮濕針葉林及混交林下，河渠的水流中也有生長。據(jù)《中華本草》記載在藥理方面臭菘的根煎劑具有鎮(zhèn)靜、解痙和祛痰作用，解表止咳，化痰平喘，主治發(fā)燒頭痛、氣管炎咳喘等。臭菘葉主治風(fēng)濕痹痛，有祛風(fēng)除濕的功效。臭菘種子亦有鎮(zhèn)咳、祛痰、平喘、強(qiáng)心的藥效，主治氣管炎咳喘[5]。目前對(duì)臭菘的化學(xué)成分及其活性的研究報(bào)道很少，本實(shí)驗(yàn)從臭菘根部的甲醇部分得到1個(gè)化合物，經(jīng)波譜分析，鑒定其為3' 5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸（為該植物首次分離得到），由于其是肉桂酸類衍生物亦為羧基化合物，據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道此類化合物有對(duì)酪氨酸酶的抑制作用[6-8]，而作為酪氨酸酶的抑制劑，可作于防止食品褐變的添加劑、化妝品美白的功能成分以及農(nóng)業(yè)害蟲的調(diào)節(jié)劑等[9，10]。本文從酶動(dòng)力學(xué)角度分析了3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸的酪氨酸酶抑制活性，為臭菘植物作為天然產(chǎn)物的開發(fā)與利用提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)方法

1.1 儀器與材料

Varian Inova500型核磁共振儀，LCQ型質(zhì)譜儀，ZF-1型三用紫外分析儀，凝膠Sephadex LH-20，RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，TU-1810紫外分光光度計(jì)，GB204電子分析天平，GF254硅膠板、柱層析用硅膠均為青島海洋化工廠所產(chǎn)，L-酪氨酸（L-Tyrosine）、左旋多巴（L-DOPA）、酪氨酸酶均為SIGMA公司產(chǎn)品，其他藥品、試劑均為分析純。

臭菘[Symplocarpus foetidus （Linn.） Salisb.]采于吉林省臨江市老三隊(duì)地區(qū)（N：41.56.596°、41.94452°E：126.81072°、126.8019°H：370m、573m正西坡）。經(jīng)吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院胡全德教授和中藥材學(xué)院李長田副教授鑒定，所采植物樣品為臭菘屬（Symplocarpus）臭菘（S. foetidus）植物。

1.2 提取與分離

將臭菘晾干，取干根2公斤，用95%工業(yè)酒精60℃回流提取3次，合并提取液，解壓濃縮至浸膏無溶劑味，加水懸浮，分別用石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯各萃取3次，將萃取后的剩余部分用硅膠色譜柱、氯仿—甲醇系統(tǒng)進(jìn)行梯度洗脫，又經(jīng)凝膠純化和重結(jié)晶等分離手段得193.23毫克白色晶體化合物。

1.3 結(jié)構(gòu)鑒定

化合物為白色結(jié)晶（甲醇），1H NMR （300 MHz， DMSO）δ 12.29（s，1H）， 7.51（d，J = 15.9 Hz，1H），7.03（s， 2H），6.53（d，J = 15.9 Hz，1H），5.03（d，J = 7.4 Hz，3H）， 4.95（d，J = 17.3 Hz，2H），4.43（d，J = 25.4 Hz，1H），4.31（t， J = 5.3 Hz，1H），3.62 - 3.50（m，1H），3.40（dd，J = 11.4， 5.7 Hz，2H），3.19（s，2H），3.10（dd，J = 25.3，8.7 Hz，3H）。

13C NMR（101 MHz，DMSO）δ 167.55（C-1），118.36（C-2），143.87（C-3），129.59（C-1'），106.65（C-2'，C-6'）， 152.68（C-3'，C-5'），136.23（C-4'），102.23（C-1''），77.20（C-5''），76.55（C-3''），74.13（C-2''），69.91（C-4''），60.84（C-6''），56.45（C-OCH3×2），以上波譜數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)報(bào)道基本一致[11]，故鑒定此化合物為3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸。

1.4 化合物對(duì)酪氨酸酶的抑制測定

以1.2中分離得到的3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸（以下稱為抑制劑）作為待測樣品，測定其對(duì)酪氨酸酶的抑制作用。

酪氨酸酶的單酚酶活性測定： 將測單酚酶酶活力所用底物L(fēng)-Tyrosine置于恒溫水浴鍋中30℃水浴10分鐘后，向各比色皿中加入2.8毫升，繼而取配好的不同濃度（抑制劑濃度分別為0.75、0.5、0.4、0.3 和0.2毫摩爾/升）的待測抑制劑各0.1毫升于各比色皿中，對(duì)照皿中加入不含抑制劑的DMSO 0.1毫升，最后分別加入酪氨酸酶溶液0.1毫升（酪氨酸酶終濃度為13.37微克/毫升）快速混勻，紫外分光光度計(jì)475納米波長下測定吸光度（測定時(shí)溫度保持在30℃），每分鐘讀取記錄一次數(shù)據(jù)，連續(xù)測7分鐘。

酪氨酸酶的二酚酶活性測定：測定二酚酶活力方法同上所述，但所用底物L(fēng)-DOPA緩沖液，酪氨酸酶終濃度為6.67毫克/毫升。

抑制劑對(duì)酪氨酸酶的抑制可逆性測定：在測定活力的體系中，L-DOPA為固定底物，其濃度為0.5毫摩爾/升，向各比色皿中加入不同濃度的抑制劑（0.5、0.3、0.1和0.05毫摩爾/升），并改變所加入酶的濃度（1.66、2.66、4.44、6.66、8.88和13.37毫摩爾/升），測吸光度。

抑制劑對(duì)酪氨酸酶二酚酶活性抑制類型及抑制常數(shù)測定：將不同濃度的抑制劑（0.75、0.4、0.2和0.05毫摩爾/升）以及不含抑制劑的等體積DMSO加入含有不同濃度L-DOPA底物（0.5、0.25、0.33、0.66和1.0毫摩爾/升）的測酶活體系中，測吸光度。

2 結(jié)果與分析

如圖1所示，不同濃度的抑制劑對(duì)酪氨酸酶氧化L-Tyr的抑制效果，由圖1a中（曲線1）的發(fā)展走勢可以看到不含抑制劑的體系中L-Tyr的氧化有明顯延滯期。圖1a中2～7曲線顯示了所含不同濃度抑制劑（濃度從低到高）體系中的酪氨酸氧化的反應(yīng)過程，結(jié)合圖1b中所示的含不同濃度抑制劑各體系的反應(yīng)延滯時(shí)間和圖1c中顯示的穩(wěn)態(tài)期不同抑制劑對(duì)穩(wěn)態(tài)期酶活力的抑制情況，延滯時(shí)間不會(huì)隨著抑制劑濃度的增加而有所變化，而穩(wěn)態(tài)期系統(tǒng)中酶活力隨著抑制劑濃度的增加呈減低趨勢。濃度為0.75毫摩爾/升的抑制劑系統(tǒng)中的剩余酶活為30%，抑制劑濃度為0.2毫摩爾/升的系統(tǒng)中的為72%。抑制劑的半抑制濃度（IC50）為0.4毫摩爾/升。

b

圖1 化合物對(duì)單酚酶的抑制作用

（a）酪氨酸酶促反應(yīng)酪氨酸氧化的發(fā)展曲線，1～6化合物濃度依次為：0、0.2、0.3、0.4、0.5和0.75毫摩爾/升;（b）化合物對(duì)延滯時(shí)間的影響;（c）化合物對(duì)單酚酶穩(wěn)態(tài)活力的影響。

抑制劑抑制酪氨酸酶對(duì)L-DOPA的氧化活性，即對(duì)二酚酶的抑制效果試驗(yàn)，是用L-DOPA作為酪氨酸酶的底物的，二酚酶的反應(yīng)會(huì)立即達(dá)到穩(wěn)態(tài)期（沒有延滯時(shí)間）。由圖2中所示的結(jié)果可以看出，酪氨酸酶二酚酶的活力隨著抑制劑的劑量增加而減弱，且在0.4毫米以內(nèi)的抑制劑濃度有較為顯著的降低，降幅可達(dá)62%，而在抑制劑濃度為0.4～0.75 毫摩爾/升的范圍內(nèi)下降較緩，降幅為12.4%。估算出導(dǎo)致剩余酶活力失去50%的抑制劑濃度（IC50）為0.25毫摩爾/升。

（a）酪氨酸酶促反應(yīng)L-DOPA變化的發(fā)展曲線，1～6化合物濃度依次為：0、0.2、0.3、0.4、0.5、0.75毫摩爾/升;（b）化合物對(duì)二酚酶穩(wěn)態(tài)活力的影響。

從L-DOPA氧化的被抑制情況，來研究抑制劑對(duì)酪氨酸二酚酶的抑制機(jī)制。圖3所示，在含有抑制劑的系統(tǒng)中酶活力與酶濃度的關(guān)系，由于作用的抑制劑濃度的不同，在圖中給出了酶活力對(duì)酶濃度的一組全部通過原點(diǎn)的直線，抑制劑濃度的增加使得直線的斜率呈現(xiàn)下降的結(jié)果，表明抑制劑的存在不會(huì)使酶在總量上有所減少，而僅僅是減弱了酶的活力。

圖3 化合物對(duì)酪氨酸酶二酚酶的抑制機(jī)理，1～5化合物濃度分別為0、0.05、0.1、0.3、0.5毫摩爾/升

對(duì)L-DOPA氧化過程中的酪氨酸酶動(dòng)力行為進(jìn)行了研究。在本次研究中，酪氨酸酶參與催化的L-DOPA氧化反應(yīng)遵循著米氏動(dòng)力學(xué)。改變含有不同濃度抑制劑各體系中的反應(yīng)底物L(fēng)-DOPA的濃度，并測定各體系中L-DOPA氧化反應(yīng)的初速度。含抑制劑體系中酪氨酸酶的動(dòng)態(tài)研究如圖4所示的以Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，得到一組相同截距，且相交于縱坐標(biāo)軸（1/V），斜率不同的直線。由這種只使米氏常數(shù)（Km）增大，卻不會(huì)影響最大反應(yīng)速率（Vm）的情況，可以判斷該抑制劑對(duì)酪氨酸酶為競爭性抑制。出現(xiàn)這種競爭類型一般認(rèn)為是由于抑制劑與酶反應(yīng)底物具有相類似的結(jié)構(gòu)，其會(huì)與底物競爭酶活性中心的結(jié)合位點(diǎn)。競爭性抑制劑只能與游離酶（E）相結(jié)合，以與底物爭奪酶結(jié)合部位的方式，使酶活力呈現(xiàn)下降的結(jié)果，并不能酶—底物的復(fù)合物（ES）結(jié)合，底物量的增加會(huì)減少其與酶的幾率，而使它與酶結(jié)合產(chǎn)生的這種抑制作用減弱，直至消失。以圖4中各濃度抑制劑對(duì)應(yīng)的直線結(jié)合米氏方程計(jì)算出米氏常數(shù)（Km），以Km對(duì)抑制劑濃度作圖（圖4b），獲得一條斜率為3.0997的直線，進(jìn)而可知該抑制劑與酶結(jié)合時(shí)的平衡常數(shù)，即抑制常數(shù)（KI）為3.0997毫摩爾/升。

（a） Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖，直線1～5化合物濃度分別為0、0.05、0.2、0.4和0.75 毫摩爾/升。

（b） 直線的斜率對(duì)抑制劑濃度作圖

3 討論

酪氨酸酶以三種形式存在，氧化態(tài)（Eoxy）酪氨酸酶可以單酚或二酚結(jié)合與底物作用成為脫氧態(tài)（Emet）酶同時(shí)生成水和醌，脫氧態(tài)酶再與氧結(jié)合成為氧化態(tài)酶，而進(jìn)入循環(huán)，還原態(tài)酶（Edeoxy）則僅僅可以結(jié)合二酚卻不具有單酚酶活性。酪氨酸酶同時(shí)具有單酚酶活性和二酚酶活性，就是由于此三種形式酶的存在與轉(zhuǎn)化而表現(xiàn)出來的。本試驗(yàn)從臭菘植物中所提取的3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸是肉桂酸類衍生物亦為羧基化合物，同時(shí)具有抑制單酚酶和二酚酶活力的功能，且其所表現(xiàn)出的抑制活性為競爭性抑制。試驗(yàn)結(jié)果表明3'，5'-二甲氧基-4'-O-B-D-吡喃葡萄糖基桂皮酸對(duì)酪氨酸酶促反應(yīng)的延滯時(shí)間幾乎沒有影響，對(duì)二酚酶的抑制作用要好于對(duì)單酚酶的作用。該抑制劑濃度為0.75 毫摩爾/升時(shí)，單酚酶的剩余酶活為30%，而二酚酶的剩余酶活為25.6%。兩者的半抑制濃度（IC50）分別為0.4和0.25毫摩爾/升。文獻(xiàn)對(duì)肉桂酸及其衍生物對(duì)酪氨酸酶的抑制報(bào)道的不少，石艷、陳清西[12]等人研究了肉桂酸及其3個(gè)衍生物（2-羥基肉桂酸、4-羥基肉桂酸、4-甲氧基肉桂酸）對(duì)酪氨酸酶的抑制，研究發(fā)現(xiàn)，除2-羥基肉桂酸外，其余三者對(duì)二酚酶都有不同程度的抑制。龔盛昭等人對(duì)肉桂酸、對(duì)羥基肉桂酸以及肉桂酸甲酯抑制酪氨酸酶催化反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)研究中測得肉桂酸和肉桂酸甲酯均為為非競爭性抑制劑，肉桂酸對(duì)單酚酶和二酚酶抑制的IC50分別為0.37和0.61毫摩爾/升，抑制常數(shù)（KI）為0.68毫摩爾/升，肉桂酸甲酯抑制單酚酶和二酚酶的IC50為0.61和1.49 毫摩爾/升，其抑制常數(shù)為0.66毫摩爾/升，而對(duì)羥基肉桂酸對(duì)酪氨酸酶的抑制類型為混合型的，其單酚酶和二酚酶的IC50為0.12和0.50毫摩爾/升，對(duì)游離酶（E）和酶—底物絡(luò)合物（ES）的抑制常數(shù)分別為0.29和0.60毫摩爾/升[13-15]。

本研究中的抑制劑的IC50較上述的肉桂酸及其衍生物的都要低，且比熊果苷的（IC50=5.3毫摩爾/升）也要低很多，可被利用于酪氨酸酶抑制劑中，若將其產(chǎn)品化，還需對(duì)其進(jìn)行更深入的研究。

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作者簡介：毛欣欣，碩士，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，教師，研究方向：野生動(dòng)植物保護(hù)與利用。

通訊作者：張智文，碩士，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，教師，研究方向：天然藥物化學(xué)。

本研究中的抑制劑的IC50較上述的肉桂酸及其衍生物的都要低，且比熊果苷的（IC50=5.3毫摩爾/升）也要低很多，可被利用于酪氨酸酶抑制劑中，若將其產(chǎn)品化，還需對(duì)其進(jìn)行更深入的研究。

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作者簡介：毛欣欣，碩士，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，教師，研究方向：野生動(dòng)植物保護(hù)與利用。

通訊作者：張智文，碩士，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，教師，研究方向：天然藥物化學(xué)。

本研究中的抑制劑的IC50較上述的肉桂酸及其衍生物的都要低，且比熊果苷的（IC50=5.3毫摩爾/升）也要低很多，可被利用于酪氨酸酶抑制劑中，若將其產(chǎn)品化，還需對(duì)其進(jìn)行更深入的研究。

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作者簡介：毛欣欣，碩士，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，教師，研究方向：野生動(dòng)植物保護(hù)與利用。

通訊作者：張智文，碩士，吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)中藥材學(xué)院，教師，研究方向：天然藥物化學(xué)。