荔枝TPEC與龍眼EC的電融合參數(shù)研究

黃 淺，賴鐘雄，賴呈純，顧金玲，吳金壽

(1.福建農(nóng)林大學(xué)園藝植物生物工程研究所，福建福州350002;2.周口市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，河南周口466001)

原生質(zhì)體融合是生物技術(shù)育種的有效手段，通過原生質(zhì)體融合可克服遠(yuǎn)緣雜交有性配子的不親和性，創(chuàng)造出新的物種，解決生產(chǎn)上對(duì)新品種的不斷需求.近10年來，果樹原生質(zhì)體技術(shù)得到了較快的發(fā)展，在原生質(zhì)體融合方面，已有柑桔［1－8］、獼猴桃［9］、柿子［10］、野梨與櫻桃［11］、刺葡萄［12］等多種果樹獲得了種內(nèi)、種間、屬間的體細(xì)胞雜種或胞質(zhì)雜種，有的已開始實(shí)際應(yīng)用.1979年，Senda［13］建立的電融合法發(fā)展迅速，是目前最先進(jìn)的融合方法，至今已廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物及微生物細(xì)胞融合.目前通過電融合反復(fù)實(shí)驗(yàn)，已測(cè)出數(shù)十種植物原生質(zhì)體的電融合參數(shù)，如水稻、小麥、燕麥(Avena sativa L.)、馬鈴薯(Solanum tuberousm)、油菜(B.ctunpestris)、胡蘿卜(Daucus carota)、菜豆(Phaseolus vulgaris)、蠶豆、煙草、矮牽牛等，并成功獲得部分細(xì)胞雜種［14］.

荔枝、龍眼的原生質(zhì)體培養(yǎng)和電融合技術(shù)研究工作進(jìn)展緩慢，目前還處于原生質(zhì)體培養(yǎng)和再生階段，僅有少量基因型材料，如龍眼‘紅核子’品種、荔枝‘下番枝’品種成功獲得再生植株，關(guān)于荔枝、龍眼原生質(zhì)體電融合的研究報(bào)道較少.因此，本研究在建立的荔枝、龍眼原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)體系的基礎(chǔ)上［15－19］，以荔枝轉(zhuǎn)基因原生質(zhì)體再生的胚性愈傷組織(TPEC)細(xì)胞系和龍眼‘紅核子’品種的松散型胚性愈傷組織(EC)為材料，采用PA-4000電融合儀進(jìn)行原生質(zhì)體電融合條件研究，摸索適宜荔枝、龍眼原生質(zhì)體電融合參數(shù)，為實(shí)現(xiàn)龍眼、荔枝屬間全部或部分的近緣種屬的基因組轉(zhuǎn)移，從而為培育龍眼、荔枝新品種或新型水果開辟新途徑，并為進(jìn)行微原生質(zhì)體融合和不對(duì)稱原生質(zhì)體融合提供依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

研究材料為龍眼‘紅核子’品種的幼胚 EC，要求其在附加1.0 mg·L－12，4-D、0.5 mg·L－1KT、5.0 mg·L－1AgNO3繼代培養(yǎng)基培養(yǎng)15－17 d(圖1－A);荔枝“下番枝”品種的TPEC，要求其在附加1.0 mg·L－12，4-D液體培養(yǎng)基中懸浮培養(yǎng)約5 d(圖1－B).

圖1 荔枝TPEC和龍眼EC原生質(zhì)體分離材料Fig.1 Materials of isolated protoplast from litchi TPEC and longan EC

1.2 方法

1.2.1 龍眼、荔枝胚性愈傷組織的繼代與保持 龍眼EC用附加1.0 mg·L－12，4-D與附加1 mg·L－12，4-D、0.5 mg·L－1KT、5 mg·L－1AgNO3的2種MS培養(yǎng)基上交替繼代培養(yǎng)保持;荔枝胚性愈傷組織用附加1 mg·L－12，4-D 與附加1 mg·L－12，4-D、50 mg·L－1潮霉素的2種 MS培養(yǎng)基交替繼代培養(yǎng)保持.

1.2.2 荔枝TPEC懸浮細(xì)胞系的建立 參照賴鐘雄等［20］的方法，采用附加1 mg·L－12，4-D與附加1 mg·L－12，4-D、50 mg·L－1的液體培養(yǎng)基建立荔枝TPEC胚性懸浮細(xì)胞系.

1.2.3 原生質(zhì)體分離 龍眼胚性愈傷組織原生質(zhì)體分離參照賴鐘雄［16］的方法進(jìn)行.

荔枝TPEC懸浮細(xì)胞原生質(zhì)體分離是將在不含潮霉素的交替繼代培養(yǎng)基上懸浮培養(yǎng)6－8代5 d的懸浮細(xì)胞，用含纖維素和離析酶各1%的CPW-13M酶解液，在黑暗、25±2℃條件下，采用連續(xù)振蕩(30－40 r·min－1)酶解10 h進(jìn)行原生質(zhì)體分離.

1.2.4 原生質(zhì)體純化 分離原生質(zhì)體的純化采用過濾—離心法［21］.過濾網(wǎng)為孔徑40 μm尼龍網(wǎng)，洗滌液為 CPW-13 M，pH 值5.8.

1.2.5 荔枝、龍眼原生質(zhì)體電融合 (1)荔枝、龍眼原生質(zhì)體電融合參數(shù)的初步篩選:根據(jù)融合儀各個(gè)參數(shù)對(duì)原生質(zhì)體融合的影響，采用國(guó)產(chǎn)NCY-2型細(xì)胞融合儀篩選的參數(shù)進(jìn)行預(yù)試驗(yàn)［22］，設(shè)定基本參數(shù)體系，即交流電場(chǎng)(AC)強(qiáng)度50 V·cm－1，AC頻率1 MHz，AC作用時(shí)間60 s;直流脈沖(DC)振幅500 V·cm－1，DC 作用持續(xù)時(shí)間5 ms，DC 2 次，DC 間隔0.5 μs;原生質(zhì)體密度為5 ×105個(gè)·mL－1.

(2)荔枝、龍眼原生質(zhì)體電融合參數(shù)的設(shè)計(jì):原生質(zhì)體融合參數(shù)在融合儀允許的有效參數(shù)范圍內(nèi)進(jìn)行設(shè)計(jì).AC 頻率設(shè)計(jì)為 0.5、1.0、1.5、2.0 MHz;AC 強(qiáng)度設(shè)計(jì)為 20、40、50、60、70 V·cm－1;AC 作用時(shí)間設(shè)計(jì)為20、40、60、80、100 s;直流脈沖振幅設(shè)計(jì)為200、400、600、800 V;脈沖個(gè)數(shù)設(shè)計(jì)為 1、2、3、4、5 次;脈沖作用時(shí)間設(shè)計(jì)為 5、10、15、20 ms;脈沖間隔時(shí)間 0.125、0.25、0.5、1.0;融合液為融合儀專用融合液.單因素水平測(cè)定，即研究某一參數(shù)時(shí)，其他參數(shù)保持基本參數(shù)值不變，每個(gè)處理重復(fù)3次.

(3)荔枝、龍眼原生質(zhì)體電融合:電融合儀為“PA-4000”(Cyto Pulse Sciences，Inc.美國(guó)細(xì)胞波公司)，融合室為FP-C25/400(2.5 mm×2.0 mm)同心圓電極，將上述分離純化過的2種原生質(zhì)體以等體積混合后，吸取混合液均勻分布于環(huán)形槽中，室中央加少許融合液保濕，靜置5－10 min后選擇融合參數(shù)進(jìn)行融合試驗(yàn).原生質(zhì)體融合時(shí)，先固定交流電場(chǎng)(AC)頻率約1 MHz，逐漸升高調(diào)整AC電壓，待原生質(zhì)體排列呈串后，施加1－2次瞬時(shí)高壓直流脈沖(DC)，在60 s內(nèi)逐漸降低AC至0.融合過程用倒置顯微鏡觀察和照相，由于荔枝原生質(zhì)體明顯大于龍眼原生質(zhì)體，因而可以直接在倒置顯微鏡下觀察，觀察并記錄融合頻率(原生質(zhì)體融合頻率/%=視野中融合的原生質(zhì)體數(shù)/視野中原生質(zhì)體總數(shù)×100).

2 結(jié)果與分析

2.1 融合過程

荔枝與龍眼原生質(zhì)體電融合過程分兩步進(jìn)行，將經(jīng)分離、純化得到的龍眼、荔枝的原生質(zhì)體(圖2－A和圖2－B)的密度調(diào)整到5×105個(gè)·mL－1，按1∶1混合(圖2－C)后放入融合小室，在交變電場(chǎng)產(chǎn)生的雙向電泳和正負(fù)電極吸引力作用下，雙親原生質(zhì)體沿電場(chǎng)方向形成很多呈珍珠串的排列(圖2－D);然后施加一次或多次直流方形脈沖使相互接觸的原生質(zhì)體的質(zhì)膜發(fā)生可逆性電穿孔，原生質(zhì)體融合在一起(圖2－E－H)，在短時(shí)間內(nèi)融合體形成圓球形(圖2－I－J).

圖2 荔枝TPEC與龍眼EC原生質(zhì)體電融合過程Fig.2 Electrofusion process of protoplasts between longan EC and litchi TPEC

在融合過程中發(fā)現(xiàn)，交變電場(chǎng)的頻率和強(qiáng)度越大，形成的珍珠串越快.交變電場(chǎng)作用時(shí)間越長(zhǎng)，形成的珍珠串越長(zhǎng);直流脈沖電壓越大，多核體越多，對(duì)原生質(zhì)體的傷害越大，有時(shí)甚至造成不可逆擊穿，導(dǎo)致原生質(zhì)體碎裂;但如果直流脈沖電壓過小，使原生質(zhì)體之間不能發(fā)生質(zhì)膜擊穿，從而使原生質(zhì)體不能融合或很少融合在一起.因此，選擇適宜的電融合參數(shù)是十分必要的.

2.2 交流電場(chǎng)對(duì)原生質(zhì)體成串的影響

原生質(zhì)體在交流電場(chǎng)作用下，沿電場(chǎng)線方向泳動(dòng)，并相互吸引排列成串.只有當(dāng)原生質(zhì)體排列成串，并緊密地結(jié)合在一起的情況下再施加直流脈沖，原生質(zhì)體才能發(fā)生融合.交變電場(chǎng)是影響原生質(zhì)體成串、膜接觸的關(guān)鍵參數(shù)［23］.在原生質(zhì)體融合過程中發(fā)現(xiàn)，交變電場(chǎng)的頻率、強(qiáng)度、作用時(shí)間影響原生質(zhì)體成串的快慢及珍珠串的長(zhǎng)短.

2.2.1 交變電場(chǎng)頻率對(duì)原生質(zhì)體成串的影響 由表1可以看出，當(dāng)AC頻率為1.0 MHz時(shí)，細(xì)胞串多為兩個(gè)細(xì)胞的短串，多為一大一小的兩個(gè)細(xì)胞成串，并且排列整齊(圖3－A);當(dāng)AC頻率為1.5 MHz時(shí)，多為3－4個(gè)細(xì)胞排列成細(xì)胞串(圖3－B).當(dāng)AC頻率＞1.5 MHz時(shí)，原生質(zhì)體形成的珍珠串較長(zhǎng)(圖3－C).由此可見，當(dāng)交變電場(chǎng)頻率為1.0 MHz時(shí)，龍眼、荔枝原生質(zhì)體形成較為理想的細(xì)胞短串.

表1 交變電場(chǎng)頻率對(duì)原生質(zhì)體成串的影響1)Table 1 Effect of AC frequency on the pear lain of protoplasts

圖3 交流電場(chǎng)(AC)對(duì)原生質(zhì)體成串的影響Fig.3 The effect of AC on the pear lain of protoplasts

2.2.2 交變電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)原生質(zhì)體成串的影響 由表2可以看出，當(dāng)交變電場(chǎng)強(qiáng)度為50－60 V·cm－1時(shí)，原生質(zhì)體形成的兩細(xì)胞串較多，為理想的交變電場(chǎng)電壓(圖3－A).當(dāng)交變電場(chǎng)強(qiáng)度為20、30 V·cm－1時(shí)，細(xì)胞不能成串或較少成串(圖3－E)，這可能是由于在AC作用時(shí)間(60 s)一定的情況下，交變電場(chǎng)強(qiáng)度較低，原生質(zhì)體移動(dòng)較慢，導(dǎo)致細(xì)胞不能成串或成串的比率很低.隨著交變電壓升高，原生質(zhì)體在電場(chǎng)作用下移動(dòng)速度加快，細(xì)胞接觸的時(shí)間變短，成串的比率升高.當(dāng)AC強(qiáng)度為70 V·cm－1時(shí)，細(xì)胞成串較長(zhǎng)(圖3－D).由此可見，調(diào)整交變電場(chǎng)電壓對(duì)提高龍眼、荔枝原生質(zhì)體理想細(xì)胞串有明顯效果.

表2 交變電場(chǎng)強(qiáng)度對(duì)原生質(zhì)體成串狀況的影響1)Table 2 Effect of AC voltage on the pear lain of protoplasts

2.2.3 交變電場(chǎng)作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體成串的影響 交變電場(chǎng)作用時(shí)間是影響原生質(zhì)體成串長(zhǎng)短的另一個(gè)重要因素，其對(duì)荔枝、龍眼原生質(zhì)體成串的影響結(jié)果見表3.AC作用時(shí)間為60 s時(shí)，兩細(xì)胞串較多，排列整齊，是原生質(zhì)體成串比較理想的交流電場(chǎng)作用時(shí)間;交流電場(chǎng)作用時(shí)間過短，原生質(zhì)體不能成串(圖3－F);交流電場(chǎng)作用時(shí)間過長(zhǎng)，原生質(zhì)體形成的珍珠串太長(zhǎng).因此，將理想成串的AC作用時(shí)間選定為60 s.

表3 交變電場(chǎng)作用時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體成串的影響1)Table 3 Effect of AC duration on the pear lain of protoplasts

2.3 直流脈沖對(duì)原生質(zhì)體融合的影響

在電融合過程中，直流脈沖是決定原生質(zhì)體能否成功的關(guān)鍵因素.直流脈沖振幅、作用時(shí)間、脈沖次數(shù)及脈沖間隔共同影響原生質(zhì)體融合.

2.3.1 直流脈沖強(qiáng)度對(duì)原生質(zhì)體融合的影響 直流脈沖強(qiáng)度是影響原生質(zhì)體融合效果的另一個(gè)重要因素.本試驗(yàn)在AC強(qiáng)度為50 V·cm－1，AC頻率1.0 MHz，AC作用時(shí)間60 s;DC作用持續(xù)時(shí)間5 ms，脈沖2 次，DC 間隔0.5 μs;原生質(zhì)體密度為5 ×105個(gè)·mL－1的條件下，研究了不同直流脈沖強(qiáng)度對(duì)荔枝、龍眼原生質(zhì)體融合效果的影響，其結(jié)果見圖4.由圖4可以看出，當(dāng)脈沖強(qiáng)度為200 V·cm－1時(shí)，未能觀察到原生質(zhì)體融合;隨著脈沖強(qiáng)度的增加，原生質(zhì)體融合率逐漸升高，當(dāng)脈沖強(qiáng)度為600 V·cm－1時(shí)，融合率達(dá)到最高，為35.7%;當(dāng)脈沖強(qiáng)度增加到800 V·cm－1時(shí)原生質(zhì)體融合率下降.因此，將600 V·cm－1作為龍眼、荔枝原生質(zhì)體融合的適宜脈沖強(qiáng)度.

圖4 不同直流脈沖強(qiáng)度對(duì)融合率的影響Fig.4 Effect of different DC on the frequency of pair fusion

2.3.2 直流脈沖時(shí)間對(duì)原生質(zhì)體融合率的影響 在AC強(qiáng)度50 V·cm－1，AC頻率1.0 MHz，AC作用時(shí)間60 s;DC 作用持續(xù)時(shí)間5 ms，脈沖2次，DC 間隔0.5 μs;原生質(zhì)體密度5×105個(gè)·mL－1的條件下，研究了不同直流脈沖強(qiáng)度對(duì)荔枝、龍眼原生質(zhì)體融合效果的影響(圖5).

由圖5可以看出，龍眼、荔枝原生質(zhì)體在DC持續(xù)時(shí)間為5 ms時(shí)，融合率達(dá)到26.5%，脈沖持續(xù)時(shí)間為10 ms時(shí)融合率達(dá)到最大，為31.2%;隨著脈沖作用時(shí)間的延長(zhǎng)，原生質(zhì)體融合率逐漸下降，同時(shí)原生質(zhì)體會(huì)產(chǎn)生不可逆的破裂，多核融合體增加.因此，為了得到較理想的龍眼、荔枝一對(duì)一原生質(zhì)體融合，其脈沖持續(xù)時(shí)間確定為10 ms.

2.3.3 直流脈沖次數(shù)對(duì)原生質(zhì)體融合的影響 由圖6中可以看出，以脈沖2－3次的效果最好，原生質(zhì)體的融合率較高，融合率最高達(dá)33.8%.而脈沖4次以上的不僅沒能提高原生質(zhì)體的融合率，反而使一部分已形成的融合體破裂，從而使原生質(zhì)體的融合率下降，不利于融合后原生質(zhì)體的培養(yǎng).因此，龍眼、荔枝原生質(zhì)體電融合選定脈沖次數(shù)為2－3次.

圖5 直流脈沖作用時(shí)間對(duì)融合率的影響Fig.5 Effect of different DC time on the frequency of pair fusion

圖6 直流脈沖次數(shù)對(duì)原生質(zhì)體融合率的影響Fig.6 Effect of pulse on the fusion frequency of protoplasts

2.4 原生質(zhì)體密度對(duì)融合率的影響

原生質(zhì)體電融合率除了與交變電場(chǎng)、直流脈沖的相關(guān)參數(shù)有關(guān)外，與雙親混合后的原生質(zhì)體密度也有很大關(guān)系.在其他電融合參數(shù)一定的情況下，原生質(zhì)體密度較小時(shí)，原生質(zhì)體成串較慢，融合率較低;原生質(zhì)體密度較大時(shí)，原生質(zhì)體成串過長(zhǎng)，導(dǎo)致多細(xì)胞融合率升高，而理想融合率降低.由此可見，適宜的原生質(zhì)體密度也是原生質(zhì)體融合成功的關(guān)鍵因素.在龍眼、荔枝原生質(zhì)體融合研究過程中發(fā)現(xiàn)，在電融合參數(shù)篩選過程中，原生質(zhì)體密度為5×105個(gè)·mL－1時(shí)，原生質(zhì)體理想成串率、融合率都比較高.因此，本研究采用的原生質(zhì)體密度為5×105個(gè)·mL－1.

3 討論

原生質(zhì)體電融合參數(shù)的選擇是影響原生質(zhì)體融合頻率的關(guān)鍵因素之一［12］.近年來，已發(fā)表了數(shù)百篇關(guān)于電融合的基本化學(xué)機(jī)理及其在醫(yī)學(xué)、分子生物學(xué)、生物技術(shù)學(xué)方面應(yīng)用的科學(xué)論文.在不同研究中，由于所選用的細(xì)胞融合儀不一樣或者所利用的材料不同、材料的生理狀態(tài)不一樣，報(bào)道的參數(shù)也不一樣.AC強(qiáng)度、頻率以及AC作用時(shí)間直接影響到原生質(zhì)體的成串效果;DC強(qiáng)度、持續(xù)時(shí)間、次數(shù)及其脈沖時(shí)間間隔是影響原生質(zhì)體融合率的關(guān)鍵參數(shù).在本研究中，當(dāng)原生質(zhì)體密度為5×105個(gè)·mL－1時(shí)，交流電場(chǎng)的頻率和場(chǎng)強(qiáng)分別選用1.0 Mhz和50 V·cm－1，作用時(shí)間為60 s時(shí)，龍眼、荔枝的原生質(zhì)體能形成理想的珍珠串;當(dāng)直流脈沖強(qiáng)度為600 V·cm－1、脈沖持續(xù)時(shí)間為10 ms，脈沖2－3次時(shí)，能獲得較高的原生質(zhì)體融合頻率，最高能達(dá)到30%以上，這與賴鐘雄［22］報(bào)道的參數(shù)有所不同，融合率高于其采用CNY-2融合儀的融合率，可能是由于使用的儀器不同的原因.本研究的交流電壓的頻率與大多數(shù)柑桔［24］、刺葡萄［12］的原生質(zhì)體電融合時(shí)一致;交變電壓的強(qiáng)度低于胡家金等［25］在水稻與空心蓮子草，陳文品等［26］在小麥和黑麥，郭傳敏［27］在楊樹的原生質(zhì)體電融合中交流電場(chǎng)的電壓，但與不少柑桔原生質(zhì)體電融合中的交流電場(chǎng)強(qiáng)度相近，柑桔原生質(zhì)體電融合中的交流電場(chǎng)強(qiáng)度為75 V·cm－1［1，3］.本研究篩選的荔枝、龍眼原生質(zhì)體融合的 DC 電場(chǎng)相關(guān)參數(shù)與楊樹［27］、刺葡萄與玫瑰香［12］、柑桔［28］、普通小麥與黑麥草［26］、水稻與空心蓮子草［25］、煙草與構(gòu)祀屬［29］上所報(bào)道的不同.Harding et al［30］研究表明，最適的 DC 脈沖取決于所用的細(xì)胞系，直徑大的原生質(zhì)體要用弱電場(chǎng)，直徑小的原生質(zhì)體可以施以強(qiáng)電場(chǎng).由此可見，根據(jù)植物選擇原生質(zhì)體適宜的參數(shù)是電融合的技術(shù)關(guān)鍵.在原生質(zhì)體電融合研究中，應(yīng)在綜合考慮原生質(zhì)體的密度和電融合參數(shù)等因素對(duì)融合率影響的同時(shí)，還要考慮所研究的植物材料因素，以提高原生質(zhì)體的融合率.

荔枝、龍眼為近緣屬，是亞熱帶常綠喬木果樹，是我國(guó)南方的特產(chǎn)果樹.目前我國(guó)栽培的荔枝和龍眼(及其它木本果樹)品種大多數(shù)是通過實(shí)生選種、芽變選種以及常規(guī)的雜交育種等手段培育的，這些傳統(tǒng)的育種方法選育的品種有很大的局限性，使新品種培育進(jìn)展緩慢，難以培育出滿足消費(fèi)者和市場(chǎng)需求的優(yōu)質(zhì)品種，因此克服傳統(tǒng)育種中育種周期長(zhǎng)、有性雜交不親和的障礙是獲得荔枝、龍眼優(yōu)良品種的關(guān)鍵.植物原生質(zhì)體融合能通過一定技術(shù)轉(zhuǎn)移細(xì)胞核中的染色體組、染色體片段或細(xì)胞質(zhì)中的葉綠體DNA及線粒體DNA，同時(shí)又能克服有性雜交的障礙，擴(kuò)展可利用的基因資源，使融合細(xì)胞的遺傳物質(zhì)發(fā)生復(fù)雜重組，能夠改良品種或產(chǎn)生新物種.因此，育種學(xué)家將原生質(zhì)體融合與常規(guī)育種技術(shù)相結(jié)合，希望能夠?qū)崿F(xiàn)品種改良或獲得更為豐富的種質(zhì)資源［31，32］.隨著原生質(zhì)體培養(yǎng)技術(shù)的成熟，融合技術(shù)在研究和應(yīng)用方面得到了發(fā)展與完善，電融合技術(shù)取得了很大的進(jìn)展［2－8，33，34］.據(jù)報(bào)道，電融合誘導(dǎo)產(chǎn)生的原生質(zhì)體融合率比PEG誘導(dǎo)的高100倍，而且該法還具有操作簡(jiǎn)便，融合同步，不對(duì)細(xì)胞產(chǎn)生毒害作用的優(yōu)點(diǎn)，因而得到了普遍應(yīng)用［35－38］.本研究以荔枝TPEC懸浮培養(yǎng)系和龍眼松散型胚性愈傷組織為材料，采用PA-4000電融合儀進(jìn)行荔枝、龍眼原生質(zhì)體融合，對(duì)其電融合參數(shù)進(jìn)行了初步篩選，使融合率高達(dá)30%以上，初步建立了荔枝與龍眼原生質(zhì)體電融合的技術(shù)體系.另外，本研究經(jīng)過對(duì)電融合產(chǎn)物的初步培養(yǎng)，只得到多細(xì)胞團(tuán).因此，對(duì)荔枝TPEC與龍眼EC電融合產(chǎn)物的培養(yǎng)及其雜種的檢測(cè)還有待進(jìn)一步研究.

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