復方魚用中藥整腸顆粒的制備及其性能

孫 武，李宇翔，謝勇平，，黃志堅，李清祿，

(1.福建農(nóng)林大學生命科學學院;2.福建農(nóng)林大學食品科學學院;3.福建農(nóng)林大學動物藥物工程實驗室，福建福州350002)

伴隨著我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)的迅猛發(fā)展，水產(chǎn)養(yǎng)殖病害的發(fā)生與蔓延已成為制約漁業(yè)增效、漁民增收的關鍵問題，其中以細菌性、病毒性疾病最為嚴重［1］.如鰻魚、大黃魚、甲魚等各種腸炎，對蝦的爛鰓、白斑、紅體，甲魚的鰓腺炎、白底板，黃鱔的脫粘、紅頭和大頭病等病癥，導致養(yǎng)殖中所使用的魚用藥物的種類和數(shù)量不斷增多.然而抗生素、促生長劑和殺蟲藥等的大量使用帶來了藥物殘留大、抗藥性等問題［2］，危害人類健康，污染了環(huán)境，且效果不佳.因此無殘留、無污染的中藥制劑越來越受到重視，應用也日益廣泛.

中藥具有天然性、多功能性、無毒副、無殘留性和無抗藥性等諸多優(yōu)點，尤其是多成分協(xié)同作用和改善生態(tài)微環(huán)境作用［3］.將中藥用于預防和治療水產(chǎn)養(yǎng)殖疾病，對減少魚疾病，提高水產(chǎn)養(yǎng)殖經(jīng)濟效益具有重要意義，也將給我國水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)帶來深遠的影響［4］.然而，目前中藥散劑在水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)病害防治過程中存在的問題和不足也明顯地顯現(xiàn)出來，如臨床用藥效果緩慢、藥效不穩(wěn)定等.可能原因是由于魚類生理學上的特殊性，使藥物在腸道中的滯留時間相對較其他動物短，有效成分在動物體內(nèi)利用度很低，導致治療效果差;其次可能是中藥有效成分含量變化大，產(chǎn)品質量不可控制，藥效不穩(wěn)定.

中藥材浸(提)取液可從根本上克服中藥散劑的弊端.它通過各種現(xiàn)代浸(提)取技術將中藥材中的有效成分提取分離出來，再根據(jù)需要進行復配，融合了中藥組方和西藥有效成分的理論精髓，其有效成分吸收快速、完全、生物利用度高、療效快，完全可與西藥媲美.中藥顆粒劑就是以此為基礎形成的中藥制劑.中藥顆粒劑在人體上應用比較普遍，有較多的優(yōu)勢，但在魚用藥物方面的應用還很少，幾乎是空白.研究表明，由于中藥顆粒劑毒副作用小，既可治病又可作為飼料添加劑預防疾病，同時水溶性好，使用方便，是一種較為理想的魚用中藥制劑.

參照中獸醫(yī)理論和中藥使用的經(jīng)驗處方，復方魚用中藥整腸顆粒由黃柏、黃連、白頭翁和秦皮等中藥材組成.根據(jù)方中黃柏、黃連、白頭翁和秦皮的功效特點［5－11］組成方劑，有整腸洗腸、促進腸道蠕動、改善腸道微環(huán)境、消炎抗病毒的功效.由于方劑中鹽酸小檗堿是抑菌的主要活性成分，本試驗以鹽酸小檗堿為考察指標，研究黃柏、黃連、白頭翁和秦皮較佳的制備工藝和顆粒產(chǎn)品的穩(wěn)定性、安全性和臨床應用的有效性等性能，旨在為制定產(chǎn)品的質量標準和擴大中藥在水產(chǎn)養(yǎng)殖領域中的應用提供參考.

1 材料與方法

1.1 材料

中藥材黃柏、黃連、秦皮和白頭翁等均購于福建同春藥業(yè)有限公司.

菌株:腸型點狀氣單胞菌(Aeromonas punotata f.intestinalis)、溫和氣單胞菌(A.sobria)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)和嗜水氣單胞菌(A.hydrophila)，均來源于農(nóng)業(yè)部漁業(yè)動植物病原庫.

試劑有鹽酸小檗堿對照品(中國藥品生物制品檢定所)、乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)、超純水，其他試劑均為分析純.

主要儀器與設備有Waters Breeze 1525高效液相色譜儀(美國Waters公司)、KQ3200DE超聲波清洗器(蘇州昆山市超聲儀器有限公司)、BP211D電子天平(北京塞多利斯天平有限公司)、超凈臺、高壓滅菌鍋、培養(yǎng)箱等.

1.2 產(chǎn)品制備

1.2.1 水提工藝 將105 g白頭翁、150 g黃柏、60 g黃連和50 g秦皮4味藥材混合，根據(jù)4味藥材主成分均為水溶性的特點，提取工藝定為水提.經(jīng)正交試驗(略)得到最佳工藝為:將藥材混合加入約12倍的水煎煮2次，每次1 h，濾過.合并濾液并將其濃縮成稠浸膏(80℃熱測稠浸膏的比重為1.30－1.35)，備用.

1.2.2 顆粒制備 稱取80 g糖粉和80 g糊精倒入適當?shù)娜萜髦?，混合均勻，再加?40 g糖粉混合均勻.稱取65 g稠浸膏倒入上述輔料，攪拌均勻，調整軟材的軟硬度，然后擠壓過12目篩制成濕顆粒.

1.2.3 干燥、整粒 濕顆粒制成后，攤于潔凈的搪瓷盤中，放入烘箱于60－80℃鼓風干燥，直至顆粒含水量達5.0%以下，然后過12目和60目篩進行整粒、包裝.

1.3 鹽酸小檗堿含量的測定

按高效液相色譜(high performance liquid chromatogram，HPLC)法［12］測定.

1.3.1 色譜條件 固定相:C18 柱，4.6 mm ×250 mm，5 μm;流動相:乙腈∶水 =50∶50(1000 mL 溶液中含3.4 g磷酸二氫鉀和1.7 g十二烷基硫酸鈉)，使用前用0.45 μm濾膜抽濾，超聲脫氣30 min;檢測波長:346 nm;流速:1 mL·min－1;柱溫:30℃;理論塔板數(shù)按鹽酸小檗堿峰計算應不低于2500.

1.3.2 鹽酸小檗堿對照品和供試品溶液的制備 鹽酸小檗堿對照品溶液配成含鹽酸小檗堿50 μg·mL－1.

供試品溶液的配制:取復方魚用中藥整腸顆粒4 g，研細，過40目篩，精密稱取篩下物2 g，加入30 mL甲醇，超聲處理15 min，過濾，濾液用甲醇定容至50 mL容量瓶中.精密吸取2 mL置10 mL容量瓶中，加甲醇至刻度，即得.

1.3.3 樣品測定 將對照品溶液配成含鹽酸小檗堿含量分別為 0.0、5.0、10.0、15.0、20.0、25.0 和 30.0 μg·mL－1.分別吸取5 μL注入色譜儀，按“1.3.1”的色譜條件測定峰面積.以鹽酸小檗堿含量對峰面積進行回歸分析得回歸方程.參照對照品溶液測定的方法，取供試品溶液5 μL，進樣，記錄峰面積，采用回歸方程計算鹽酸小檗堿的含量.

1.3.4 含量測定方法的驗證 (1)精密度:精密吸取同一鹽酸小檗堿對照品溶液5 μL，重復進樣5針，記錄各進針的峰面積.

(2)穩(wěn)定性:精密吸取同一供試品溶液5 μL，分別于0、3、6、12、18和24 h各進樣1次，測定鹽酸小檗堿的峰面積.

(3)重現(xiàn)性:取同一生產(chǎn)批號的復方魚用中藥整腸顆粒6份，按“1.3.2”的方法制備樣品液6份，按“1.3.3”的方法測定樣品鹽酸小檗堿的含量.

(4)加樣回收率:稱取已知含量的復方魚用中藥整腸顆粒6份，每份2.0000 g，分別加入鹽酸小檗堿標準品1.00 mg，按“1.3.2”的方法進行樣品前處理.按“1.3.3”的方法測定樣品含量，計算回收率.

1.4 產(chǎn)品穩(wěn)定性檢測

1.4.1 光照試驗 取3批產(chǎn)品，去除外包裝直接倒入蒸發(fā)皿中，在(4500±500)lx強光下放置，5和10 d后取樣測定.

1.4.2 溫濕度加速試驗 取3批產(chǎn)品，按市售包裝，放置在(40±1)℃、相對濕度(75±5)%的條件下，每月取樣分析，連續(xù)6個月.

1.4.3 長期試驗 將3批產(chǎn)品放置于留樣觀察室內(nèi)，室溫下觀察2年，試驗期間分別于第3、6、9、12、15、18、21和24個月時觀察其性狀、鑒別、含量，并與0個月的數(shù)據(jù)相比較.

1.5 混飼喂服急性毒性的檢測

采用半靜水法進行.在水族箱中注入充分曝氣的自來水200 L，每個水族箱分別飼養(yǎng)日本鰻魚、甲魚、黃鱔和南美白對蝦20尾.將試驗藥物復方魚用中藥整腸顆粒溶解后均勻拌入飼料中，使藥物濃度分別為10、20和30 g·kg－1，同時設定空白對照.每個劑量組設兩個平行.試驗期4 d，投飼量按體重的3%計，每天1次.試驗期間觀察并記錄試驗對象攝食、活動和死亡情況.

1.6 對魚胃腸炎常見病原菌的抑制作用

1.6.1 培養(yǎng)基的配制 取10 g 蛋白胨、5 g 牛肉膏和5 g NaCl，加水至1000 mL，pH 7.2－7.4，于壓力1.05 kg·cm－2、121 ℃下滅菌20 min.

1.6.2 抑菌圈直徑的測定 采用平板擴散法將培養(yǎng)18 h的菌株用無菌水配制成約107cfu·mL－1的菌懸液，移取100 μL菌懸液至肉汁胨固體培養(yǎng)基上，涂布均勻，稍干后鑷取牛津杯放于接種過菌株的平皿培養(yǎng)基表面，滴加200 μL藥物，藥液濃度為1 mg·L－1，于28℃恒溫培養(yǎng)24 h后，用游標卡尺測量抑菌圈直徑.

1.6.3 最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentration，MIC)的測定 采用對倍稀釋法測定.供試藥液濃度配成 5、2.5、1.25、0.625、0.313 和 0.156 μg·mL－1.

1.7 對魚腸炎病治療效果的檢測

參照文獻［13］的方法進行.造模成功后藥物混飼喂服，飼料中的藥物濃度為3 g·kg－1，連續(xù)投喂5 d，之后投喂正常的飼料，同時設定不喂服藥物的對照.每組放草魚20尾.試驗期10 d.

2 結果與分析

2.1 樣品中鹽酸小檗堿含量的測定結果

對照品和樣品的HPLC色譜圖如圖1所示，雜峰不干擾鹽酸小檗堿吸收峰的測定.對照品含量測定的線性回歸方程:Y=35929X，R=0.9991.鹽酸小檗堿含量在5－30 μg·mL－1范圍內(nèi)呈良好的線性關系.方法精密度測定結果的RSD=0.368%;穩(wěn)定性測定結果的RSD=0.397%;重現(xiàn)性測定結果的RSD=3.39%;加樣回收率范圍為97.68%－99.36%，平均98.48%，RSD=0.75%(n=6).用該法測定復方魚用中藥整腸顆粒樣品6份，鹽酸小檗堿含量平均值為2.02 mg·g－1，RSD=3.38%，說明方法的可信度高.

圖1 復方魚用中藥整腸顆粒HPLC色譜圖Fig.1 HPLC chromatograms of compound Chinese medicinal bowel-care granule

2.2 產(chǎn)品穩(wěn)定性

對3批產(chǎn)品進行了光照試驗、加速試驗和溫室留樣觀察試驗，經(jīng)檢驗，性狀、鑒別、含量等各項指標均無明顯變化，說明本產(chǎn)品穩(wěn)定性較好.

2.3 急性毒性

復方魚用中藥整腸顆?；祜暦謩e喂服日本鰻魚、甲魚、黃鱔和南美白對蝦，結果表明，在設定的濃度范圍內(nèi)，日本鰻魚、甲魚、黃鱔和南美白對蝦均未出現(xiàn)死亡及其他異常癥狀.根據(jù)安全濃度=96 h LC50×0.1，計算復方魚用中藥整腸顆粒對日本鰻魚、甲魚、黃鱔和南美白對蝦的安全濃度均大于3 g·kg－1.

2.4 抑菌效果

從表1可以看出，1 mg·L－1復方魚用中藥整腸顆粒對腸型點狀氣單胞菌、鰻弧菌、溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌的平均抑菌圈直徑分別為 15.4、18.5、13.6 和 13.7 mm.

表1 復方魚用中藥整腸顆粒對4株病原菌的抑菌圈直徑Table 1 The antibacterial circle measurement of the bowel-care compound granules to 4 pathogenic strains

2.5 MIC 測定結果

復方魚用中藥整腸顆粒對腸型點狀氣單胞菌、鰻弧菌和嗜水氣單胞菌的MIC均為0.625 μg·mL－1，對溫和氣單胞菌的 MIC 為 1.25 μg·mL－1.

2.6 對魚腸炎病的治療效果

復方魚用中藥整腸顆粒經(jīng)混飼喂服(每公斤飼料添加3 g)給藥治療后，草魚腹部膨大、紅斑、肛門紅腫突出、離群獨游、不攝食和死魚等現(xiàn)象明顯減少，到第5天已無死亡個體，體色發(fā)黑的魚也已少見.藥物保護率見表2.3個試驗組的保護率分別為42.9%、35.7%和57.1%，藥物的平均保護率為45.2%.

表2 草魚的死亡率Table 2 The average mortality of grass carp

3 結論

復方魚用中藥整腸顆粒產(chǎn)品的最佳提取工藝流程是經(jīng)過正交試驗得出的，本文省略了該試驗過程.加速試驗和長期試驗的結果表明產(chǎn)品的穩(wěn)定性較好.采用HPLC法對復方魚用中藥整腸顆粒中鹽酸小檗堿的含量進行檢測，其精密度、穩(wěn)定性、重復性和加樣回收率均符合要求，可作為復方魚用中藥整腸顆粒質量標準制定的參考.

復方魚用中藥整腸顆粒對魚常見致病菌——腸型點狀氣單胞菌、鰻弧菌、溫和氣單胞菌和嗜水氣單胞菌有較好的抑制作用，混飼喂服對日本鰻魚、甲魚、黃鱔和南美白對蝦的安全濃度均大于3 g·kg－1，對胃腸炎病有一定的治療效果，可用于魚因細菌感染產(chǎn)生的急、慢性腸炎的治療.

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