超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法定性和高效液相色譜法定量分析天南星中氨基酸成分

王 星， 池玉梅 ， 康 安

（南京中醫(yī)藥大學(xué)，江蘇 南京210023）

隨著色譜-質(zhì)譜（LC-MS）聯(lián)用技術(shù)的日益發(fā)展，復(fù)雜中藥體系中的一些成分已實現(xiàn)了在線檢測與快速鑒別［1-3］。然而對于極性非紫外活性成分如含氨基、羧基類化合物的定性、定量分析方法的研究迄今報道尚少見。鑒于目前高效液相色譜法（HPLC）主要采用C18色譜柱進(jìn)行分離，為使化合物易于紫外或熒光檢測和具有質(zhì)譜解析的特征離子，并使化合物具有疏水性可在C18色譜柱上保留以便實現(xiàn)分離，本文擬采用柱前衍生化技術(shù)。

中藥材天南星為天南星科植物天南星（Arisaema erubescens （Wall.）Schott.）、異葉天南星（A.heterophyllum Blume.）、東北天南星（A. amurense Maxim.）的干燥塊莖，具有燥濕化痰、祛風(fēng)止痙、散結(jié)消腫之功效，臨床用于腫瘤治療，分析研究主要針對黃酮類及核苷類等具有紫外吸收的成分［4，5］。

異硫氰酸苯酯（PITC，C7H5NS）可與一級、二級氨基發(fā)生反應(yīng)，且反應(yīng)條件溫和、操作簡單、產(chǎn)物穩(wěn)定，故常作為氨基類成分定性、定量分析的衍生化試劑［5］。

本論文將以中藥材天南星為研究對象，以PITC為衍生化試劑，通過柱前衍生化，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（UHPLC-MS／MS）對天南星中氨基類成分的衍生化產(chǎn)物進(jìn)行分析，以期通過研究解析規(guī)律，為中藥成分快速鑒定開拓方法；并提供簡便快速的定量分析方法，為中藥質(zhì)量控制提供研究依據(jù)。

1 實驗部分

1.1 儀器與試藥

儀器:質(zhì)譜儀（Q-TOF 5600，美國AB 公司），配電噴霧離子源（ESI，美國AB 公司）；超高效液相色譜儀（日本島津公司），配PeakView 1.2 軟件；高效液相色譜儀（Waters Alliance 2695），配Waters 2489 紫外檢測器（美國Waters 公司）和Empower軟件。

試劑:PITC（標(biāo)示純度為98%，Aladdin 公司）；乙腈為色譜純；醋酸、醋酸銨、三乙胺皆為分析純。

氨基酸對照品:天冬氨酸（Asp）、谷氨酸（Glu）、絲氨酸（Ser）、甘氨酸（Gly）、組氨酸（His）、精氨酸（Arg）、蘇氨酸（Thr）、丙氨酸（Ala）、脯氨酸（Pro）、酪氨酸（Tyr）、纈氨酸（Val）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、苯丙氨酸（Phe）、色氨酸（Try）、賴氨酸（Lys），均來自BIO BASIC INC（含量＞98.5%）。

12 批天南星藥材經(jīng)南京中醫(yī)藥大學(xué)植物資源專家談獻(xiàn)和教授鑒定為正品，藥材來源及品種見表1。

表1 天南星藥材樣品Table 1 Rhizoma Arisaematis samples

1.2 分析條件

1.2.1 UHPLC 條件

［7］并經(jīng)優(yōu)化后確定的條件為:Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18色 譜 柱（100 mm × 2.1 mm，3.5 μm）；柱溫30 ℃；流動相A 為0.01% （v／v）甲酸水溶液，B 為乙腈；梯度洗脫條件:0 ～25min，5% B ～100% B；流速0.4 mL／min；進(jìn)樣量3 μL。

1.2.2 HPLC 條件

Diamonsil C18色譜柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；柱溫35 ℃；流動相A 為0.05 mol／L 醋酸銨-醋酸緩沖液（pH 6.5），B 為乙腈。梯度洗脫條件:0～15 min，3% B ～13% B；15 ～22 min，13% B ～17% B；22 ～25 min，17% B ～23% B；25 ～35 min，23% B ～25% B；35 ～45 min，25% B ～30% B；流速1.0 mL／min；檢測波長254 nm。進(jìn)樣量3 μL。

1.2.3 質(zhì)譜條件

參考文獻(xiàn)［8］并經(jīng)過優(yōu)化確定的條件為:電噴霧正離子模式（ESI＋）；掃描范圍m／z 100 ～1 500；噴霧電壓（IS）4500 V；去簇電壓（DP）70 V；碰撞能量（CE）25 V；輔助加熱溫度550 ℃；霧化氣壓強379 kPa；輔助加熱氣壓強379 kPa；氣簾氣壓強241 kPa。實驗數(shù)據(jù)采用PeakView 1.2 軟件處理，每3 h 對質(zhì)譜進(jìn)行校正，以保證質(zhì)量誤差在規(guī)定范圍內(nèi)。

1.3 溶液的制備

1.3.1 混合對照品溶液

15 種氨基酸各取適量，精密稱定，加0.1 mol／L鹽酸溶液，配成1 g／L 對照品儲備液，備用。

1.3.2 供試品溶液

取天南星藥材粉末約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入0.1 mol／L 鹽酸25 mL，稱重，超聲提取40 min，取出，冷卻后用0.1 mol／L 鹽酸補足重量，搖勻，濾過，取濾液即得。

1.4 衍生化方法

精密量取供試品溶液200 μL，置于1.5 mL 塑料管中，精密加入0.1 mol／L PITC-乙腈溶液50 μL、1 mol／L 三乙胺-乙腈溶液50 μL，渦旋混勻1 min，25 ℃下水浴1 h 后精密加入正己烷1 mL，渦旋混勻1 min，放置10 min，取下層溶液于13 000 r／min 高速離心10 min，取上清液［9，10］。

2 結(jié)果與討論

2.1 UHPLC-MS／MS 定性

2.1.1 分析條件的優(yōu)化

UHPLC 的流動相采用乙腈-水時，各色譜峰有不同程度的展寬及分叉現(xiàn)象，加入甲酸能明顯改善峰形，經(jīng)優(yōu)化確定采用乙腈-0.01% （v／v）甲酸水溶液作為流動相，20 min 內(nèi)線性梯度洗脫，可實現(xiàn)天南星中氨基類成分的分離。

比較電離方式，發(fā)現(xiàn)在正離子模式下能檢測到20 種氨基類化合物，并且各化合物的二級碎片較負(fù)離子模式下更便于結(jié)構(gòu)解析。因此，選擇正離子掃描方式進(jìn)行檢測，可以較全面地反映天南星中氨基類成分的化學(xué)信息。

優(yōu)化碰撞能量，在正離子模式下分別采用20、25、30、35 V，結(jié)果顯示當(dāng)碰撞能量升高時產(chǎn)生的碎片增多，但碎片離子峰的靈敏度降低；當(dāng)碰撞能量過低時則碎片信息減少。為兼顧靈敏度和碎片信息，本實驗選擇25 V 作為碰撞能量，在該條件下主要被分析物的分子離子均有一定的豐度且較穩(wěn)定，碎片離子信息也較豐富。

2.1.2 氨基類化合物-PITC 衍生物的特征

氨基類化合物-PITC 衍生物都具有離子碎片（C7H6NS＋，m／z 136），以其作為特征離子可易于進(jìn)行該類化合物的質(zhì)譜解析。圖1 為氨基類化合物與PITC 的反應(yīng)方程式。

圖1 氨基類化合物與異硫氰酸苯酯的衍生化反應(yīng)Fig.1 Derivatization reaction of amino compounds with PITC

2.1.3 定性結(jié)果

采用LC-MS／MS 分析天南星提取物的PITC 衍生化產(chǎn)物，解析分析結(jié)果。首先，運用未知化合物篩查軟件（IDA）檢索含有m／z 136 碎片離子的化合物，結(jié)果見圖2；然后，提取上述含m／z 136 碎片離子化合物的二級質(zhì)譜圖及選擇離子色譜圖，利用飛行時間質(zhì)譜能夠得到精確質(zhì)量數(shù)的特點，根據(jù)各化合物的質(zhì)荷比，利用PeakView 檢索元素組成，采用測得的離子質(zhì)量數(shù)與計算質(zhì)量數(shù)相對誤差較小的原則，結(jié)合考慮氨基類成分-PITC 衍生物的特征，可以得到各化合物化學(xué)式；第三，利用PeakView-［XIC Manager］軟件對推測得到的化合物進(jìn)行匹配；第四，進(jìn)一步分析二級碎片，推測化合物的結(jié)構(gòu)；第五，運用對照品確證鑒定結(jié)果。以表2 中4 號與11 號為例:經(jīng)IDA 檢索得到其m／z 分別為241.064 3、317.096 0，其 化 學(xué) 式 分 別 為 C10H12N2SO3、C16H16N2SO3，選擇離子色譜圖及二級質(zhì)譜碎片圖如圖3 所示；進(jìn)一步分析二級碎片，發(fā)現(xiàn)分別具有易中性丟失H2O、CO 碎片，應(yīng)為含有羧基的氨基類成分，推測為絲氨酸和酪氨酸的PITC 衍生物。氨基酸-PITC 衍生物相關(guān)裂解方式如圖4 所示；依此解析，扣除陰性對照與試劑空白，推測了18 個氨基酸、2 個胺類化合物，結(jié)果見表2（化學(xué)式均為衍生物的［M ＋H］＋），并用對照品對其中16 個氨基酸進(jìn)行了驗證。與文獻(xiàn)報道［7，8］相比，本文建立的方法，將中藥材提取物經(jīng)PITC 柱前衍生化，通過對衍生化產(chǎn)物裂解規(guī)律的探討，以引入的衍生化試劑C7H6NS＋（m／z 136）作為特征離子，進(jìn)行系統(tǒng)性篩查，可使分析過程更加快速準(zhǔn)確，簡便。

圖2 天南星提取物-PITC 衍生物二級質(zhì)譜碎片m／z 136 的選擇離子色譜圖Fig.2 Extracted ion chromatogram of m／z 136 from MS／MS in the extract of Rhizoma Arisaematis derivatized with PITC

表2 天南星提取物-PITC 衍生物的UHPLC-MS／MS 解析結(jié)果Table 2 Identification results of extracts of Rhizoma Arisaematis after derivatization with PITC by UHPLC-MS／MS

圖3 表2 中（a）4 號和（b）11 號的選擇離子色譜圖及二級質(zhì)譜碎片圖Fig.3 Extracted ion chromatograms and MS／MS spectra of （a）No. 4 and （b）No. 11 in Table 2

圖4 氨基酸-PITC 衍生物質(zhì)譜裂解方式Fig.4 Illustration of pyrolysis ways of amino acid-PITC derivatives

2.2 HPLC 定量

2.2.1 HPLC 條件的優(yōu)化

由于氨基酸為兩性物質(zhì)，緩沖液pH 會影響到不同氨基酸的離解程度，從而影響氨基酸的保留值，故對溶液pH 進(jìn)行了考察。根據(jù)文獻(xiàn)［11，12］和色譜條件優(yōu)化的結(jié)果，本文選用醋酸銨-醋酸（pH 6.5）梯度洗脫的方法，可使15 種氨基酸很好地分離。

2.2.2 衍生化條件的優(yōu)化

PITC 與氨基類成分反應(yīng)產(chǎn)率隨衍生化試劑用量、三乙胺用量、反應(yīng)時間和溫度的不同而有明顯的差異［13］。優(yōu)化結(jié)果顯示當(dāng)PITC、三乙胺均為50 μL、反應(yīng)溫度為25 ℃、反應(yīng)時間為60 min 時各氨基酸衍生化后色譜峰面積趨于穩(wěn)定（見圖5）。

2.2.3 專屬性試驗

圖5 衍生反應(yīng)條件的優(yōu)化Fig.5 Optimization of derivatization conditions

取衍生化后的混合對照品溶液、供試品溶液及空白溶液，按所建立的色譜條件進(jìn)行測定，15 種氨基酸色譜峰分離度均大于1.5，理論塔板數(shù)均大于5 000，空白溶液無干擾（見圖6）。圖6 中14 號峰為苯丙氨酸，15 號峰為試劑空白的色譜峰，由于在現(xiàn)有色譜條件下沒能達(dá)到基線分離，故放棄了苯丙氨酸的定量。天冬酰胺、蛋氨酸含量過低，也未定量。

2.2.4 線性方程及檢出限

以氨基酸溶液的質(zhì)量濃度X（mg／L）為橫坐標(biāo)，峰面積Y（V·s）為縱坐標(biāo)，得到15 個氨基酸的回歸方程。谷氨酸、色氨酸在2 ～100 mg／L、精氨酸在6 ～300 mg／L、其余各氨基酸在0.8 ～40 mg／L 范圍內(nèi)均呈良好的線性關(guān)系（r ＝0.999 5 ～0.999 9）。將最低濃度混合對照品溶液逐步稀釋，進(jìn)樣分析，以S／N ＝3 確定檢出限（LOD），結(jié)果見表3。

表3 線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍及檢出限Table 3 Regression equations，correlation coefficients（r），linear ranges and limits of detection（LODs）

2.2.5 精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性、回收率試驗

按2010 版《中國藥典》附錄HPLC 法指導(dǎo)原則考察精密度和重復(fù)性，RSD 均小于3%；供試品溶液在18 h 內(nèi)基本穩(wěn)定；15 種氨基酸平均回收率在95% ～105% 之間，RSD 均小于3%。結(jié)果表明符合含量測定方法學(xué)要求。

2.2.6 樣品測定

天南星藥材12 批（見表1），每批平行3 份，制備供試品溶液并衍生化，以建立的HPLC 方法測定含量，RSD 均小于3%，符合2010 版《中國藥典》含量測定要求；12 批藥材中15 種氨基酸含量的RSD 在32% ～118% 之間，表明各批次藥材間氨基酸含量差異較大，該差異性原因有待進(jìn)一步研究（見表4）。

圖6 （a）對照品溶液、（b）供試品溶液及（c）空白溶液的高效液相色譜圖Fig.6 HPLC chromatograms of（a）reference substance solution，（b）sample solution and（c）blank solution

3 結(jié)論

本文應(yīng)用PITC 作為衍生化試劑進(jìn)行柱前衍生化，使天南星藥材中的氨基酸及氨基類成分在C18色譜柱上實現(xiàn)了分離，并為UHPLC-MS／MS 解析提供了特征離子碎片，為HPLC 分析實現(xiàn)了紫外檢測。實驗結(jié)果顯示，方法簡單、靈敏、準(zhǔn)確，具有良好的重復(fù)性和穩(wěn)定性，為中藥中相應(yīng)成分的分析提供了思路。

但本文未能檢測到藥材中小肽類成分，同時對同分異構(gòu)體的檢測仍存在缺陷，如經(jīng)衍生化后的亮氨酸、異亮氨酸，其選擇離子色譜圖與二級碎片都未能實現(xiàn)分辨。因此將繼續(xù)開發(fā)新的化學(xué)試劑和新方法，以簡化衍生化步驟，加快衍生反應(yīng)速度和選擇性，提高試劑及衍生產(chǎn)物的穩(wěn)定性，使之容易色譜分離，以便實現(xiàn)極性非紫外活性成分的分析。

參考文獻(xiàn)：

［1］ Zhou G F，Lü G Y. Chinese Pharmaceutical Journal （周桂芬，呂圭源. 中國藥學(xué)雜志），2012，47（1）:13

［2］ Zhou A，Sun X J，Wu H，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （周安，孫曉娟，吳虹，等. 分析化學(xué)），2012，40（4）:612

［3］ Cao Y，Liang Q L，Zhang H Y，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry （曹陽，梁瓊麟，章弘揚，等. 分析化學(xué)），2008，36（1）:39

［4］ Luo F，Lu D，Chi Y M，et al. China Journal of Chinese Materia Medica （羅芬，陸丹，池玉梅，等. 中國中藥雜志），2011，36（23）:3302

［5］ Du S S，Zhang W S，Xu Y C，et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis （杜樹山，張文生，徐艷春，等. 藥物分析雜志），2002，22（6）:440

［6］ Wang X Z，Wang Q Q，Song H F，et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis （王秀中，王清清，宋海峰，等. 藥物分析雜志），2010，30（6）:1162

［7］ Kong X H，F(xiàn)u X L，Zhang L，et al. Journal of Instrumental Analysis （孔祥虹，付興隆，張磊，等. 分析測試學(xué)報），2010，29（4）:347

［8］ Li P F，Tao B B，Zhang X D，et al. Chinese Journal of Analytical Chemistry（李鵬飛，陶蓓蓓，張緒得，等. 分析化學(xué)），2013，41（9）:1347

［9］ Zhao D S，Ma X L，Li X X，et al. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis （趙東升，馬曉麗，李新霞，等. 藥物分析雜志），2013，33（6）:963

［10］ Gao X Y，Su J K，Wang X，et al. Journal of Beijing University of Traditional Chinese Medicine （高曉燕，蘇建坤，王雪，等. 北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報），2012，35（8）:554

［11］ Sun Y C，Xu X Z，Xu Y L，et al. Chinese Journal of Chromatography （孫言春，許憲祝，徐衍嶺，等. 色譜），2013，31（3）:275

［12］ Wang J，Bi K S. Chinese Traditional and Herbal Drugs （王棘，畢開順. 中草藥），2008，39（7）:1027

［13］ Tu C Y，Ge J L，Wu Y J，et al. Journal of Instrumental Analysis （屠春燕，葛佳璐，吳燕嬌，等. 分析測試學(xué)報），2008，27（7）:681