高效液相色譜法測(cè)定糕點(diǎn)中的檸檬黃、日落黃

劉芳

(北京市昌平區(qū)質(zhì)量技術(shù)監(jiān)督局，北京 102200)

近年來(lái)，檸檬黃、日落黃等色素超標(biāo)而導(dǎo)致食品被禁止銷(xiāo)售在國(guó)內(nèi)外屢次出現(xiàn)，成為食品不合格的重要因素之一。合成色素有一定毒性，食用過(guò)多會(huì)危害人體健康［1］。我國(guó)衛(wèi)生部發(fā)布的GB 2760-2011《食品添加劑使用衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定糕點(diǎn)中不得檢出檸檬黃、日落黃［2］。

目前，國(guó)標(biāo)方法［3］的樣品處理步驟較為繁瑣，所用試劑有強(qiáng)烈的刺激性氣味，而且糕點(diǎn)樣品的抽濾通常十分困難，同時(shí)國(guó)標(biāo)方法采用的流動(dòng)相和測(cè)定波長(zhǎng)容易使目標(biāo)峰受到雜質(zhì)干擾。通過(guò)查閱資料及多次分析實(shí)驗(yàn)，采用水浴浸提的方法提取糕點(diǎn)中的檸檬黃、日落黃，采用離心取上清液的方法凈化樣品［4］，并改變了流動(dòng)相的梯度淋洗比例和測(cè)定波長(zhǎng)，簡(jiǎn)化了分析步驟，避免了雜質(zhì)干擾，提高了檢測(cè)靈敏度，獲得了較為滿(mǎn)意的回收率。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 主要儀器與試劑

高效液相色譜儀：Agilent 1200型，美國(guó)安捷倫公司；

快速混勻器：GL-88B型，海門(mén)麒麟醫(yī)用儀器廠；

恒溫水浴鍋：XMTD-4000型，北京君豪科技發(fā)展有限公司；

高速離心機(jī)：3K30型，博勵(lì)行儀器有限公司；

檸檬黃標(biāo)準(zhǔn)溶液［GBW(E) 100001a］：500 mg／L，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液［GBW(E) 100003a］：500 mg／L，中國(guó)計(jì)量科學(xué)研究院；

甲醇：色譜純，美國(guó)Fisher Scientifi c公司；

乙酸銨：分析純，廣東汕頭市西隴化工廠；

實(shí)驗(yàn)室用水經(jīng)Millipore超純水系統(tǒng)純化。

1.2 色譜條件：

色 譜 柱：Agilent C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；紫外檢測(cè)器；檢測(cè)波長(zhǎng)：檸檬黃為430 nm,日落黃為482 nm；柱溫：40℃；流動(dòng)相：A為甲醇，B為0.02 mol／L乙酸銨溶液，流量為1.0 mL／min；梯度洗脫程序：0～7 min時(shí)15% A+85% B，7～14 min時(shí)40% A+60% B，14～16 min時(shí)15% A+85% B；進(jìn)樣量：10 μL；

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

稱(chēng)取5.00 g粉碎均勻的樣品于100 mL比色管中，加入50 mL水，于快速混勻器中渦旋混勻，然后于60℃水浴1 h，期間顛倒混勻幾次，浸泡放置過(guò)夜，取上清液以4 000 r／min離心5 min，用帶針注射器吸取上清液供測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)外標(biāo)法定量。

1.4 色譜圖

按照1.2色譜條件測(cè)定樣品溶液，色譜圖見(jiàn)圖1。由圖1可知，在改變了流動(dòng)相梯度淋洗比例和變換測(cè)定波長(zhǎng)后，延緩了目標(biāo)峰的出峰時(shí)間，可避免樣品中雜質(zhì)峰的干擾，有較高的靈敏度。

圖1 檸檬黃、日落黃樣品色譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 樣品處理方法

使用高效液相色譜儀測(cè)定食品中的著色劑，國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法中的聚酰胺吸附法［3］依據(jù)水溶性酸性色素在酸性條件下被聚酰胺吸附，然后在堿性條件下解吸附［5］，但利用甲醇-甲酸(60∶40)的混合液洗脫天然色素和其它雜質(zhì)時(shí)會(huì)造成合成著色劑損失，而且糕點(diǎn)樣品在使用G3垂融漏斗抽濾時(shí)通常十分困難。筆者曾采用乙醇-氨水直接提取色素或用濾紙及布氏漏斗代替G3垂融漏斗等多種方法嘗試，均未得到滿(mǎn)意結(jié)果。通過(guò)查閱資料及多次分析實(shí)驗(yàn)，依據(jù)檸檬黃、日落黃為水溶性色素，與其它溶劑相比它們?cè)谒械娜芙舛茸畲螅?］，且其溶解度隨溫度升高而增大，二者耐熱性較強(qiáng)［7］，參考國(guó)標(biāo)方法的水浴溫度，采用水浴浸提的方法提取糕點(diǎn)中的檸檬黃、日落黃，得到滿(mǎn)意效果。

由于糕點(diǎn)成分復(fù)雜，加標(biāo)后的樣品有的很容易就可以將色素提取到水中，如月餅、麻花；而有的樣品則較困難，如面包、餅干；但經(jīng)過(guò)渦漩混勻、水浴加熱及浸泡過(guò)夜后，均可獲得較高的回收率。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)用0.45 μm濾膜過(guò)濾會(huì)造成色素較大損失，所以采用離心的方法，取上清液測(cè)試［4］，雖然溶液下層殘?jiān)腥杂猩倭恐珓┪?，但和?.45 μm濾膜過(guò)濾相比損失較小。離心可以使雜質(zhì)等顆粒物質(zhì)沉淀，盡可能達(dá)到去除此類(lèi)物質(zhì)的目的。離心后，糕點(diǎn)中的油脂會(huì)漂浮于液面上層，這一小部分油脂對(duì)于檢測(cè)沒(méi)有太大影響，但對(duì)色譜柱污染較大，如果使用吸附劑或?qū)游鎏盍蟿t會(huì)造成著色劑提取損失，所以使用一次性帶針注射器穿過(guò)油脂吸取中間水層，這樣可使油脂的殘留很小。

如果浸提用水偏酸性，則有可能產(chǎn)生色素酸沉淀，給檢測(cè)帶來(lái)影響，所以提取過(guò)程中使用中性水。

2.2 儀器條件優(yōu)化

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)方法所采用的254 nm波長(zhǎng)雖然能夠同時(shí)對(duì)多種色素進(jìn)行測(cè)定，但是干擾物質(zhì)較多，尤其檸檬黃出峰時(shí)間較早，易與樣品干擾峰疊加。所以改變甲醇、乙酸銨溶液的梯度淋洗比例，并采用檸檬黃、日落黃有最大吸收波長(zhǎng)的430 nm和482 nm［7-8］測(cè)定。

2.3 線(xiàn)性方程與檢出限

分別準(zhǔn)確吸取500 mg／L檸檬黃、日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.5，1.0，2.0，4.0 mL，用水定容至100 mL，配制成質(zhì)量濃度為0，2.5，5.0，10.0，20.0 mg／L的檸檬黃、日落黃系列混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液，按1.2色譜條件測(cè)定，以質(zhì)量濃度X為橫坐標(biāo)、峰面積Y為縱坐標(biāo)進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得檸檬黃線(xiàn)性方程為Y=31.067X+4.848 2，r2=0.999 7，日落黃線(xiàn)性方程為Y=32.01 9X+0.829 7，r2=0.999 9。

按3倍信噪比計(jì)算檢出限，得到檸檬黃檢出限為0.4 mg／kg，日落黃檢出限為0.3 mg／kg。

2.4 精密度試驗(yàn)

取同一批樣品加入標(biāo)檸檬黃、日落黃標(biāo)準(zhǔn)混合液，按1.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表1。

表1 精密度試驗(yàn)結(jié)果

由表1可知，檸檬黃、日落黃測(cè)定結(jié)果的相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為4.8%，3.7%，說(shuō)明方法的精密度良好。

2.5 回收試驗(yàn)

吸取適量檸檬黃、日落黃標(biāo)準(zhǔn)溶液加入糕點(diǎn)樣品中，按1.2色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，檸檬黃的回收率為72.5%～77.2%，日落黃的回收率為73.2%～82.0%，說(shuō)明該方法的準(zhǔn)確度較高。

表2 回收試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

建立了糕點(diǎn)中檸檬黃、日落黃的高效液相色譜分析方法。本方法樣品處理簡(jiǎn)單，避免了雜質(zhì)干擾，提高了靈敏度，可以滿(mǎn)足糕點(diǎn)中檸檬黃、日落黃的測(cè)定要求。

［1］米爾芳，王彩云，趙霞，等.可見(jiàn)光區(qū)多種波長(zhǎng)梯度洗脫同時(shí)測(cè)定六種色素的方法研究［J］.實(shí)用醫(yī)技雜志，2009，16(6): 489-490.

［2］GB 2760-2011 糕點(diǎn)中檸檬黃、日落黃的限量［S］.

［3］GB／T 5009.35-2003 食品中合成著色劑的測(cè)定［S］.

［4］鄢兵，龍洲雄，萬(wàn)春花，等. HPLC法同時(shí)測(cè)定飲料中檸檬黃和日落黃［J］.現(xiàn)代測(cè)量與實(shí)驗(yàn)室管理，2007(4): 14-14.

［5］徐春祥，王峰，趙維佳.高效液相色譜法測(cè)定火腿腸中的誘惑紅［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2005，14(1): 12-13，55.

［6］管敏婭，張立義.食品中5種合成食用色素高效液相色譜檢測(cè)方法的探討［J］.中國(guó)衛(wèi)生檢驗(yàn)雜志，2008，18(6): 1 105-1 106.

［7］馮慧，梅利華，謝繼安.高效液相色譜檢測(cè)蜜餞中合成色素的最佳測(cè)定波長(zhǎng)研究［J］.中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng)，2007(9): 39-41.

［8］程小會(huì)，鄧敬頌.液相色譜法測(cè)定果蔬汁中檸檬黃和日落黃方法優(yōu)化［J］.化學(xué)分析計(jì)量，2010，19(2): 70-71.